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Verfahren zur Gewinnung von Antibiotica
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Antibiotica aus Kulturen von Streptomyceten in flüssigen Nährboden unter aeroben Bedingungen ; im besondern bezieht sich die Erfindung auf die Gewinnung und Trennung von Oxytetracyclin und Vengicid.
Ein Verfahren zur Gewinnung von Oxytetracyclin auf biochemischem Wege ist beispielsweise in der USA-Patentschrift Nr. 2, 516, 080 und in der brit. Patentschrift Nr. 684, 417 beschrieben worden. Für die Gewinnung hat man den Actinomycetenstamm Streptomyces rimosus angewendet. Es ist bekannt, dass dieser Mikroorganismus auch ein Fungicid abscheidet. (Antibiotics & Chemotherapy 1 (1951), 289-290).
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht demgegentiber darin, dass ein Stamm von Streptomyces vendargensis (nov. spec.) in einer üblichen Nährlösung bei einem PH von 5, 0 bis 8, 0 und einer Temperatur von 20 bis 350 C solange submers gezüchtet wird, bis das Kulturmedium eine erhebliche antibiotische Wirksamkeit aufweist, wonach die gebildeten Antibiotica Oxytetracyclin und Vengicid aus dem Kulturfiltrat in an sich bekannter Weise abgetrennt und von einander getrennt werden.
Der bisher unbekannte Stamm, der von der Anmelderin Streptomyces vendargensis (nov. spec.) genannt wurde, ist unter diesem Namen im Central Bureau voor Schimmelcultures in Baarn (Holland) hinterlegt.
Auf Grund der folgenden Beschreibung dieses neuen Stammes wurde Streptomyces vendargensis (nov. spec.) laut Bergey's"Manual of Determinative Bacteriology" (1948) als ein Actinomycet klassifiziert.
Streptomyces vendargensis (nov. spec.) wurde aus einem Muster Erde aus Süd-Frankreich gezüchtet ; seine morphologischen und biochemischen Eigenschaften weichen stark von dem bekannten Streptomyces rimosus ab. In Tabelle I sind die Eigenschaften von Streptomyces vendargensis (nov. spec), gezogen auf verschiedenen Kulturböden, denjenigen des Streptomyces rimosus vergleichsweise gegenübergestellt. In der Tabelle wird das vegetative Mycel Kolonie genannt, während das sporogene Mycel als Luftmycel bezeichnet wird.
Tabelle I
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<tb>
<tb> Kulturmedium <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> Streptomyces <SEP> vendargensis
<tb> N. <SEP> R. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> 2234 <SEP> (nov. <SEP> spec.) <SEP>
<tb> Haiermehl <SEP> Agar <SEP> dunkelbraune <SEP> Kolonie <SEP> hellgelbe <SEP> Kolonie
<tb> (8/C <SEP> :
<SEP> Bracken <SEP> (11/ <SEP> )
<tb> dunkie <SEP> Verfärbung <SEP> des <SEP> keine <SEP> Verfärbung <SEP> des
<tb> Nährmediums <SEP> Nährmediums
<tb> kleine <SEP> Menge <SEP> weisses <SEP> kein <SEP> Luftmycel
<tb> Luftmycel
<tb> erdiger <SEP> Geruch <SEP> kein <SEP> Geruch
<tb>
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EMI2.1
<tb>
<tb> Kulturmedium <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> Streptomyces <SEP> veadargensis
<tb> N. <SEP> R. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> 2234 <SEP> (nov. <SEP> spec.)
<tb> Emerson <SEP> Agar <SEP> dunkelbraune <SEP> Kolonie <SEP> hellbraune <SEP> Kolonie
<tb> (15/A12 <SEP> :
<SEP> gebrannter <SEP> Amber) <SEP> (13/dus)
<tb> dunkle <SEP> Verfärbung <SEP> des <SEP> keine <SEP> Verfärbung <SEP> des
<tb> Nährmediums <SEP> Nährmediums <SEP>
<tb> kleine <SEP> Menge <SEP> weisses <SEP> reichliches <SEP> Luftmycel
<tb> Luftmycel
<tb> kein <SEP> Geruch <SEP> kein <SEP> Geeruch
<tb> Sabouraud <SEP> Agar <SEP> schwarzbraune <SEP> Kolonie <SEP> gelbe <SEP> Kolonie
<tb> (16/cl <SEP> :
<SEP> Rodent) <SEP> (12/E3)
<tb> dunkle <SEP> Verfärbung <SEP> des <SEP> keine <SEP> Verfärbung <SEP> des
<tb> Nährmediums <SEP> Nährmediums
<tb> reichliche <SEP> Menge <SEP> kleine <SEP> Menge <SEP>
<tb> gelbweisses <SEP> Luftmycel <SEP> weisses <SEP> Luftmycel
<tb> stark <SEP> erdiger <SEP> Geruch <SEP> kein <SEP> Geruch
<tb> Kartoffel <SEP> Agar <SEP> wenig <SEP> entwickelt, <SEP> wenig <SEP> entwickelt,
<tb> bran <SEP> bis <SEP> violette <SEP> bräunliche <SEP> Kolenie
<tb> Kolonie
<tb> keine <SEP> Verfärbung <SEP> des <SEP> keine <SEP> Verfärbung <SEP> des
<tb> Nährmediums <SEP> Nährmediums
<tb> kleine <SEP> Menge <SEP> weisses <SEP> kein <SEP> Luftmycel
<tb> Luftmycel
<tb> leichter <SEP> erdiger <SEP> Geruch <SEP> kein <SEP> Geruch
<tb> Natriumcitrat <SEP> graugrüne <SEP> Kolonie <SEP> weisse <SEP> Kolonie
<tb> Agar <SEP> (3/A1-13/Js)
<SEP> (2/A <SEP>
<tb> keine <SEP> Verfärbung <SEP> des <SEP> keine <SEP> Verfärbung <SEP> des
<tb> Nährmediums <SEP> Nährmediums
<tb> kein <SEP> Luftmycel <SEP> kein <SEP> Luftmycel
<tb> Verwesungsgeruch <SEP> kein <SEP> Geruch
<tb> Glukosenitrat <SEP> braun <SEP> bis <SEP> mauve <SEP> Kolonie <SEP> hellgelbe <SEP> Kolonie
<tb> Agar <SEP> (13/K9) <SEP> (10/B1) <SEP> austemweiss
<tb> gelbe <SEP> Verfärbung <SEP> des <SEP> keine <SEP> Verfärbung <SEP> d''s <SEP>
<tb> Nährmediums <SEP> Nährmediums <SEP>
<tb> kein <SEP> Luftmycel <SEP> kein <SEP> Luftmycel
<tb> starker <SEP> erdiger <SEP> Geruch <SEP> kein <SEP> Geruch <SEP>
<tb> Kartoffelscheiben <SEP> gutentwickelte <SEP> gelbe <SEP> seht <SEP> gut <SEP> entwickelte
<tb> Kolonie <SEP> gelb <SEP> bis <SEP> braume <SEP> Kolonie
<tb> (12/E5) <SEP> (12/D5-13/L7)
<tb> kleine <SEP> Menge <SEP> weisses <SEP> reichliches <SEP> weisses
<tb> Luftmycel <SEP> Luftmycel
<tb> Stärke <SEP> Agar <SEP> braune <SEP> Kolonie <SEP> helle, <SEP> fast <SEP> farblose
<tb> Kolonie
<tb> gelb-braune <SEP> Verfärbung <SEP> keine <SEP> Verfärbung <SEP> des
<tb> des <SEP> Nährmediums <SEP> Nährmediums
<tb> kleine <SEP> Menge <SEP> weisses <SEP> weisses <SEP> Luftmycel
<tb> Luftmycel
<tb> erdiger <SEP> Geruch <SEP> kein <SEP> Geruch
<tb>
Die Daten in Klammern in dieserTabelle sind die Farben laut"ADictionary of Color" von A.Mäerz und M. Rea Paul, Z. Druck 1950.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die Kolonien des Streptomyces rimosus auf den meisten Nährmedien dunkler sind als von Streptomyces vendargensis (nov. spec.). Ein kennzeichnender Unterschied ist
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der Geruch. Während Streptomyces rimosus einen mehr oder weniger starken Geruch auf den meisten Nährmedien entwickelt, verbreitet Streptomyces vendargensis (nov. spec). keinen oder fast keinen Geruch.
Wenn man die Luftmycelien der beiden Actinomycetenarten vergleicht, erscheint dasjenige von Streptomyces rimosus fast immer in geschlossenen Spiralen, während dasjenige von Streptomyces vendargensis (nov. spec.) keine Spiralen auf den verschiedenen Nährmedien bildet. Streptomyces vendargensis (nov. spec.) bildet büschelf0rmige Kolonien("tuft type" cf. S.A. Waksman, The Actinomycetes 1950).
Es wurde gefunden, dass Actinomyces vendargensis (nov. spec.) unter geeigneten Kulturbedingungen
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dern auch andere Antibiotica bildet.
Einer dieser andern antibiotischen Stoffe ist ein fungicider Stoff, welcher Vengicid genannt wurde.
Vengicid weicht sowohl in seinen chemischen als auch in seinen biochemischen Eigenschaften von dem vom Streptomyces rimosus gebildeten fungiciden Stoff ab. Vengicid ist ein weisser, kristallinischer Stoff, von amphoterem Charakter. Seine Wasserlöslichkeit bei Zimmertemperatur ist gering, und zwar ungefähr 0, 4 mg/cm3. Es ist auch in geringem Mass löslich in organischen Lösungsmitteln ; wie Aceton, Methanol, Butanol, und Amylalkohol, jedoch fast unlöslich in Diäthyläther. Der PH- Wert der gesättigten Lösung in Wasser ist ungefähr 6, 3. Der Schmelzpunkt beträgt 241, 5 - 243 C und die spezifische Rotation des reinen Stoffes ist [ a] = 51, 6 in 0, 1 n-Salzsäure. Das Molekulargewicht des Stoffes ist ungefähr 600.
Die empirische Formel ist wahrscheinlich : C N. Die chemische Analyse des reinen Stoffes ergab : C 47, 05%, H 4, 85%, N 23,25% und O 24, 85% (berechnet). In dem Ultraviolett-Absorptionsspektrum fand man Maxima bei 233,5 mou und 273,5 mou (Lösung in 0, 05 n-Salzsäure). Mit einer Suspension in Paraffinöl (bekannt als"Nujol") bzw. fn Hexachlorbutadien wurden die nachfolgenden kennzeichnenden Absorptionsbande im infraroten Absorptionsspektrum gemessen in reziproken Zentimetern : 2920,2240, 1650,1580, 1485,1450, 1365,1320, 1250,1200, 1040,985, 910,885 (siehe Fig. 1 und 2).
Die biologisch aktiven Stoffe können von dem Kulturfiltrat des Streptomyces vendargensis (nov. spec.) mittels Papierchromatographie getrennt werden. Wenn die Chromatographie bei 260 C auf Eaton-Dikeman Papier Nr. H. 613 mit Hilfe eines Elutionsmittels der folgenden Zusammensetzung : 600 cm3 wassergesät-
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8 cm3Vengiclds 0, 45 ; unter denselben Umständen hat der fungizide Stoff aus Streptomyces rimosus einen Rf Wert von 0, 70.
Nach papierchromatographischen Trennungen bei einer Temperatur von 200 C auf demselben Papier, aber mit einem andern Elutionsmittel, wurden Rf Werte von 0,45 bzw. 0, 31 gefunden. In diesem Fall war das gewählte Elutionsmittel die oberste Schicht eines Gemisches von 4 Teilen Butanol, 1 Teil Äthanol und 5 Teilen Wasser.
Mittels der Papierchromatographie wurde ebenfalls gefunden, dass Streptomyces vendargensis (nov.
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teren zeigte sich, dass das Kulmrfiltrat des Strepujmyces vendargensis (nov. spec.) zwei Antibiotica enthält, welche nur wenig Stabilität in einem sauren Medium zeigen und welche einen Rf Wert von 0, 05- 0, 13 haben (bei 200 C, Lösungsmittel : oberste Schicht aus Butanol, Äthanol und Wasser in dem Verhältnis < 1 : 1 : 5). Diese Antibiotica zeigen einen verzögernden Effekt auf das Wachstum von u. a. Saccharomyces.
Diese Stoffe werden in den Kulturfiltraten des Streptomyces rimosus nicht gefunden.
Die Tabelle H gibt eine Übersicht der antibiotischen Wirksamkeit von Vengicid auf verschiedene Mikroorganismen. Ausserdem wird zum Vergleich der Effekt des Fungicids von Streptomyces rimosus (Rimocidin) gezeigt :
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Tabelle. Il Medium : Pepton Agar-1-1 la Glukose
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<tb>
<tb>
5 <SEP> y.'Vengicid <SEP> Rimocidin
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> - <SEP> Blastomyces <SEP> sulfureux <SEP> + <SEP> : <SEP>
<tb> Blastomyces <SEP> dermatitidis <SEP> +
<tb> Hormodendfdm <SEP> compactum <SEP>
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> +
<tb> Trichophyton <SEP> menCMgrophytes <SEP> ATCC <SEP>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP>
<tb> Saccharomyces <SEP> cers-visie <SEP> N <SEP> 34 <SEP> - <SEP> oe <SEP>
<tb> Cladosporium <SEP> cucumerinum <SEP> - <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> spec. <SEP> - <SEP> : <SEP> : <SEP>
<tb> Verticillium <SEP> dahliae
<tb>
- Inaktiv * aktiv
Es stellte sich heraus, dass der neuentdeckte Actinomycet ausserordenalich geeiguer für die Hersteilung von Qxytetracyclin und Vengicid ist.
Es ist selbstverständlich, dass die Erfindung nicht nur die Verwendung des neuen Streptomycessiammes, dessen Eigenschaften hier aufgeführt sind, umfasst, sondern auch die Mutanten von Streptomyces vendargensis (, tov. spec.) welche daraus mittels Methoden oder Stoffen, welche Mutation verursachen, wie Strahlung oder Behandlung mit toxischen Stoffen, erhalten werden können, einschliesst. Die Antibiotica Oxytetracyclin und Vengicid werden hergestellt, indem man Streptomyces vendargensis (nov. spec.) aerob züchtet und die aktiven Stoffe von der in dieser Weise erhaltenen Kultur trennt.
Streptomyces vendargensis (nov. spec.) wird vorzugsweise als eine Tauchkultur in einem flüssigen Nährmedium unter sterilen Verhältnissen in geschlossenen Gefässen gezüchtet, welche Gefässe mit Rührorganen versehen sind, und in welche zwecks Belütung steriler Sauerstoff oder Luft während der Züchtung eingeführt werden kann. Die Zeit, während der die Züchtung stattfindet, die Temperatur und die andern Bedingungen, welche man beobachten muss, um gute Ausbeuten an Antibiotica zu erhalten, werden im folgenden genauer beschrieben.
Das Nährmedium soll einen Kohlenstofflieferanten und einen organischen oder anorganischen Stick- stofflieferanten enthalten und die Anwesenheit von Mineralsalzen, wie Phosphaten, Kalium- und Natriumsalzen und Spuren verschiedener Metalle ist erwünscht. Öfters aber sind die Ausgangsstoffe, die in der Praxis gebraucht werden, schon genügend mit diesen Mineralsalzen verunreinigt, so dass es sich erübrigt, sie speziell hinzuzufügen.
Als Kohlenwasserstofflieferanten können sowohl lösliche als auch unlösliche Kohlehydrate, wie Glukose, Saccharose, Laktose oder Stärke verwendet werden. Zuckeralkohole, wie Glycenn, sind auch geeignet. Die Menge des Kohlenstofflieferanten in dem Medium kann sehr verschieden seiu, was von der Art des verwendeten Kohlehydrates und der weiteren Zusammensetzung des Mediums abhängt; gewöhnlich beträgt sie ungefähr 0, 5 bis 5 Gew.-% des Mediums.
Als Stickstofflieferanten für die Gewinnung der Antibiotica nach der Erfindung, kann eine grosse Anzahl Stoffe verwendet werden. Zu erwähnen sind hydrolysiertes oder nichthydrolisiertes Kasein, Maisquellflüssigkeit (corn steep liquor), Pepton, Fleischextrakt, Fischextrakt, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Nitrate. Gewöhnlich hängt es von der Ergiebigkeit und der weiteren Zusammensetzung des Mit-
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ckstofflieferant fürStellung gewählt wird.
Kleine Mengen stickstoffhaltiger Grundstoffe, wie Hefeextrakt, "distiller's solubles" usw., können auch eine bedeutende Steigerung der Ausbeute herbeiführen.
Die Fermentationsdauer hängt von der Zusammensetzung des Nährmediums ab. Gewöhnlich schwankt sie zwischen 7 nnd 96 Stunden. aber die Fermentation kann erwUnschtenfalls auch längere Zeit fortgesetzt werden, wenn die gesteigerte Ausbeute an Antibiotica, welche in dieser Weise erreicht wird, die höheren Kosten eines längeren Fermentationszyclus rechtfertigt.
Die Temperatur, bei welcher die Fermentation ausgeführt wird, kann zwischen 20 und 350 C liegen.
Bevorzugte Temperaturen liegen zwischen 26 - 280 C.
Für ein optimales Wachstum des Organismus und eine optimale Ausbeute an Antibiotica soll der PH-Wert während der Fermentation innerhalb ziemlich engen Grenzen gehalten werden, z. B. zwischen
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PH 5, 0 unf 8, 0. Nach der Sterilisation wird das Nährmedium auf einen PH-Wert zwischen 6 und 7 eingestellt. Die Fermentation wird vorzugsweise bei einem PH zwischen 6, 5 und 7,3 ausgeführt da die Erfahrung gezeigt hat, dass die höchste Ausbeute bei diesem PH erzielt wird. Der pH-Wert kann während der Fermentation konstant gehalten werden, indem man Alkalihydroxyd unter sterilen Bedingungen in re-
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Mengen von 0, 2 bis 1, 0 Gew. % des Nährmediums gebraucht.
Die Luftmenge, welche dem Nährmedium in steriler Weise während der Fermentation zugeführt wird, hängt von der Form des Gefässes, der Geschwindigkeit und der Form der Rührorgan ab. Gewöhnlich liegt diese Menge zwischen 0, 5 und 41 pro 1 Nährmedium pro Minute.
Das Impfmaterial, das vorzugsweise in dem Hauptfermentationsgefäss gebraucht wird, besteht aus einer 48 bis 72 Stunden alten Vorkultur des Streptomyces vendargensis (nov. spec.). Um gute Ausbeuten zu erhalten und Schwankungen in den Resultaten vorzubeugen, wird die Impfung vorzugsweise mit Mengen einer Kultur, welche 3 - 6 Vol. % des Nährmediums in dem Hauptfermentationsgefäss betragen, ausgeführt.
Es ist klar, dass bei grossen FermentationsgefäI3en eine Anzahl Stufen von Vorkulturen verwendet werden müssen. Es ist aber auch möglich, eine Menge der Kultur, z. B. 10% in dem Hauptfermentationsgefäss, für die Einleitung einer neuen Kultur aufzubewahren. Der ganze Fermentationsprozess kann auch kontinuierlich durchgeführt werden.
Für die Isolierung der Antibiotica aus einer Kultur, deren Fermentation sich vollzogen hat, kann man verschiedene, für solche Stoffe übliche, Methoden anwenden. Vorzugsweise wird die Kulturflüssigkeit, deren Fermentation sich vollzogen hat, bevor man mit der eigentlichen Isolierung anfängt, auf einen
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keit filtriert oder zentrifugiert, um das Mycel zu entfernen. Wenn die Flüssigkeit nicht angesäuert wird, geht 20-25% der vorhandenen Oxytetracyclinmenge verloren.
Nachdem das Mycel und alle andern festen Bestandteile aus derFermentationsflüssigkeit entfernt worden sind, können die Antibiotica an Aktivkohle bei einem PH-Wert von ungefähr 7 adsorbiert werden.
Daraufhin werden sie bei einem PH-Wert von ungefähr 1, 5 mit Hilfe eines Alkohols, der teilweise mit Wasser mischbar ist, wie Butanol eluiert. Die Elution wird vorzugsweise mit einem Gemisch von Butanol, Wasser und Phenol durchgeführt. N ach Konzentration des Eluats durch Verdampfung der Lösungsmittel im Vakuum wird die Flüssigkeit mit einem Alkohol, der unmischbar oder teilweise mischbar mit Wasser ist, wie Butanol oder Amylalkohol, bei einem pH-Wert von ungefähr 9 extrahiert. Von der Lösung der Antibiotica in, z. B. Butanol, die in dieser Weise erhalten wurde, kann man nun eine wässerige Lösung der Antibiotica erhalten, indem man mit Wasser bei einem PH von ungefähr 2 extrahiert.
Aus dieser Lösung kann das Cxytetracyclin, erwünschtenfalls nach Konzentration, in bekannter Weise (siehe belgische Patentschrift Nr. 506. 950) mit Hilfe von Magnesiumchlorid und einem quarternären Ammoniumsalz, wie Hexadecyltrimethylammoniumchlorid. bei einem PH von ungefähr 9, gefällt werden.
Die Fällung kann leicht weiter zu reinem Oxytetracyclin oder dessen salzsaurem Salz aufgearbeitet werden. Obgleich Vengicid, ebenso wie Oxytetracyclin ein Stoff mit einem amphoteren Charakter ist, wird es mit einer quarternärenAmmoniumbase nicht gefällt. Das Vengicid kann daher aus dem Filtrat der obenerwähnten Fällung des Oxytetracyclins erhalten werden. Zu diesem. Zweck kann das Filtrat z. B. mit Butanol bei einem pH-Wert von ungefähr 9 extrahiert und die in dieser Weise erhaltene butanolische Lösung des Vengicids kann wiederum mit Wasser bei einem pH-Wert von ungefähr 2 extrahiert werden. Nach gegebenenfalls durchgeführter Konzentration wird Vengicid in kristallinischer Form erhalten, indem man die wässerige Lösung auf einen pH-Wert zwischen 4, 0 und 5, 0 einstellt.
Das mycelfreie Kulturfiltrat kann auch-gegebenenfalls nach Konzentration durch Einengung-direkt mit einem Alkohol von der Butanol-oder Amylalkoholgruppe bei einem PH ungefähr 9 extrahiert werden. Die in dieser Weise erhaltene Lösung der Antibiotica kann dann mit Wasser bei einem PH von ungefähr 2 nochmals extrahiert werden.
Wenn die wässerige Lösung der Antibiotica auf die erwünschte Stärke gebracht ist, wird das Oxytetra-
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aus dem Filtrat erhalten.
Nach einer bevorzugteiiausführungsforrn wird ein handelsüblicher Ionenaustauscher mit einem schwach sauren Charakter, z. B."Duolite S 30", ein synthetisches Harz auf Phenolbasis der Chemical Process Com-
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schwach sauren Ionenaustauscher adsorbiert werden würde, da normalerweise, wenn Ionenaustauscher für die Adsorption von amphoteren Stossen gebraucht werden. Austauscher mit entweder stark sauren oder stark basischen Eigenschaften für nötig gehalten werden. Für die Isolierung der Antibiotica mit Hilfe von
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"Duolite S 30", wird das von Mycel befreite Kulturfiltrat bei einem PH von ungefähr 2, 5 durch eine mit dem erwähnten Austauscher gefüllte Säule geführt.
Wenn die Höhe der Säule und die Menge des durchzuführenden Kulturfiltrats geeignet gewählt werden, kann man die Adsorption derartig verlaufen lassen, dass
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kann dan entweder durch Adsorption an Aktivkohle oder durch direkte Extrahierung z. B. mit Butanol bei einem geeigneten p Wert erhalten werden. Das adsorbierte Oxytetracyclin wird mit Alkalihydrod eluiert und kann weiter in bekannter Weise zu reinem Oxytetracyclin aufgearbeitet werden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert :
Beispiel l : Von einer Agarkultur des Streptomyces vendargensis (nov.spec.) z.B. auf Emerson's Agar, auf welcher gute Sporulation stattgefunden hat, werden kleine Mengen Conidien in steriler Weise in Schüttelflaschen von ungefähr 2 l Inhalt, in welche 500 cm3 flüssiges Mährmedium gefüllt wurden, überimpft.
Das Medium besteht aus :
Malzextrakt (Balling 12) 10 0/0
Pepton 1 %
Kochsalz 0, 5%
Nach 48 Stunden Inkubation bei 26 C, während welcher Zeit das Medium andauernd geschüttelt wird, wird der Inhalt von zwei Schüttelflaschen in einem Fermentationsgefäss geimpft, welches Gefäss 15 1 des
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i. s Sojabohnenmehl2%
Kartoffelstärke 1%
Nach Sterilisation wird dieses Medium mit sterilem Kaliumhydroxyd auf ein pH von 7, 0 eingestellt.
Man lässt die Kultur 72 Stunden bei 27 C unter fortwährendem Belüften und Rühren wachsen. Am Ende dieser Periode enthält das Gefäss 195 y Oxytetracyclin pro cm3.
Beispiel 2 : Von einem Röhrchen mit Impfmaterial wie in Beispiel 1 beschrieben, werden 500 cm3 Nährmedium der folgenden Zusammensetzung geimpft.
Pepton 0,5 go
Eingeengte Maisquellflüssigkeit (corn steep liquor) (45 % Trockensubstanz) 0, 6 % Glukose 1 U ; o
Kolchsalz1%
Das Medium wird mit Kaliumhydroxid auf ein H 7, 0 eingestellt.
Nach 48 Stunden Inkubation bei 26 C unter fortwährendem Schütteln wild die ganze Kultur in ste-
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zum Einblasen steriler Luft versehen ist und welches Gefäss 15 1 eines Kul@@@ediums der folgenden Zusammensetzung enthält : Erdnussmehl 2 Kartoffelstärke
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Das Medium wird mit Kaliumhydroxyd auf ein PH 7, 0 eingestellt.
Nach 48-stündiger Inkubation bei 280 C unter fortwährendem Belüften und Rühren hat sich 180 y
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: 1000 cm3 desriales werden in steriler Weise in ein geschlossenes Gefäss gebracht, welches mit einem Rührer und einer Anordnung zum Durchblasen steriler Luft versehen ist. Dieses Gefäss enthält 15 1 eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung :
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hat sich 475 y Oxytetracyclin und 270 y Vengicid pro cm3 gebildet.
Beispiel 4 : 500 cm3Impfmaterial werden, wie in Beispiel 3, in 151 einer KultUrflüssigkeit fol- gender Zusammensetzung gebracht :
Getrocknete Hefe 3 %
Kochsalz 0, 5%
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Nach 5-tägiger Inkubation bei 260 C unter Rühren und Lüftung, zeigt die Analyse, dass sich 443 y Oxytetracyclin und 210 y Vengicid pro cm3 der Kulturflüssigkeit gebildet haben.
Be isp ie 1 5 : 750 cm3 impfmaterial werden in steriler Weise in ein Nährmedium folgender Zusam- mensetzung gebracht.
Getrocknete Hefe 3 0/0
Kochsalz 0, 5 0/0
Ferrosulfat 0, 005 %
Glukose l %
Calciumcarbonat 0, 5 0/0
Nach 96-stündiger Inkubation unter aeroben Bedingungen zeigt die Analyse, dass die Kulturflüssig keit 413 y Oxytetracyclin und 211 Mikrogramm Vengicid enthielt.
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6 ; 101 der nach Beispiel 3 erhaltenen Flüssigkeit, deren Fermentation sich vollzogen hat,lisierende Flüssigkeit, die, nach einigem Stehen bis zum Klarwerden, durch ein oder mehrere Filter filtriert wird. Die Filter sind mit einem Filtrierhilfsmittel versehen, welches im Handel als Filtrapid bekannt ist. Das klare Filtrat wird mit Hilfe von Natriumhydroxyd auf ein PH von 7,3 eingestellt und während 15 Minuten mit 100 g Aktivkohle gerührt.
Das Adsorbens wird daraufhin durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Die lufttrockene Kohle, an welcher die Antibiotica
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einementhält diese Flüssigkeit jetzt 3, 8 g Oxytetracyclin (800/0 der ursprünglichen Menge) und 2,56 g Vengicid (95 % der ursprünglichen Menge).
Das konzentrierte Eluat wird mit Natriumhydroxyd auf ein PH von 9, 5 eingestellt und viermal mit 0,75 1 Butanol extrahiert. Der butanoliscÌ1e Extrakt wird mit Salzsäure auf ein PH von 2,0 eingestellt und fünfmal mit 0, 751 Wasser extrahiert. Die in dieser Weise erhaltene wässerige Lösung enthält 2,85 g Oxytetracyclin und 2, 31 g Vengicid. Diese Lösung wird mit Natriumhydroxyd auf ein Pt. von 2, 5 eingestellt und in einem Rückflussverda : npfer auf ungefähr 1400 cm3 konzentriert, d. h. auf eine Konzentration von ungefähr 2 mg Oxytetracyclin pro cm3.
Dieser konzentrierten Lösung werden der Reihe nach 112 cm3 einer 0,1 molar Lösng von Magnesiumchlorid, 5, 6 cm3 einer 50 longen Lösung von Zitronensäure und 14 g einer 33 %igen Lösung von Hexadecyltrimethylammoniumchlorid zugefügt. Daraufhin wird die Lösung mit Natriumhydroxyd auf ein PH von 9, 0 eingestellt. Die flockige Fällung, die ungefähr 98 % des in der Flüssigkeit anwesenden Oxytetracyclins enthält, wird filtriert und im Vakuum bei 40 - 450 getrocknet.
Diese Fällung wird jetzt fünfmal mit ungefähr 13 cm3 Methanol extrahiert. Dem methanolischen Extrakt werden 3, 5 cm3 konzentrierte Salzsäure (spez. Gew. l, 19) zugefügt, worauf das Hydrochlorid des Oxytetracyclins spontan auskristallisiert. Ausbeute. 2, 2 g. Das Filtrat der Fällung des Oxytetracyclins mit
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trahiert. Die wässerige Lösung wird mit Natriumhydroxyd auf ein PH von 2, 5 eingestellt und in einem Rückflussverdampfer im Vakuum auf ungefähr 100 cm3 konzentriert. Dann wird sie mit Natriumhydroxyd auf ein PH von 4, 5 eingestellt. Vengicid kristallisiert als gelbe Kristallmasse aus. Ausbeute : 1, 9 g. Durch
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klinisch.
Die Abmessungen des Elementargitters sind laut Messungen mit Röntgenstrahlen : a = 6, 6 Ä ; b = 19,1 ; C = 5, 2 Ä ; ss = 1040
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Beispiel 7 : 101 der nach Beispiel 3 erhaltenen Flüssigkeit, deren Fermentation sich vollzogen hat, werden mit konzentrierter Salzsäure unter Rühren auf ein PH von 2, 2 eingestellt. Nach halbstündigem Rühren wird die Flüssigkeit mit Hilfe einer Sharpless Zentrifuge zentrifugiert. Die opali3ierende
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ist mit Natriumhydroxyd regeneriert worden ; vor jedem Gebrauch wird sie mit ungefähr 1250 cm3 eines 0, 5 molaren Azetatpuffers mit pH 4, 5 und anschliessend mit 400 cm3 Wasser gewaschen. Nachdem das Kulturfiltrat durch die Säule geführt wurde, wird es wiederum mit 400 cm3 Wasser gewaschen.
Das Filtrat enthält nun ungefähr 90 % Vengicid, während das Oxytetracyclin quantitativ adsorbiert worden ist.
Die Ausscheidung des Vengicids findet weiter genau nach Beispiel 6 statt, d. h., es wird an Aktivkohle ad-
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Lösung enthält nunmehr, wie eine mikrobiologische Prüfung zeigte, 4, 27 g Oxytetr3cyclin (d. h. 90 eo der ursprünglichen Menge). Die Lösung wird mit Butanol bei pH 9, 5 extrahiert. Der In dieser Weise erhaltene Butanolextrakt wird im Vakuum auf ungefähr 3000 cm3 konzentriert. Die Lösung enthält nunmehr 3, 2 g Oxytetracyclin. Diese Menge wird mit Hilfe der quarternären Ammoniumbase quantitativ gefällt, und weiter genau wie in Beispiel 6 beschrieben, gereinigt. 2, 6 g des kristallinischen. Hydrochlorids des Oxytetracyclins werden erhalten.
Beispiel 8 : 121 der nach Beispiel 3 erhaltenen Flüssigkeit, deren Fermentation sich vollzogen hat, werden mit konzentrierter Salzsäure unter Rühren auf einen PH-Wert von 2, 2 eingestellt und nach halbstündigem Rühren zentrifugiert. Die opalisierende Flüssigkeit wird im Vakuum auf 1200 cm konzentriert und mit einem Filtrierhilfsmittel filtriert. Das klare Filtrat wird mit Natriumhydroxyd auf ein PH von 9,0 eingestellt und viermal mit 900 cm Butanol extrahiert. Die Butanol@osung wird mit Salzsäure aufeinpHvon2, 0eingestelltund fünfmal mit 1100 cm3 Wasser extrahiert.
Die wässerige Lösung enthält, wie eine mikrobiologische Analyse zeigt,4,50 g Oxytetracyclin (80% der ursprünglich anwesenden Menge) und 3, Olg Vengicid (93 i'o der ursprünglich anwesenden enge). Nach Konzentration im Vakuum auf ungefähr 1900 cm3 wird das Cxytetracyelin, nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren, mit einer quarternären Ammcniumbase und einem Erdalkalisalz gefällt. Das Vengicid wird aus dem Filtrat, genau wie in Beispiel 6 beschrieben, erhalten. Die Ausbeute an Oxytetracyclin beträgt 3, 2 g und diejenige an Vengicid 2, 2 g.
Beispiel 9 : 10 1 der nach Beispiel 3 erhaltenen Flüssigkeit, deren Fermentation sich vollzogen hat, werden mit Schwefelsäure unter Rühren auf ein PH von 2, 2 eingestellt und nach halbstündigem Rühren zentrifugiert. Die opalisierende Flüssigkeit wird im Vakuum auf 1000 cm3 konzentriert und daraufhin
EMI8.3
0biotica erhalten, welche bei mikrobiologischer Analyse einen Gehalt von 3,8 g Oxytetracyclin und 2, 4 g Vengicid zeigen. Dieser Extrakt wird im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 1, G 1 konzentriert. Die Lösung wird in ungefähr 6 Stunden durch vier Säulen "Duolite S 30" geführt. Die ersten drei Säulen enthalten je 30 g Duolite, während die vierte Säule 20 g Duolite enthält. Die Säulen, welche 30 g Adsorptionsmittel enthalten, sind 42 cm lang, die andere Säule ist 28 cm lang.
Das Verhältnis zwischen dem Durchmesser und der Länge ist ungefähr 1 : 15. Das Duolit in den Säulen wurde mit Natriumhydroxyd regeneriert und anschliessend mit 0, 1 n-Salzsäure gewaschen, bis das PH des durchfliessenden Waschwassers 2, 0 oder niedriger war. Nach Analyse der Säulen stellt sich heraus, dass das Oxytetracyclin und das Vingicid, wie folgt, über die Säulen verteilt sind :
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb> Säule <SEP> Oxytetracyclin <SEP> Vengicid
<tb> 1 <SEP> 1330 <SEP> mg <SEP> 96 <SEP> mg <SEP>
<tb> 21235 <SEP> mg <SEP> 138 <SEP> mg
<tb> 3 <SEP> 988 <SEP> mg <SEP> 173 <SEP> mg <SEP>
<tb> 4 <SEP> 235 <SEP> mg <SEP> 239 <SEP> mg <SEP>
<tb>
Die durchfliessende Flüssigkeit ist fast frei von Oxytetracyclin und enthält 1, 85 g Vengicid.
Diese Flüssigkeit wird im Vakuum auf. 100 cms konzentriert und anschliessend auf PH 4, 5 eingestellt. 1, 8 g Vengicid wird gefällt, welches mittels Lösung in 0, 25 n-Salzsäure und erneute Neutralisierung auf PH 4, 5 gereinigt wird.
Die Eluierung der Säule wird mit 0, 25 n-Natronlauge durchgeführt. Die vierte Säule wird nicht eluiert, sondern für die folgende Adsorption behalten. Für jede Säule braucht man 300 cms Natronlauge. Die gesamten Eluate werden mit konzentrierter Salzsäure auf ein PH von 2, 0 eingestellt, und im Vakuum auf 175 cms konzentriert. Diese Lösung enthält 20 mg Oxytetracyclin pro cm. Sie wird neutralisiert, wobei Oxytetracyclin ausfällt. Nach Filtration, Waschen mit Wasser und Trocknen wiegt diese Fällung 3, 7 g.
Sie enthält 3,4 g Oxytetracyclin. Die Fällung wird zur weiteren Reinigung in 27 cms Methanol suspen- disert. 4,5 cm3 konzentrierte Salzsäure (spez. Gew. 1, 9) werden der Suspension hinzugefügt. Das Oxytetracyclin wird in das Hydrochlorid übergeführt, während die Verunreinigungen sich lösen. Das salzsaure Salz des Oxytetracyclins wird mit Methanol-Salzsäure (0, 1 n) filtriert und schliesslich mit Äther gewaschen.
Die Ausbeute an Oxytetracyclin ist 3, 2 g.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung vonAntibiotica aus Kulturen von Streptomyceten in flüssigen Nährböden unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm von Streptomyces vendargensis (nov. spec.) in einer üblichen Nährlösung bei einem PH von 5,0 bis 8,0 und einer Temperatur von 20 bis 350 C so lange submers gezüchtet wird, bis das Kulturmedium eine erhebliche antibiotische Wirksamkeit aufweist, wonach die gebildeteiiantibiotica Oxytetracyclin und Vengicid aus dem Kulturfiltrat in an sich bekannter Weise abgetrennt und von einander getrennt werden.