DE3213080C2 - Herstellung von Fusafungin - Google Patents

Herstellung von Fusafungin

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    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

Es werden ein neuer Fusarium lateritium-Stamm mit den Eigenschaften des unter der Hinterlegungsnummer CBS 675.80 hinterlegten Stamms und dessen Verwendung zur Herstellung von Verbindungen biologischen Ursprungs, namentlich von Fusafungin beschrieben.

Description

Morphologische Untersuchung
Der neue Stamm Fusarium lateritium Servier CBS 675.80 besitzt eine dunkle Färbung, die Sporenbildung besitzt das Aussehen von Sporodochium mit Luftmycelbüscheln, während der unter der Hinterlegungsnummer CBS 119.63 beim Centraalbureau Voor Schimmelcultures in Baarn hinterlegte Ursprungsstamm hell ist, eine glatte Kultur zeigt und eine Sporenbildung des Typs Pionnote aufweist.
Genetische Untersuchung
Die biochemische Eigenschaft erhebliche Mengen Fusafungins zu produzieren, wird genetisch weitergegeben. Sie charakterisiert somit ein unterschiedliches Genom.
Die Vererbung dieser Eigenschaften über drei aufeinanderfolgende Generationen durch Vergleich mit zwei anderen bekannten Stämmen, die unter identischen Bedingungen gleichzeitig gezüchtet und in drei Generationen umgepflanzt wurden, wurde gemäß der folgenden Untersuchungsmethode verifiziert:
Man isoliert die Wildform CBS 119.63, die als Vergleichsmikroorganimus dient, und die auf dem Cognassier-Medium oder auf einem Acacia-Medium aufbewahrt wird, von seinem Aufbewahrungsmedium, indem man es in das flüssige Scheffer-Medium überführt, bevor man ein mit Hafermehl angereichertes Agarröhrchen animpft.
Nachdem man ein Haferagarmedium direkt mit dem Mikroorganismus Fusarium lateritium Servier angeimpft hat, verfährt man für die drei Mikroorganismen in identischer Weise, nämlich Isolieren eines Elements — Animpfen — am Ende des Zyklus Entnahme des Hauptanteils zum Fermentieren und zur Analyse — Isolieren eines Elements — und erneutes Animpfen eines frischen Agarmediums.
Das Verfahren wird am Ende der zweiten Generation zur Bildung der dritten Generation in identischer Weise wiederholt.
Die Fermentationsmaßnahmen sind für die drei Generationen der drei Stämme identisch und werden auf dem gleichen Medium durchgeführt.
In der folgenden Tabelle sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt
Bildung von Fusafungin pro Liter des Mediums (in g)
!.Generation 2. Generation 3. Generation
F. lateritium CBS119.63 (Cognassier-Medium) F. lateritium CBS119.63 (Acacia-Medium) F. lateritium Servier CBS 675.80
0,1 0,12 0,09
0,14 0,17 0,13
0,710 0,605 0,826
Biochemische Untersuchung
Der sehr hohe Fusafungingehalt, der größer ist als die bekannten Konzentrationen anderer Stämme, stellt ein biochemisches Charakteristikum der Originalität des erfindungsgemäßen Mikroorganismus dar.
Es hat sich gezeigt, daß das von diesem Stamm produzierte Fusafungin mit demjenigen identisch ist, daß von verschiedenen anderen Arten, die für die Herstellung von Fusafungin verwendet werden, gebildet wird, und zwar sowohl im Hinblick auf die Färbung des Materials, seinen Schmelzpunkt, seine antibiotische Wirkung und seine Absorptionsspektren für elektromagnetische Wellen, nämlich das Infrarctspektrum und das Ultraviolettspektrum (siehe unten).
Herstellung von Fusafungin
Der erfindungsgemäß verwendete Stamm Fusarium lateritium CBS 675.80 kann in gefriergetrockneter Form in geschlossenen Ampullen aufbewahrt werden.
Der gefriergetrocknete Inhalt der Ampullen kann direkt zum Animpfen von angereicherten Agarröhrchen verwendet werden, wie sie im Handel erhä'tlich sind, oder kann mit Hilfe klassischer Methoden zum Animpfen angewandt werden.
Das Mycel entwickelt sich progressiv und es kann nach einem Gesamtzyklus von 15 bis 20 Tagen zum Animpfen eines weiteren Röhrchens dienen, um die Fermentation zu bewirken. Man verwendet ein Medium der folgenden Zusammensetzung:
Saccharose 25 g/l
Giucosemasse 25 g/l
Ammoniumnitrat 10 g/l
Monokaliumphosphat 5 g/l
Magnesiumsulfat 2,5 g/l
Der spontane pH-Wert beträgt 5,4 bis 5,5.
Man sterilisiert das Medium während 30 Minuten bei 12O0C, wobei sein pH-Wert auf 4,8 bis 5 absinkt. Das Medium wird angeimpft und dann auf eine Temperatur von 28° C gebracht.
Man belüftet das Medium mit 1 Liter Luft pro Minute pro Liter des Mediums und läßt während 95 ± 5 Stunden fermentieren, bis die Kohlenhydrate erschöpft sind.
Nach der Fermentation extrahiert man das Mycel mit einem chlorierten Lösungsmittel, worauf man das Extraktionslösungsmittel durch Eindampfen unter verminderten Druck entfernt und den Rückstand in einem Kohlenwasserstoff löst, den man mit einem wäßrigen Alkohol extrahiert. Durch Einengen des wäßrig-alkoholischen Extrakts läßt sich das rohe Produkt ausfällen.
Man bewirkt die Reinigung durch Behandeln einer alkoholischen Lösung mit Aktivkohle, die zu diesem Zweck besonders behandelt worden ist. Das gereinigte Produkt wird aus einer Äthylalkohol/Wasser-Mischung umkristallisiert.
Schmelzpunkt: 128 bis 1310C.
Drehwert: [λ] 7 - 94 bis 104° (2% CHCl3).
IR-Spektrum (μηι): 3,4,5,8,6,0,6,8,7,3,7,7,8,0,8,5,9,9,2,10,11,6.
Fusafungin kann nicht nur in der pharmazeutischen Industrie, wie oben erwähnt, sondern auch in der kosmetischen und Nahrungsmittelindustrie verwendet werden.
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Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verwendung des Stammes Fusarium lateritium CBS 675.80 zur Herstellung von Fusafungia
    Die Erfindung betrifft die Verwendung des Stammes Fusarium lateritium CBS 675.80 zur Herstellung von Fusafungin, einem Antibiotikum, das durch äußerliche Anwendung zur Behandlung von Halserkrankungen geeignet ist
    Fusafungin und seine Herstellung, ausgehend von Fusarium lateritium, sind insbesondere in der FR-PS 11 64 181 beschrieben worden und dieser Mikroorganismus wurde unter der Hinterlegungsnummer CBS 119.63 bei dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures in Baarn hinterlegt. Die FR-PS 13 92 717 beschreibt Verbesserungen des Verfahrens zur technischen Herstellung von Fusafungin, ausgehend von diesem Stamm unter Erzielung verbesserter Ausbeuten von 0,5 bis 0,8 g/l. Andere Verfahren wurden ebenfalls untersucht, haben es jedoch nicht ermöglicht, die Ausbeute zu verbessern, da Fusafungin, ein Bestandteil des Körpers des Mikroorganismus Fusarium, in jedem Stamm in einer charakteristischen Konzentration enthalten ist.
    Es wurden auch andere Stämme untersucht, die jedoch keine vorteilhafteren Ausbeuten ermöglichten, sondern schwierigere Züchtungsbedingungen mit sich brachten.
    Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, einen Mikroorganismenstamm anzugeben, der eine größere Menge Fusafungin gleicher Qualität auf dem gleichen Herstellungsweg produziert.
    Diese Aufgabe wird nun gelöst durch die Verwendung des Stammes Fusarium lateritium CBS 675.80 zur Herstellung von Fusafungin.
    Die erfindungsgemäße Verwendung des Fusarium lateritium-Stammes stellt eine erhebliche Bereicherung der Technik dar, da sie gegenüber der Verwendung von herkömmlichen Stämmen, die im Laboratoriumsmaßstab Fusafungin-Ausbeuten im Bereich von 0,1 bis 0,2 g/l liefern, eine Ausbeute von 0,6 bis 0,9 g/l, d. h. eine um bis zu 6fach größere Ausbeute ermöglicht. Im technischen Stadium sind Ausbeuten von 1,8 bis 3,6 kg/m3 möglich, d. h. Ausbeuten, die um mindestens den Faktor 3 bis 4 größer sind als sie nach der Lehre der FR-PS 13 92 717 erzielbar sind.
    Der erfindungsgemäß verwendete Fusarium lateritium-Stamm kann, ausgehend von dem Stamm CBS 119.63, durch Dissoziation, Isolieren von Kolonien und Animpfen verschiedener Trägermedien hergestellt werden.
    Ausgehend von auf verschiedenen, mutagene Mittel enthaltenden Trägern entnommenen Sporen wurden Agarmedien angeimpft. Von diesen Kulturen wurden durch sukzessive Verdünnungen auf Agarmedien Teilungen (Dissoziationen) durchgeführt, um isolierte Kolonien zu erhalten. Diese wurden auf Produktionsmedien getestet. Dabei wurde die Ausbeute und die Zusammensetzung des gebildeten Fusafungins bestimmt.
    In dieser Weise wurde der erfindungsgemäß verwendete Stamm gewonnen, der durch Gefriertrocknung auf Magermilch stabilisiert werden kann.
    Aufgrund seiner charakteristischen Eigenschaft gehört dieser neue Stamm dem Genus Fusarium an. Er wurde unter der Hinterlegungsnummer CBS 675.80 bei dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures in Baarn hinterlegt und dort identifiziert.
    Der erfindungsgemäß verwendete Stamm kann mit keinem der bekannten Stämme identifiziert werden, so daß es sich um einen neuen Stamm handelt, den die Anmelderin Fusarium lateritium Servier bezeichnet hat.
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