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Verfahren zur Darstellung von ungesättigten Ketonen der Cyclopentanopolyhydrophenanthrenreihe
auf biochemischem Wege Es ist bekannt, daß man auf biochemischem Wege, und zwar
durch partielle Reduktion mittels Hefe aus 44,5-And'ostendion-(3,z7). Testosteron
herstellen kann. Ebenso ist mit Hefe eiine Reduktion von Dehydroand-rosteron zum
j5,6-Androstendiol-(3,z7) durchgeführt worden (Mit m o 1 i und Mitarbeiter, Berichte
der Deutschen Chemischen Gesellschaft ; o, 170 [i9371; Zeitschrift f. Physiologische
Chemie 245.93 (19371.
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Es wurde nun gefunden, daß in-an auch bei Anwendung anderer biochemischer
Methoden zu Testosteron gelangen kann, wenn man sich nämlich die oxydative Wirkung
gewisser Mikroorganismen zunutze macht. So läßt sich z. B. mit Hilfe von Bakterien
der Acetobaktergruppe, insbesondere mit dem Bakterium (Acetobacter) Pasteurianum
eine partielle Oxydation von z15,6-Androstendiol-(3,i7) ermöglichen, - so daß Testosteron
entsteht. Ferner kommen Bakterien, wie Micrococcus Oblongus oder Sorbose-Bakterien,
für die biochemische Oxydation in Betracht. Auch Schimmelpilze, z. B. gewisse Aspergillaceen,
können für diese Reaktion vorteilhaft verwendet werden. In gleicher Weise wie Androstendiol
läßt sich Dehydroandrosteron mit Hilfe derselben Bakterien zum 1d4,5- Androstendion-(3,z7)
oxydieren und 45,c-Androstendiol-(3,17)-monopropionat-17 zu Testosteron.
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Testosteron wurde bereits auf synthetischem
Wege,
und zwar aus Deliy@lroandrosteronacetat über Androstendiolmonöacetat. Androstendioläcetatbenzoat,
Androstendiolmonobenzoat, Testosteronbeilzoat hergestellt. Wie schon aus dieser
Skizzierung ersichtlich, bedarf es zu dieser Herstellung fünf Arbeitsphasen, was
naturgemäß ein viel umständlicheres Verfahren, egenüber dem beanspruchten bedeutet,
«-elches in zwei Phasen au: Dehydroandrosteron über Androstendiol das Testosteron
liefert.
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Gegenüber dein obenerwä hnten Verfahren der partiellen Reduktion des
Androstendions von M a m o 1 i. it-elches auf enzymatischem Wege ebenfallls zum
-Testosteron führt, besitzt das beanspruchte Verfahren den technischen Vorteil,
da(i das für letzteres nötige Ausgangsmaterial, z. B. das An.drostendiol, aus dein
Dehydroandrosteron in quantitativer (ioo "/o) Ausbeute erhalten tvird, während der
bei dem Reduktionsverfahren von M a -m o 1 i ztt verweii-dende Ausgangsstoff, das
Androstendion, in geringerer Ausbeute erhalten werden kann.
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Das Verfaluen sei inl folgenden an Hand der Ausführungsbeispiele näher
beschrieben. Beispiel x Als Nährlösung für die Bakterien wurde ungellopfte Bierwürze
für Lagerbier verwendet. Der Maltosegehalt Gier Würze wurde 1),-stimmt und durch
Verdünnen mit M-asser auf einen Gehalt -von etwa .4 °/o gebracht. Die Nährlösung
wurde dann nach Zusatz von Calciumcarbonat .2() Minuten bei 115° itri Autoldaven
erhitzt und nach dein Abkühlen klar filtriert. Die erneut unter Druck erhitzte Nährlösung
wurde darauf in sterile geräumige Petrischalen gefüllt und mit dem Bacterium Pasteurianum>
beimpft. Nach 3tägigcin Stehen bei Zitninertetnperatur wurde in jede Petriscbale,
die 30occtll Nährlösung entlei;It, eine Lösung voll 311 in- Androstendiol in 15
ccm Äthylalkohol vorsichtig hinzugegeben. \aich weiterem Stehen bei Ziminertemperatitr
wurzle von neuem die gleiche Menge Androstendiol leinzugefügt Und nochin,als z Tage
bei derselhei; Temperatur belassen. -Darauf wiu-den die Inhalte der Petrischalen
zusätntnengegebetl untl erschöpfend mit Äther behandelt.
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Die ätherische Lösung wurzle durch Waschen von der Essigsäure befreit,
die ebenfalls bei der Gärung sich gebildet hatte, und nach dein Trocknen verdampft.
Der Rückstand wurde mit Digitonin gefällt, das Filtrat vom Digitotiin befreit und
in _lethanol mit Semicarbaziclwcetat umgesetzt. Das Seniicarbazon würde isoliert
und in bekannter Weise gespalten-Nach Behandlung mit säurehaltigem Methanof wurde
aus Essigester kri-
| stalliniert. Das Produkt zeigte in Äthanol |
| einen Drehwert von (v);; = ; zo8 ->; Fp. |
| 1 q2= und erwies sich als Testosteron, Aus- |
| beute 1,0",0# Beispiel a |
| Unter Verwendung desselben Substrates |
| für die Bakterien wurde, wie im vorigen Bei- |
| spiel beschrieben, die alkoholische Lösung des |
| zu oxydierenden Produktes zu teer Bakterien- |
| kultur gegeben. Ver-,%-enrlet wurden 2()()111g |
| Dehydroandrosteron bei einer Substratinengc |
| von 300 ccm. Nach 3tä-igeili Stehen |
| wurde alit Äther extrahiert. Ldie atllerisclic |
| Löstnlg gewaschen, getrocknet und verdampft. |
| Der Rückstand wurde dann zur Entfernun- |
| des unveränderten @ehydroandrosterans |
| .I Stunden in absolutem Py-ridin mit Phtalsäure- |
| anliydrid behandelt, das Reaktionsgemisch fitz |
| Wasser gegossen, nlit Äther elti-ailiert und |
| das Pvridin durch Waschen finit s:iurelialti- |
| gein `@"asser entfernt. Der saure Plltalsäure- |
| ester des Dehydroandrosterons lieh sich dann |
| finit Alkali abtrennen, und die ätherische |
| Lösung hinterließ nach dem Verdampfen ein |
| Kristallisat, das mit säurehaltigem 1letltanol |
| behandelt wurde untl nach dein Uinkri.stal- |
| lisieren aus Hexan Androstendion vom Drüh- |
| wert (y)i;'- -I-- 198' (CHCI,) und Fp. Z73 |
| ergab, Ausbeute 2o "l,. |
| Beispiel 3 |
| Ebenso wie in den Beispielen i und 2 be- |
| schrieben, wurde in einem weiteren Versuch |
| Androsteildiolm,onopropioieat-t; der Oxyda- |
| tion unterworfen, und zwar wurd°il 30o nir |
| dieses Produktes (Fp. 1-.6'; (i);' _ - 6 2 ' |
| (C.H"0H) für eine Bakterienkultur finit |
| 300 ccni Substrat benutzt. Nach .ltäz-igem |
| Stehen bei Zimmertemperatur wurzle, wie im |
| Beispiel z beschrieben, aufgearbeitet, auch |
| (las unveränderte Monopropionat als saurer |
| Plltalsä ureester entfernt. Das nach der Iso- |
| nierisation verbleibende Testosteronpropionat |
| wurde dann aus Hexan kristallisiert und |
| hatte folgende Daten: Fp. 12i'; (x);"' - |
| 8; - (C. H3 OH). Ausbeute a 1 ";'o. |
Auf 1 1 einer Nährlösung von der Zusainniensetzung: 1
% Pepton, o, a °,!o
Ainiiiotiiunibiphosphat, o,1 °,7o Kaliumbipllospllat, 0,025 Magnesiumphosphat werden
Sorbosel>akterien zum äuten Wachstum gebracht. l)atlil werden ztt dieser Kulturlösung
portionsweise io ccal einer 2°joigen Lösung von Cholesterin in Alkohol gegeben.
Nach längerem Stehen wird das gesamte Reaktionsgemisch mit Äther extrahiert. Die
Ätherlösung wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird
darauf in Methanol finit Setnicarbazidacetat eingesetzt. Dabei tritt
Abscheidung
von Cholestenonsemicarbazon ein. Das Semicarbazon liefert nach der Spaltung das
Cholestenon mit den Daten: Fp. 8o bis 8z°; (oc)'D° = -i- 87° (CHC13). Die Ausbeute
beträgt 29 °/ä.
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Beispiel 5 6o ccm steriles Hefewasser wurden durch Zugabe von io ccm
m/5 sek. Natriumphosphat und io ccm m/5 prim. Kaliumphosphat gepuffert, mit Zoo
mg fein pulverisiertem Dehydroandro-steron versetzt .und 1 Stunde im Dampftopf sterilisiert.
Nach dem Erkalten wurde rnit einigen Tropfen .einer aeroben Bakterienmischung infiziert,
die nach üblichen Methoden aus - Mailänder Hefe (Mailänder flockige Fermente) gezüchtet
worden war. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei 32' unter Sauerstoff 46 Stunden
geschüttelt. Danach wurde der Versuch unterbrochen und die Suspension filtriert.
Dem auf dein Filter verbliebenen Rückstand wurde das Reaktionsprodukt durch Auskochen
mit Aceton entzogen: Nach dem Einengen der Acetonlösung und vorsichtigem Zusatz
von Wasser kristallisierte in einer Ausbeute von 87"/, das A4 Androstendion vom
Schmelzpunkt 168' (unkorr.).
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Beispiel 6 6o ccm steriles Hefewasser wurden durch Zugabe von io com
m/5 sek. Natriumphosphat und io ccm m/5 prim. Kaliumphosphat gepuffert, mit Zoo
mg fein pulverisiertem Pregnenolon versetzt und i Stunde im Dampftopf sterilisiert.
Nach dem Erkalten wird mit einigen Tropfen einer frisch in Hefewasser gezüchteten
dehydrierenden Bakterienmischung infiziert. Das Reaktionsgemisch wird dann bei 32°
unter Sauerstoff 6 Tage lang geschüttelt. Danach wird der Versuch unterbrochen und
die Suspension filtriert. Das Reaktionsprodukt wird dem auf dem Filter verbliebenen
Rückstand durch Auskochen. mit Aceton entzogen und zur Kristallisation gebracht:
es stellte ein Gemisch von Pregnenolon und Progesteron dar. Die Trennung dieses
Gemisches wird nach B u t enandt und Westplial auf folgendem Wege durchgeführt.
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Das Gemisch wird in 3 ccm Chloroform und 11/= ccm absolutem Pyridin
gelöst. Nach dem Abkühlen der Lösung auf o' wird eine ebenfalls gekühlte Mischung
von o,5 ccm Chlorsulfonsäure und 2 ccm Chloroform langsam hinzugegeben. Das Reaktionsgut
wird erwärmt und z Stunde auf dem Wasserbade zum Sieden erhitzt. Nach dem Erkalten
werden . etwa .4o ccm Äther und -2o ccm 2 n-Soclalösung hinzugefügt und kräftig
geschüttelt. 1)as Natriumsalz des sauren Pregnenolonsulfates fällt aus und wird
mit Äther gewaschen. Die gesamten ätherischen Lösungen werden vereinigt, finit verdünnter
Schwefelsäure und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird
in verdünntem Alkohol gelöst und ergibt 8o mg Progesteron (A4 Pregnendion). Das
Natriumsalz wird durch .Behandlung mit einem Gemisch aus Teilen Alkohol und i Teil
5 n-Schwefelsäure gespalten;. es lieferte 8o mg Pregnenolon zurück-Beispiel 7 6o
ccm steriles Hefewasser werden mit i o ccm n/5 Na. H P 0g und i o ccm 1i/5 prünärem
KH.POi gepuffert und mit aoog fein pulverisiertem Methylandrostendiol versetzt und
i Stunde im Dampfbad sterilisiert. Nach dem Erkalten wird mit einigen Tropfen der
frisch in Hefewasser gezüchteten Bakterienmischung infiziert. Das Reaktionsgemisch
wird dann bei 32° unter Sauerstoff 5 Tage lang geschüttelt. Danach wird der Versuch
unterbrochen und die Suspension filtriert. Der auf dem Filter verbleibende Rückstand
wird mit Aceton aufgenommen und durch Filtrieren von den Bakterien befreit. Die
Trennung des nach Verdampfen des Acetons erhaltenen Gemisches in. ketonhaltige und
nichtketonhaltige Teile erfolgt z. B. mittels Girards Reagens, Zu diesem Zwecke
löst man den Rückstand in 3o ccm absolutem Alkohol und gibt 3 g Eisessig und 1,5
g Girards Reagens hinzu und kocht dann i Stunde am Rückflußkühler. Nach dein Abkühlen
gießt man die Reaktionsmischung in 200 Mn Wasser, «-elches eine zur i\ eutralisierung
von 2,79 Essigsäure berechnete Menge NaOH enthält. Man extrahiert dann dreimal
mit Äther und wäscht die ätherische- Lösung, welche den nicht ketonhaltigen Anteil
enthält, mit Wasser, trocknet dann mit Natriumsulfat und dampft den Äther ab. Durch
Kristallisieren aus verdünntem Aceton 20111g unverändertes l ethylandrostendiol.
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Die wäßrige Lösung des mit dem Girard-Reagens erhaltenen Produktes
wird mit io g konzentrierter H. S O,, versetzt und nach 2 Stunden wiederholt mit
Äther ausgezogen. Die ätherische Lösung wird dann mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat
getrocknet und der Äther verdampft. Der Rückstand liefert nach dem L mkristallisieren
aus verdünntem 'Methanol und verdünntem Aceton 15o mg einer Substanz vom Schmelzpunkt
163° bis 16.1' (unkorr.). In -.Mischung mit Metliyltestosteron zejgt sich keine
Schmelzpunkterniedrigung.
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Beispiel 8 6o ccin steriles Hefexasser" «-erden finit io ccm 11/5
Nag H P O4 und i 0 ccm 11/5 primärem
KH=PO4 gepuffert und finit
aoog fein pulverisiertem '-#Ietliylandrostendiol versetzt und 1 Stunde im Dampfbad
sterilisiert. Nach dem Erkalten wird mit einigen Tropfen eines frisch in Hefewasser
gezüchteten Bakterienstammes infiziert. Der zur Dehydrierung verwendbare Stamm wird
aus einem Bakteriengemisch wie folgt gewonnen: In einem dehydrierenden Bakteriengemisch
aus Mailänder Hefe, wie es z. B. durch M ainoli und V ereellone, Berichte der Deutschen
Chemischen Gesellschaft ;1, 1686 (1938) gewonnen werden kann, herrschen Stäbchenformen
vor. Bei der Reinzüchtung durch Plattenkulturen auf Hefewasseragar bei
37' (Optimaltemperatur) finden sich iieb°fi großen weißen Oberflächenkolonien
mit lockenförmigen Ausläufern zahlreiche kleinere, zitronengelbe, glattrand,ige,
erhabene, saftig glänzende Kolonien bis zu a min Durchmesser. Die aus diesen gelben
Kolonien gewonnenen Reinzuchten in Hefewasser waren zur Dehydrierung befähigt, während
die großen weißen Kolonien Sporenbildner vom Typus Bacillus subtilis enthielten,
die stets wirkungslos waren.
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Die aus den gelben Kolonien erhaltenen Keime erwiesen sich unter dein
llikroslzop als sehr kleine, teilweise zu l:urz°n Ketten vereinigte.Kurzstäbchen.
Sporenbildung und Eigenbewegung konnten niemals beobachtet werden. Die physiologischen
Eigenschaften der Keime wiesen darauf hin, daß die Organismen wahrscheinlich zur
Gattung Corynebakteritim L. et _X. zu rechnen sind. Der Stamm ist deutlich
nach Gram färbbar: obwohl längere Fadenbildungen, echte Verzweigungen, keulige Anschwellungen
u. dgl. nicht beobachtet «-erden konnten, «-aren immerhin kürzere Fäden und gewisse
Unregelmäßigkeiten der Form unverkennbar; auch eine gewisse Streifenbildung bei
der Färbung, in der gut und schlecht färbbare Strecken ab-`vechselten, war mehrfach
zu sehen. Der Stamm zeigt gutes Wachstum in Hefenasser und auf den entsprechenden
Agar- und Gelatinenährböd.en; weniger günstig erwies sich aus Fleisclie@tral.:t
Hergestellte Peptonbouillon. Auffallend ist das ausgesprochene Luftbedürfnis der
Bakterien und ihr kräftiges Peptonisierungsvermögen in Milch, die be i
37' C nach 3 Tagen fest koaguliert wird, das Koagulum wird anschließend,
von oben her beginnend, aufgelöst und ist nach etwa 1.1 Tagen praktisch vollständig
in eine fast klare gelbliche Flüssigkeit verwandelt. Gelatine-Stichkulturen zeigen
ini Stichkanal nur mäßiges Wachstum, während sich an der Oberfläche eine gelbe Auflage
bildet: die Verflüssigung der Gelatine beginnt bei Zimmertemperatur nach etwa 6
bis 7 Tagen und schreitet langsam fort. Schüttelkulturen in Peptonbotiillon
Agar mit 2 "/" Traubenzucker oder llilchzucl;er zeigen gute: Wachstum an der Oberfläche,
aber keinerlei Gasbildung. In Nährböden aus Hefeautolysat ist nur anfänglich ein
geringes oder überhaupt kein Wachstum festzustellen. Die Kartoffelkultur zeigt ähnlich
wie die Schrägagarkultur eine kräftige, gelbe, saftig glänzende Auflage.
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Alle genannten Eigenschaften treffen für einen Stamm der Gattung Corynebacterittill
helvolum L. et N., so daß man an Stelle des aus \lailänder Hefe gewonnenen Bakterienstammes
auch auf andere Art und `''eise gezüchtete Stämme des Corynehacterhini helvoltun
L. et \'. verwenden kann.
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Das finit dem nach vorstehenden Atisfülirungen erhaltene Bakterium
versetzte Reaktionsgemisch wird dann bei 32' unter Sauerstoff > Tage lang geschüttelt.
Danach wird der Versuch unterbrochen und die Suspension filtriert. Der auf dein
Filter verbleibende Rückstand wird mit Aceton aufgenoniinen und durch Filtrieren
von den Bakterien befreit. Die Trennung des nach Verdampfen des Acetons erhaltenen
Gemisches in ketonhaltige und nichtketonhaltige Teile erfolgt z. B. mittels Girards
Reagens.
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Zu diesem Zwecke löst man den Rückstand in 30 ccm absolutem
Alkohol und gibt 3 g Eisessig und 1,5 g Girards Reagens hinzu und kocht dann i Stunde
am Rückilwßkühler. Nach dein Abkühlen giellt man die Reaktionsmischung in Zoo ccm
Wasser, welches eine zur \ etitralisierung von 2,; g Essigsäure berechnete Menge
NaOH enthält. llan extrahiert dann dreimal finit Äther und wäscht die ätherische
Lösung, welch-- den nicht ketonhaltigen Anteil enthält, mit Wasser, trocknet dann
mit Natriumsulfat und dampft den Äther ab. Durch Kristallisieren aus verdünntem
Aceton 2() nig unverändertes 3,letliv landrostendiol.
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Die wäßrige Lösung des mit dem Girard-Reagens erhaltenen Produktes
wird mit io> T konzentrierter H. S 04 versetzt und nach Stunden wiederholt mit Äther
ausgezogen. Die ätherische Lösung wird <tann niit Was,cige«-aschen, mit Natriumsulfat
getrocknet und der Äther verdampft. Der Rückstand liefert nach dem Lmkristallisieren
ans verdünntem Aceton 13o fing einer Substanz vorn Schmelzpunkt 163- = bis
16.1' (unkorr.). In llisclitiiig mit 1Iethvltestosteron zeigt sieh keine Schmel-rpunkterniedrigung.
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Acetvlierung von Methyltestosteron 30 nig der oben beschriebenen
Substanz wer,l"n 1!_ Stunde mit 2 ccm @ssigsurean@vdrid gekocht und der L'berschuß
von Essigsäureanhydrid entfernt. Der Rückstand wird
aus verdünntem
Alkohol umkristallisiert. Der, Schmelzpunkt des 23 mg erhaltenen Produktes liegt
bei 17q.° bis i75° (unkorr.) und zeigt in Mischung mit Methyltestosteronacetat keine
Erniedrigung.