DE1124945B

DE1124945B - Verfahren zur Herstellung von 9ª‡-Oxysteroiden der Pregnanreihe

Info

Publication number: DE1124945B
Application number: DEU6604A
Authority: DE
Inventors: Arthur Raymond Hanze; Herbert Charles Murray; Oldrich Karel Sebek
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1958-11-14
Filing date: 1959-10-28
Publication date: 1962-03-08

Description

Verfahren zur Herstellung von 9 a-Oxysteroiden der Pregnanreihe Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 9a-Oxysteroiden der allgemeinen Formel in der R Wasserstoff oder den Acetylrest bedeutet, durch mikrobiologische Oxydation von l Iß,21-Dioxy-4,17(20)-pregnadien-3-on oder dessen 21-Estern mit einem Fungus der Gattung Cunninghamella oder Helicostylum und gegebenenfalls nachfolgende Acetylierung der 21-ständigen Hydroxylgruppe. Der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Ausgangsstoff ist nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2844604 erhältlich.
Die Produkte des vorliegenden Verfahrens können durch oxydative Hydroxylierung in 9a-Oxycortison bzw. dessen Acetat umgewandelt werden, das physiologische Wirksamkeit besitzt. Ferner können sie nach bekannten Methoden in therapeutisch verwendbare Verbindungen der Progesteronreihe übergeführt werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten, die Oxydation bewirkenden Fungi sind Species der Gattung Cunninghamella, die der Familie der Choajephoraceae und der Ordnung Mucorales angehören, bzw. Species der Gattung Helicostylum, die der Familie Thamnidiaceae und ebenfalls der Ordnung Mucorales zugerechnet werden. Diese Gattungen sind wohl identifiziert. Typische Species sind von Kultursammlungsinstituten, z. B. der American Type Culture Collection, erhältlich. Zu den Pilzarten, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen, gehören insbesondere C. blakesleeana, C. elegans, C. verticullata, C. echinulata, C. bertholletiae und H. piriforme.
Die Verwendung dieser Fungi zur mikrobiologischen Umwandlung bestimmter Steroide ist bereits bekannt. In der USA.-Patentschrift 2 602 769 ist die Hydroxylierung eines 11-Methylensteroids mit Cunninghamella blakesleeana und in der USA.-Patentschrift 2 812 286 die 11,x-Hydroxylierung von 11-Methylensteroiden mit Cunninghamella echinulata beschrieben. Die B-und 14-Hydroxylierung eines 11-Methylensteroids mit Helicostylum piriforme ist den USA.-Patentschriften 2703806, 2602769 und 2670358 zu entnehmen. Die 9-Hydroxylierung von 11-Oxysteroiden mit Fungi der oben beschriebenen Art war bis jetzt jedoch nicht bekannt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von Zwischenprodukten zur Herstellung von 9a-Oxycortison und dessen 21-Estern, ohne daß als Zwischenprodukt das verhältnismäßig kostspielige Hydrocortisonacetat verwendet werden muß. Statt dessen kann l1ß,21-Dioxy-4,17(20)-pregnadien-3-on und seine Ester, die nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2 894 604 leicht aus Progesteron erhältlich sind, als Ausgangsstoff benutzt werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Steroidsubstrat, das im wesentlichen frei von 11-Methylensteroid ist, der Einwirkung einer Pilzkultur der Gattung Cunninghamella oder Helicostylum oder den von ihnen erzeugten, oxydierend wirkenden Enzymen ausgesetzt, vorzugsweise unter aeroben, submersen Bedingungen, wobei gut durchgemischt wird. Das Nährmedium enthält assimilierbaren Stickstoff, Kohlenhydrate und vorzugsweise auch Phosphor. Vorteilhaft läßt man sich den Pilz einige Zeit entwickeln, etwa 24 bis 48 Stunden, bis man das Steroidsubstrat zugibt. Nach dem Zufügen des Steroids werden die Gärbedingungen vorzugsweise noch einige Stunden, z. B. 24 Stunden oder länger, aufrechterhalten. Dann werden die umgewandelten Steroidprodukte isoliert.
Dies erfolgt vorzugsweise durch Extraktion des Mycels und der Gärlösung mit einem Lösungsmittel. Zum Beispiel kann man das Mycel abfiltrieren und mit Aceton waschen und das Filtrat mit Methylchlorid oder einem anderen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahieren. Gewöhnlich findet man den größten Teil des umgewandelten Steroidproduktes im Mycel.
Die extrahierten Steroide können-darauf in üblicher Weise gereinigt werden, z. B. durch fraktionierte Kristallisation oder chromatographisch.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Beispiel 1 9,%,21-Dioxy-4,17(20)-[cis]-pregnadien-3,11-dion Ein Gärbottich mit 1001 eines sterilen Mediums vom pH-Wert 4,9, das aus handelsüblicher Dextrose (10 g je Liter) und Maisquellfeststoffen (20 g je Liter) hergestellt worden war, wurde mit 51 einer vegetativen Kultur von Helicostylum piriforme Bain (ATCC 8992) versetzt. Nachdem man 24 Stunden unter Belüftung (21 je Minute) stark gerührt hatte, wurden 20;0 g llß,21-Dioxy-4,17(20)-[cis]-pregnadien-3-on als Lösung in 500 cm3 Aceton zugegeben. Darauf wurde die Gärung 48 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Die Umwandlungsprodukte wurden nach dem Verfahren von D. H. P e t e r s o n und Mitarbeiter, J. Am. Chem. Soc., 74, S. 5933 (1952), extrahiert. Man erhielt etwa 42 g halbkristallinen Rückstand; der in etwa 1 1 trockenem Methylenchlorid gelöst und über 2 kg synthetisches Magnesiumsilikat, das unter dem Handelsnamen »Florisil« bekannt ist, chromatographiert wurde. Die Säule wurde sechsmal mit je 21 jeder der folgenden Lösungsmittelzusammensetzungen entwickelt: Hexankohlenwasserstoffe, bekannt unter dem Handelsnamen »Skellysolve B« plus 18 °/a Aceton, »Skellysolve B« plus 200/, Aceton, »Skellysolve B« plus 250/, Aceton und »Skellysolve B« plus 50010 Aceton. Die Rückstände der Fraktionen 9 bis 21, wobei die Methylenchloridfraktion mitgezählt ist, wurden vereinigt, in heißem Aceton gelöst, mit 2 g Holzkohle, bekannt unter dem Handelsnamen »Darco G-60« entfärbt, filtriert und das Filtrat eingeengt, bis reichliche Kristallisation eintrat. Das Gemisch wurde in einem Kühlschrank 2 bis 3 Stunden gekühlt und anschließend filtriert. Man erhielt 10,33 g 9a,21-Dioxy-4,17(20)-[cis]-pregnadien-3,11-dion, das zwischen 217 und 219°C schmolz. Zusammen mit weiteren Kristallisationschargen erhielt man insgesamt 12,31 g Produkt, das aus Aceton umkristallisiert wurde und 9ca,21-Dioxy-4,17(20)-[cis]-pregnadien-3,11-dion vom Schmelzpunkt 219,5 bis 221'C; einer optischen Drehung [a]D = -I-173° (Dioxan); ZmäX = 238,5 m#L (am = 15 725);v@u' = 3440, 3330, 1700, 1640 und 1605 cm-' und die folgenden Analysenwerte ergab:

C21 H28 04

Berechnet . .. C 73,22, H 8,19;

Ergebnis .... C 73,32, H 8,30.

Beispiel 2 9oc,21-Dioxy-4,17(20)-[cis]-pregnadien-3,11-dion a) 121 eines sterilen Mediums, das aus 1,2 °/o MaisquellfeststofFen und 1,00/0 handelsüblicher Dextrose, bekannt unter dem Handelsnamen »Cerelose«, bestand und einen pH-Wert von 4,7 hatte, wurden mit 600 em3 einer Kultur von Cunninghamella blakesleeana (ATCC 8688a), die 72 Stunden im gleichen Medium gezüchtet worden war, versetzt. Durch das Gärgemisch wurde Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,51 je Minute geblasen, und dabei wurde mit einem Flügelrührer stark gerührt. Nach 24 Stunden lag der pH-Wert bei 4,4. Zu diesem Gemisch gab man 3,0 g lIß,21-Dioxy-4,17(20)-[cis]-pregnadien-3-on in 30 cm3 heißem Propylenglykol; das Belüften und Umrühren wurde 24 Stunden fortgesetzt. Dann wurde der Inhalt des Gärbottichs mehrere Male mit Methylenchlorid extrahiert.
Das erhaltene 9a,21-Dioxy-4,17(20)-[cis]-pregnadien-3,11-dion war mit dem nach Beispiel 1 hergestellten identisch.
Nach dem Verfahren der Beispiele 1 und 2 wurde auch llß,21-Dioxy-4,17(20)-[trans]-pregnadien-3-on in 9a, 21-Dioxy-4,17 (20)- [trans]-pregnadien-3,11-dion übergeführt.
b) Zu einer Lösung von 5,0 g 9x;21-Dioxy-4,17(20)-[cis]-pregnadien-3,11-dion in 15 cm' trockenem Pyridin gab man bei 20'°C 15 cm3 Essigsäureanhydrid. Nach 17stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wurde die Lösung in 450 em3 eines Eis-Wasser-Gemisches gegossen. Das abgeschiedene kristalline Produkt wurde abfiltriert; mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Man erhielt 5,53 g 9x,21-Dioxy-4,17(20)-[cis]-pregnadien-3,11-dion-21-acetat, das bei 172,5 bis 177°C schmolz. Durch Umkristallisation aus 70 Cm3 heißem Aceton, Filtrieren und Einengen auf einem Dampfbad wurde der Schmelzpunkt auf 188,5 bis 190°C erhöht. Die so erhaltenen Kristalle zeigten eine optische Drehung von [rx]D = 160° (Aceton); AM 'i 239 m#t (am = 15 750); vmax°I = 3390, 1725, 1700, 1652, 1240 und 1224 cm-'.

Analyse für C23H3o05:

Berechnet ... C 71,48; H 7,82;

Ergebnis .... C 71,42; H 8,19.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 9a-Oxysteroiden der Pregnanreihe der allgemeinen Formel in der R Wasserstoff oder den Acetylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man nach an sich bekannten Methoden llß,21-Dioxy-4,17(20)-pregnadien-3-on mit einem Fungus der Gattung Cunninghamella oder Helicostylum, bzw. mit deren oxydierend wirkenden Enzymen mikrobiologisch oxydiert und gegebenenfalls die 21 -ständige Hydroxylgruppe acetyliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1; dadurch gekennzeichnet, daß man die mikrobiologische Oxydation mit Cunninghamella blakesleeana oder Helicostylum piriforme durchführt.