DE1467982A1 - Verfahren zur Herstellung von Fusidinsaeure und ihren Salzen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Fusidinsaeure und ihren SalzenInfo
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- Verfahren zur Herstellung Ton lusidinsäure und ihren Salzen Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Her- stellung der antibiotisch aktiven Verbindung fusidinsäure und ihrer Salze. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, bei welchen ein Filz, der zu Stamm Oephalosporiae gehört, unier eingeregelten Bedingungen so lange einer feraentation unterworfen wird, bis Ton ihm eine wesentliche Menge an Pusidinsäure gebildet worden ist, worauf dann die auf diese Weine erzeugte Verbindung isoliert wird.
- Heim Verfahren gemäß der Erfindung können die fusidin# säure oder ihre Salze sowohl in Form Ton verdünnten Lösungen oder Rohkonzentraten als auch in reiner kristalliner Fora
erhalten werden, und, sofern es sich um freie Pusidia- säure handelt, kann diese ferner in ?oa eües ihrer kristallinen Solvate mit tösungsmitteln gewannen werden. fusidinsäure ist eine bekannte Verbindung, nämlich die Verbindung, die früher als Antibiotikum Z1-6 bezeich- net worden ist und gemäß früheren Vertiffentliohungen durch Züchten des Pilzen ?usidium ooooineum huoi (t. ?ubaki) in einem geeigneten lermentationswedium erhalten werdet kann. Die genannte Verbindung ist eine @,g-ungesättigte tarbonsäure der ]Formel 031H-4806, die wahrsoheinlioh die folgende Konstitution aufweist: Aus dieser lbsael, in der die gewellt ausgeftihrten Verbindungsstriche anzeigen, daß die in Prags stehende äonf igurati an un gewi B ist, ist ersichtlich" da.B lhxsi din- säure ein Cyolopentanoperhydrophenanthren-Derivat ist, tsidinsäure ist eine farblose, kristalline Verbin- dung, die in Wasser und Sex= nur schwer löslich ist, da- gegen in organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise ithenol, Aceton, Xethylisobutylketon, Aaylaoetat oder Ohloroforu, löslich ist. Siehst einen Schmelzpunkt von 192 bin 1930 0 und eine spezifische Drehung von -9o in einer 1-%igen Lösung in Chloroform. Bei 220 in /U hat diese Verbindung einen molaren Bztinktionskoeffizienten von 8000 in Ithanol, und sie zeigt keine charakteristischen Absorptionsbanden oberhalb dieser Wellenlänge. Fusidinsäure ist ferner durch ihr Spektrum im ü8-Bereioh, wie es in der Zeichnung dargestellt ist, gekennseiohnet, aus der sich ergibt, dafi sie obs"akteristisohe Absorptionsbanden bei den in reziproken Zentimetern ausgedruckten ?requennen = 1265, 1385. 1695, 1730 und 3450 en 71 aufweist. Dti der ?apierohroaatographie unter Versendung der von Buch beschriebenen Systeme (Blochenioal Journal 50, 1952, Seite 370) hat lhisidinsgure Itr-Verte von 0,38 und 0,73 Im B (i)- b:w. E (5)-Systen. Die Saure, die einen pH-Wert von etwa 5,35 aufweist, kann mit anorganischen und organischen Basen eine Tiel- zahl von Salzen bilden, von weichen einige, wie das Natrium, Kalium- und Diäthanolaminsala, in Nasser löslich. sind, xogegenbeispielsweise das üalziumaals in Nasser nur schwer löslich ist. In der klinischen Therapie wird vorzugsweise das Natriumsalz benützt und bei der Behandlung von Intektions- krmkheiten, insbesondere den durch Staphylokoäken, Weisse- rie und Corynebakterien verursachten Krankheiten, gegen die sich fusidinsäure als sehr wirksam erwiesen hat, wie aus der im nachfolgenden wiedergegebenen Tabelle I ersieht- - lieh ist, aus der die spezitischeren antifungiellen und anti- bakteriellen Aktivitäten von husidinsäure zu entnehmen sind, oral verabreicht. In der genannten Tabelle sind in der ersten Spalte die jeweiligen Organismen, in der zweiten Spalte die verwendeten Substrate und in den verbleibenden Spalten die Aktivität, ausgedrückt In-den Mengen des Natrium- salzen von husidinsäure in mg/l, die eine 50-%ige Hemmung des in frage stehenden Organismus nach der in Stunden ange- führten Zeit hervorrufen, angeführt. Tabelle I Organimus Substrat Zeit Aktivität Staph ,loaooous aureus, ge ®m Peniolllin emptindlioh Bouillon 24 0,06j Btaphylooooous aureus reni- oillinase bildender Biete Bouillon 24 0,050 xeisserla gonorrhoeae Blut- asoites- agar 24 0,32 Beisseria seniaitides Blut- asoltes- agar 24 0,32 Streptooooaus pyogenes Bouillon mit 5 X aerum 24 392 Streptooooous taeoalis Bouillon r3.t 5 % 8l rum 24 5v0 Pseudomonas aerugiaosa, Uibrio ooma, Banheriohla ooli, Elebsiella pneuaonise, ßerratia maroesoens und Proteus Ytlgar3e Bouillon 24 # 30,0 Salmonella typhiauriuua Bouillon 24 > 100,0 Oandida albioans Saborauds 24 100,0 Trioophyton mentagrophytes Saborauds 72. 100,0 lapergillus niger Saborauds 72 100,0 Baoillus subtills Bouillon 24 1,6 Hyoobaoterium tuberaulosis imrehuae Duboe. 14.4 0,79 olostridium tetani Thloglykolat- Xedlum 48 0,02 Ooryaebaoterium pyogenes ileiseh- wasser mit 10 % Serum 24 0905 Na wurde nun überraschenderweise festgestellt, daB Pilze der Gattung CephalosporiuN die zur ?aailie der Muoedhaoeae (Koniliaoiae) der Ordnung Hyphoa?oetales (Moniliales) gehören, oder durch Bestrahlen der Filze mit UV-Lioht, Röntgenstrahlen, Elektronen von hoher Ce- sohxindigteit oder durch chemische Mutagens n, wenn die Filze submers unter Belüftung in einen geeigneten Kultur- medium gezüchtet werden, erhaltene Mutanten imstande sind, eine antibiotisch aktive Verbindung zu erzeugen, die bei einem Vergleich mit Pueidinsäure Eigenschaften aufweist, die zeigen, da£ die zur Diskussion stehende Verbindung mit der genannten Säure identisch ist. Beispielsweise bilden im folgenden angefflhrte Ni.äro- organismen, die alle zur Gattung ßephalosporitua gehören, wenn sie 3 bis 7 Tage in den mit römischen Ziffern bezeich- neten Nährsubstraten fermentiert werden, Pusidinsäures Tabelle II Pils Ort der Substrat Herkunft Cephaloeporium lamellaeoola P.B.Smith CBS I und II Cephalosporium lefroyi Horne CBS I Cephalosporium malorum Kidd CBS III Cephalosporium reoifei Leao et Lobo CBS I Csphalosporium solerotigenum M et ?. Xoreau CBS IM Pils Ort der Substrat Herkunft Oephalosporium stühneri Sahaidt et Y Bense OBS Oephalosporim niveo-lanosum@Benedek CB8 Die in der Tabelle verwendete Bezeichnung "0B8" be- sieht sich auf das Centralbureau voor Sohimmeloultures, Baarn, Holland, von wo die genannten Kulturen unter den angeführten lasen erhalten werden können. Die angegebenen Nährsubstrate sind die folgenden: I 8aborauds-Xedivua: Pepton 10 g ßluoose 20 g Dest. Wasser 1 1 pR vor des Einbringen in den Autoklaven s"6,0 II 8teleT's#äediumt alzoe rin 795 g Xaisquellwasser 50 % 2,5 g Xagaesiumsulfat 50 mg Kaliumphosphat, prim. 60 mg latrimaohlorid 4 g Perrosulfat 5 mg Cuprisulfat 1' mg Glucose 10 g Leitungswasser 1 1 °--pH vor dem Einbringen in den Autoklaven - 7,0 III Xedium der folgenden Zusammensetzungs Glucose 60 g Asparagin 4.5 g Ammonsultat 15,84 g Kaliumphosphat, prim. 14,28 g Kaliumphosphat, sek. 33,36 g Hagnesiumphosphat 6 g Cuprisulfat 38,4 mg gerrosulfat 6,6 mg Hangansulfat 53,4 =g Zinksulfat 9 mg Hefeextrakt 30 g Halsquellwasser 50 120 ml Kreide 30 , g Deut. Wasser 6 1 Zur Gewinnung eines Mutanten von der Art, die für das Yerfahren gemäß der Erfindung brauchbar ist, kann eine der bekannten Mutationsmethoden angewandt werden, bei der die Sporen des Pilzes eine äinwirkung erfahren. So kann beispielsweise eine Sporensuspension mit ionisierenden oder nichtionisierenden StraMsh bestrahlt werden oder die Sporen können der Einwirkung von mutagenen tktemikalien, wie Diätiylsulfat oder Senfgas, unterworfen werden. zu wurde jedoch festgestellt, das die Mutation des Pilzes auf sehr zweckmäßige Weise durch Bestrahlen einer Sporensuspension mit UV-?doht über einen Zeitraum, der°einen Überlebungsprozentsatz in des Bereich von 0,005 bis 2,0 % gewährleistet, bewirkt werden kann. Hei einem Versuch, '5e1 welchem eine Sporansuspension von Cepheloeporium lamellaeoola 7.E. Smith-f.E. Smith mit UV-Licht bestrahlt wurde, wurde ein besonders geeigneter Mutant erhalten. Hei diesem Versuch Wurde das unten in Tabelle III angettlhrte Verhältnis zwischen Übedebungspro$entsatz und Einwirkungszeit testgestellt. Tabelle III Einwirkungszeit in Sekunden $berlebungsprozentsatz 10 50 20 493 30 09035 40 0,006 50 0,002 Nach der Einwirkung wurden die Sporen der bestrahlten 8uspensionea auf igarplatten aulaebraoht,und eine geeignete .Anzahl der gezüchteten goloalen wurde isoliert und näher untersucht, um ihre Naohatunsbedingungen und ihre Yähig- keit zur Erzeugung ton Pusidinsäure zu ermitteln. Bei dieser Verfahrenexeise wurde der oben erwhnte besonders geeignete Mutant aus der Sporensuspension Iso- liert, die 30 Sekunden lang bestrahlt worden war. Dieser Mutant erhielt die Bezeichnung 01-u 499, unter der er beim Commonwealth Myoologioal Institute in Surrey, »äg- lan d, geführt wird. Hinsichtlich der der Bporen- bildung und der hrbe ähnelt der Mutamt 01-u 499 des ur- sprünglichen Stamm, erfordert jedoch i= Gegensatz zu die- sem Stamm die Anwesenheit ton "x-äminobuttersture oder Isoleuotit in dem Substrat. Bei der Wohtung in einem der oben angeführten Sub- drnte erwies sich der Ifttant CQ-u 499 als Imstande, drei bis tiermal so viel 7üsidinsgure zu produzieren als der 3rbitterstamm. Nr die technische Herstellung ton fnsidinsäure :eig- ten sich insbesondere der ?1la Dephalosporium lasellaeoola ?.8.8atith-f.B.BÜth und Mutanten davon als geeignet, doch ist die Erfindung keineswegs auf die alleinige Verwendung dieser Organismen beschränkt. Heim Verfahren gemäß der ärtindnng wird eine l«idin- säure erzeugende ßpezies der Gattung Cephalosporium unter aeroben Bedingungen in einem uäßrigen itährrediux, das Kohlehydrate, Stickstoffquellen und geeignete Mengen der anorgaaisehen Salate und anderen Stoffe, die für die Braäh- rung des Pilzes erforderlich sind, enthält, gezüchtet und die forsentatiom wird solange fortgesetzt, bis die betref- fende Usung eine wesentliche sntibiotisahe Aktivität aut- »int, »rau! dann die auf diese Welse gebildete Pasidin- säure pwmnwe, konzentriert und in reiner Törn isoliert oder mit Eilte an sich bekannter Umsetzungen in eines ihrer Salze übergeführt wird. Die Bildungsgeschwindigkeit von pusidinsäure wird während den Verlaufes der durch routinemäßige äestimzvmg der Aktivität der Kulturfiltrate ermittelt, lttr welchen Zweck die Agarplatten-Nothode angewandt »d dabei beispielsweise Staphylooooous aureus als Testorganis- mus verendet werden kann. Die optimale Ausbeute an Pusidinsäure wird in eines Zeitraum Ton 80 bin 130 Stunden bei einer Temperatur zwischen 20 und 300C und vorzugsweise von 24 bim 2800 er- halten. Die angeihrten Tenperaturbereiohe stellen jedoch keine d renzwerte dar, da die t;3r den Erhalt gUnstiger =rgelminse erforderliche Zelt in einen gewissen Au»ag von der Bauwehe den Permentationagefäges und der Art den verwendeten Rührwerkes bzx. der Schütteleinrichtung abhängt. für die Herstellung von fusidiasäure haben sich zwar mehrere bekannte Kulturmedien als brauchbar erriesen, doch werden solche Medien bevorzugt verwendet, die als Stick- stoffquelle einen oder mehrere Stoffe aus der Gruppe Mai s- quellwasser, Lojabohnenmehl, Casein oder andere Nilahprodukte und Pieisch- und Knochenmehl enthalten. Die Menge an verfügbarem Stickstoff in den Kultur- medium kann vorteilhaft in den Bereich von 0,01 % bis 1,5 % liegen und beträgt vorzugsweise etwa 0,15 % den Kulturmediums. 11s vorzugsweise zu verwendende Kohlehydrate können Saooharose und Glucose genannt werden.. ferner ist es vor- teilhaft, das Nähmedium durch einen Zusatz von Fetten oder Pettsäuren zu ergänzen, um mit diesen einen Teil der Kohle- hydratquelle und r` ergiequelle zu bilden, da diese Stoffe e:.ne fördernde W.rkun; hinsichtlich der Bildung vom 7u3idin- säure suezuUban scheinen, wenn sie in Mengen ten etwa 0,1 bis 5,0 % den Kulturmediums verwendet werden. Pür den angeführten Zweck können sowohl die Pettsäure- glyeeride, als auch die darin enthaltenen freien Fettsäuren oder synthetische Ester dieser letteäuren beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendet worden. Insbesondere haben sieh.äettsäuren mit 12 bis 20 Kohlenetoffatcriten in der KohlenetoffLette oder J)erivate von solchen PEttsiuren als fördernd t"irkende Stoffe als brauchbar Erwiesen. Die Ut.-inuuna d@z, PucicansL.ure aus der Kultumedium kann auf verschiedene Arten erfolgen. ?orteilhafterweiee besteht der erste Schritt zur ßek3xrnung dieses Stoffee in einer Abtrennung des Hycele von dar Kulturflüssigkeit, beispielsweise durch giltration. Als nächster Schritt kann sich eire Adearption &n einem festen ldaorptionmittel, wie Aktivkohle oder einem Ionenaustausoherharz, mit einer nachfolgenden Blution aua drum Adaorptionomittel ansohlieAkem, wodurch eine Iconsentriertere und gereinigte Lösung von Fusidinogure erhalten werden kann. Der nächste Schritt kann aber such eine Bztraktion mit einen geeigneten IOmmgs- mittel, vorzugsweise einem mit 'Wasser nicht mIeohbaren 70- sungsmi.ttel, wie Nethylieobutylk.3ton, 9myiacetat, Butylaaetat oder dergl., bei einem geeigneten pH-Wert sein, worauf dann das reinere Produkt aus diesem 1äsuaZsmittel durch Bin- daApfen der organischen Phase auf ein kleines Voluften und Ausfällen des antibiotischen Stoffes entweder durch AbkOh- len oder durch Zusatz einer Torbindung, Welche die LösUoh- keit des antiblotiseh wirksamen Stoffes vermindert, isoliert werden .kann. Inabesoadere in Zusamunhang mit der mtIetzt ange- führten AusfUhruagsiesn käan Benzol erwähnt werden, das ein leicht kristallisierbares Solvat von. htsidinsäure bilden kann. Aua dem organischen Lösungsmittel kann tsidinsäure auch ohne Konzentration dieses Lösungsmittels isoliert werden, roll die sanrm äigenachaften ran hnsidiasäure die Xrohiührung einer ansehließenden Extraktion der erga- nisehen Phase mit einer sltlrigen alkalischen Lösung oder mit einer wUrigen Ouspenslon einer alkalischen Verbindung ermöglichen, wodurch konzentrierte oUrige Lösungen von Salzen der 1Pusidinsäure erhalten werden können. Durch Ansäuern von solchen: Lösungen kann die Säure ausgefällt Werden oder es kann, wenn dien gewUnsaht wird, das Balz der Pasidinsäure aus der alkalleohen Lösung isoliert werden. In Bezug auf die Reinigung v an Yusidinsäure ist ihre ?ähigreit, mit bestimmten Lösungsmitteln Bolrate zu bilden, ein viohtiges Msrlmal. Be wird beispielsweise bei einer Mutigen Austübruagsfori des Verfahrens gemäß der Irtin- dung die rohe Säure dadurch gereinigt, daß sie !n einer kleinen Menge von heißen Nethaaol gelöst wird, wobei beim Abkühlen Ihr Methmolsoivat in Oberrauchend reiner lern auskristallisiert, so daß nur diesen eirunde diese Vorgsacigs- weise besonders dazu geeijpet ist, äusidinsäurv 3.n einer pharras«tisoh annehmbaren Qualität zu gewinnen. Das ge- nannte äethaaolsolvat hat einen Schmelzpunkt ton 179 bis 179.5o0. Wenn Salze der fsidinsäurs erhalten werden sollen, dann kfnea diese durch eine einfache Zeutralieation der Säure oder eines ihrer Solvate gewonnen werden, indes die in !rase stehende Base in Gegenwart eines geeigneten Baak- tioansdedluus sngentst wird, das die Umsetzung erleichtert und ans welchen das Salz ausfallen kann oder gegebenenfalls durch Zusatz einer geeigneten äozpoonemte, die die Iösiioh- keit des geutinsohten Salzes herabsetzt, ausgefällt werden kann, oder das Salz kann durch Uadanpfen der Reaktions- nisehmtg isoliert werden. Bach einer anderen tusfMhraageforn kann ein bereits vorliegendes Salz von Pusidinsäure mit der in Betracht kos- tenden Uze megesetst werden oder das gewUnsohte Salz von fasidinsgure kann durch eine doppelte ünsetzung eines ihrer in vorhl.nein hergestellten Salze mit einen anderen Salz, welches das gewUnsehte Metallion oder die genlinsohte Hase enthält, hergestellt werden. Umfangreiche klinische Vershohe, die kürzlich ausge- inhrt xuxden, haben geseilgt , daa fusidineäure und gewisse Salze von ihr den Anforderungen, die an pharmazeutisch amaebnbare Antibiotika gestellt werden, entsprechen md- und diese Verbindungen Wertvoile Stoffe für die Behand- lung Ton Infektionskrankheiten darstellen, wie dies bei- spielsweise in der Zeitschrift "The Lancet", Band I, 1962, Selten 928 bis 937, beschrieben ist. Die Erfindung wird nun ein Hand der folgenden Beispiele, aus Welchen 31nsilaeiten der verschiedenen lusftlärimgsforaen entnommen werden können, näher erläutert t Beispiel 1 Herstellung von Pasidinsäure. 3 Liter einen Zulturmediuns der folgenden Zusamrn- setsung,ausgedrüokt in glls Glycerin 7o,5 Glucose 10,0 Sojabohnenmehl 3,0 Maisquellwasser 2,5 1(a01, 0 KH904 0,6 he »4.%0 09005 xgs04.71120 0,5 0u80,4#5%0 o,004, das vor des Sterilisieren auf einen pH-Vert von 6,8 einge- stellt Worden War, wurden in einem feraenter bei einer Temperatur von 120 °Q wEhrend eines Zeitraumes Ton einer halben Stunde sterilisiert und dann nach dem Abkühlen mit Sporen den Stammes Oephalosporium lamellaeoola p.$.Smith-?.B.ßti.th (erhalten vom Centraalbureau voor Sohimmeleultures, Baarn, Holland, und zur Gattung Oepha- losporium, gehörig) von einer Agarplatte angeimpft. Hierauf wurde die Kultur unter aereben Bedingungen bei einer Tem- per#f von 27°C 4o Stunden lang in einer hin- und herge- henden Sohütteleinriohtung bebrütet. Das auf diese weise erhaltene Keimmaterial wurde in ein ßefäB mit einen Inhalt von 700 1 übergeführt, das ein Kultumedlum von der gleichen Zusammensetzung Erie der germenter von der übliohen teohni- echen Größe enthielt, und bei einer Temperatur von 26°0 48 Stunden lang bebrütet, um die Entwicklung den vegetati- ven Wachstums den Pilzes vor dem änimpfen den Rauptfermen- ters au bewirken. Anschließend wurden 16,000 1 eines Kulturmediuns d er folgenden Zusammensetzung in gfls Saooharose 60,0 Halsquellwasser 50 % 20,0 gH2P4 10,0 Ngs04.7%11 0959 das vor dem Sterilisieren auf einem pH-Yert von 6,8 ge- bracht worden war, in dem Hauptfermenter bei 1200C eine halbe Stunde lang sterilisiert und nach dem Abktihlen mit den oben ervähnten Impfgut angeiupft. Unter Bewegen »d und Durchleiten von ruft durch eine Verteiltmgsvorrioh- ttmg in einen geeigneten Ausmaß (in, einen Verhältnis von 095 1 Luft pro 1 Plüseigkeit pro Minute) wurde das Xyeel gebildet, und die Permentation wurde bei einer Temperatur von 2600 während eines Zeitraumes ton 100 .Stunden fortge- setzt. Während des Verlaufes der Fermentation wurde die Akti- vität von Proben des Kulturfiltrates nach der Agarsohalen- Methode unter Verwendung ton StaphJZooocaus aureus als Testorganismus bestimmt. Wenn der Proseß beendet war, ent- sprach die erhaltene Aktivität einer Konzentration der Pusidinsäure in dem Kulturmedium v= 80/U&/ml. Nach den Abfiltrieren des MToels wurde die geläuterte Nährlösung auf einen pH-Wert qcm 6,0 eingestellt und in einem Podbielniak-Eztraktor mit Methylisobutylketon extra- hiert. Dieser Extrakt, der 1,1 kg Pusidinsäure enthält, wurde ansohlielien*it Natronlauge eines pH-#ertes von 11,5 extrahiert. Unmittelbar nach der Extraktion wurde die fri- ge ]Phase auf einen pH-Wert ton 9,3 gebracht und in einen vakuuneindampfer auf ein Volumen t= 150 1 mit einem Gehalt von 0"9 kg Pasidinsäure eingedampft. Dann wurde Benzel zugesetzt und der pH-Wert der xä9- rigen nass mit Hilfe vaoa@ Salzsäure unter »Ohr« auf 0, 5 eingestellt: dabei wurde ein Niedessehlag gebildet, der ans dem 1bn:elsolvat von Pusidinsäure bestand, Nachdem nach weitere 4 Stunden gertthrt worden war, wurde der Niederschlag abfiitriert, mit Wässer und Bensol gewaschen und hierauf getrocknet. Das lehprodurt wurde in Nethylenohlorid gelöst und filtriert zmd die JZmmg wurde in Vakuum zur trockene ein- gedampft. Der täiotstead wurde in heißes Miethanoi gelöst und beim lbklxälen auf 000 kristallisierte ein Nethanol- aolvat aas, das abfiltriert, mit eiskaltes Methanol ge- xasehen und dann getrocknet wurde, wodurch ein farbloses 1Vthanelsolvat ton Pusidinsäure erhalten wurde. Hein 2roclmen dieses ßolvats 3.a Vakuum bei einem Druck renn 0,01 ms RS und einer feaperatur von 10000 bis zur Oewiehtstenstanz wurde das von Lösungsmittel freie Produkt mit einem 1g. von 191 bie 192°0 erhalten, das im üR-Spek- trum starke Hunden bei 12b5, 1385, 1695. 1730 und 3$50 ei 1 (13r) zeigte. Herstell»g de: Nrtri#msalsee von rusidinet?ure In einem PPeraentatiansgefio aus rostfreie= Stahl, das einem Inhalt vom 1,5 a3 hatte und mit einex Mrer ansge- atattet war, wurden 1,00 a3 eines Kulturmediums der fol- genden Zuseamnsetztmg hergestellt t Glucose 20"0 kg 1Pleleeh- und Knochenmehl 20,0 kg Maisquellwasser, 50 % Trocken$ubstanz 2,5 kg Specköl @ 20,10 kg Naal 490 kg xgso$ 0,05 kg Leitungswasser ad 1000 3riter Das Kulturmedium hatte einen pH-Vert Ton 6,1, der mit Hilfe Ton verdünnter Natronlauge auf 6,5 erhöht wurde; dann wurde das Medium durch Erhitzen sterilisiert. Nach den Ab- kühlen wurde es mit 3 1 einer Kultur fron Cephalosporium lamellaecola F.$.Mith-F.B.Salth, die 48 Stunden lang in einer Schüttelflasche bei einer Temperatur vau 2700 gezüch- tet worden war, angelmpft. Der Inhalt des Permentatiensge- fäBes wurde gerührt und bei 27°t? 96 Stunden lang mit 0,6 m3 Luft/Stunde belüftet. Während dieses Zeitraumes wurde ein pH-idert von 7,0 aufrechterhalten. Nach der Permentations- periode wurde festgestellt, daß die antibiotische Aktivi- tät des Kulturmediums, bestimmt nach der üblichen Agar- sohalen-Hethode mit Staph'locooeus sureus, einem Gehalt von 150 mg Pusidinsäure pro Liter entsprach, wenn als Ver-- gleiohsbasis die Aktivität des reinen Stoffes, nach der gleichen Methode bestimmt, verwendet wurde. Das Nyoel wurde von dea Kulturmedium durch Filtrieren abgetrennt, wobei die Menge an Filtrat 700 1 betrug. Der pH-Wert des giltrate$ Wurde durch Zusatz von 25 Eiger Schwefelsäure auf 6,0 eingestellt und dann wurde das liltrat mit 2°0 1 Butylaoetat in einem Pod- bielniak-Bztraktor im Gegenetroa extrahiert. Die dabei erhaltene Butylaoetatphase wurde mit einem Anteil von 77 1 Wasser, dem 10 %i ge Natronlauge bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 11,0 zugesetzt Wurde, extrahiert , und dann wurde die wäßrige Phase von der Butylaeetat- phase getrennt. Der pH-Wert der wäßrigen Phase wurde durch Zusatz von 25 $iger Schwefel säure auf 9,3 einge- stellt, und die Lösung Wurde in einem Vakuumeindampfer auf ein Volumen von 5 1 eingeengt. Durch Zusatz von 0,5 1 Benzol und Einstellung des pE-Wertes der wUBrigen Phase auf 3,0 mit Hilfe von Salzsäure unter Rohren wurde ein Niederschlag gebildet, der aus dem Benzolsolvat fron 7'uei- dinsäure bestand. Nach 5-stündi gem Rühren wurde dieser Niederschlag abfiltriert, mit Wasser und Benzol gewaschen und getrocknet. Durch ümkristallisieren aus Benzol wurden 72 g des Stoffes mit einem Pp, ton 187 bis 189o0 erhalten. 20 g des auf diese Weise geronnenen Benzolsolvats wurden in 800 s1 Nanser suspendiert und zu der Suspension wurde 0,5 n#Natrenlauge bis zum Erreichen einen pH-Wertes von 9,0 zugesetzte Die Lösung wurde filtriert und das Piltrat mit 2000 ml n-Butanol versetzt, worauf der Wasser- gehalt der Lösung durch azeotrope Destillation im Vakuum entfernt Wurde. Aue dem Rückstand wurde das gewünschte Natriuasala durch Zurats von äther ausgefällt. In wurde abfiltriert, mit Xther gewaschen und hierauf getrocknet. Durch Uakristallisieren aus äthanol/loeton wurden 14,4 g des reinen, kristallinen latriussalses erhalten.
Claims (1)
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P a t e n t a n, a D r ti c -h e 1. Verfahren zur Herstellung von antibiotisch aktiver Fusidinsäure oder ihren Balzen, dadurch g e ä e n n - s e i o h a e t , Saß eine Speoies der Gattung gepha- losporiua, die 7bsidinsäure bildet, unter aeroben Be- dingungen In einem fragen Nährmedium bebrütet wird, das eine tohleustoffquelle, wie Kohlehydrate und Lipoide, Stickstoffquellen md geeignete Xeagen der anorganischen Balze und anderen Stoffe, die für die Braährung des Pilzes erforderlich sind, entbält, und die Penentation so lange durohgefUhrt wird, bis die genannte Lösung eine wesentliche aatibiotisehe Aktivität aufweist, und denn die auf diese Weise gebildete Pnaädinsäure geronnen, konzentriert und in reiner form isoliert oder mit Hilfe von an sich bekann- ten Unsetsungea in eines ihrer Salze übergeführt wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n - s e i o h n e t , Sao ein ?eil der in des Nährmedium ent- haltenen Stickstoffquelle aus fetten oder Fettsäuren be- steht. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e ken n - s e i o h n e t , Sao die Stickstoffquelle einen oder meh- rere Stoffe aus der Gruppe Maisquellwasser, So jabomenmehl, Casein oder andere Nilohprodukte und ]Fleisch- und Knochen- sohl enthält Sand die ?ernemtation subsers bei einer Tempe- ratur :wischen etwa 20 und 3000 und .während eines Zeit- range s von etwa 2 bis 7 f aipn durchgeführt wird, Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e i e n n - s e i o h n e t , da£ das Nährmedium eine assiailierbare Stiohstoffquelle in einer Menge entsprechend 0"01 bis 195 % Stickstoff enthält.
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