DE2413961A1 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von citronensaeure - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen herstellung von citronensaeureInfo
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Description
H Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure M
Priorität: 24. März 1973, Japan, Nr. 33 089/73
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung
von Citronensäure.
Citronensäure ist ein großtechnisches Produkt mit verschiedenen Verwendungszwecken, beispielsweise zur Herstellung von Getränken
und Arzneimittelsirups.
Es sind verschiedene Verfahren zur biotechnischen Herstellung
von Citronensäure unter Verwendung von Hefen bekannt. Dabei wird im allgemeinen in der Gärmaische eine beträchtliche Menge Isocitronensäure
als Nebenprodukt gebildet. Die wirtschaftliche Bedeutung von Isocitronensäure ist jedoch so gering, daß ihre Bildung
kaum erwünscht ist. Außerdem wird durch die gleichzeitige Bildung von Isocitronensäure die Isolierung und Reinigung der
Citronensäure aus der Gärmaische stark erschwert.
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Ferner ist ein biotechnisches Verfahren bekannt, bei dem die Bildung von Isocitronensäure durch die Gegenwart von. Eisen-
-4 ionen oder Eisen enthaltenden Ionen, wie Fe(Cn)^ ,beschleunigt
wird? vgl. Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, Bd. 44 (1970), S. 562fund US-PS 3 773 620..Um die Bildung
von Isocitronensäure als Nebenprodukt zu verhindern, ist
es also notwendig, Eisenionen oder Eisen enthaltende Ionen vom .Nährmedium fernzuhalten. Jedoch ist bei großtechnischen Verfahren
die Verunreinigung des Nährmediums durch Eisenionen unvermeidlich, da diese durch die Fermentationsrohstoffe und die
Fermentationseinrichtungen eingeschleppt werden. Beispielsweise werden zur großtechnischen Herstellung von Citronensäure im allgemeinen
Vorrichtungen aus korrosionsbeständigem Stahl oder unter Verwendung von Glas hergestellte Vorrichtungen verwendet.
In beiden Fällen ist die Verunreinigung des Nährmediums mit Eisenionen unvermeidlich. Auch eine geringfügige Verunreinigung
des Nährmediums durch die Fermentationsvorrichtung wird als aus-
Isoreichend betrachtet, die Bildung einer signifikanten Menge von/
citronensäure zu verursachen und dadurch das Verfahren zu erschweren.
Die US-PS 3 689 359 beschreibt eine Citronensäure anreichernde Hefe der Gattung Candida, die nicht in der Lage ist, Citronensäure
zu verwerten. Dadurch wird die Bildung von Isocitronensäure unterdrückt, während Citronensäure in großen Mengen gebildet
wird. Dieses Verfahren weist jedoch verschiedene Nachteile auf.
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein großtechnisch durchführbares
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure zur Verfügung zu stellen, bei dem die Bildung von Isocitronensäure
unterdrückt wird, während Citronensäure in ebensc guten oder größeren Ausbeuten als bei den entsprechenden Verfahren unter
Bildung von Isocitronensäure als Nebenprodukt erhalten wird. Beim erfindungsgemäßen Verfahren soll die bisher nötige Reinigung
der Citronensäure im wesentlichen entfallen.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Hefemutanten, die für ein ebenso gutes Wachstum ,wie es der Ausgangsstamm aufweist,
größere Mengen an Eisenionen als letzterer benötigen, im wesentlichen
die Bildung von Isocitronensäure als Nebenprodukt unterdrücken und Citronensäure im Vergleich zum Ausgangsstamm
in gleich guten oder sogar größeren Ausbeuten bilden.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure unter Verwendung von Hefen,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Hefemutante, die einen größeren Bedarf an Eisenionen oder Eisen enthaltenden
Ionen als der Ausgangsstamm aufweist, in einem Nährmedium züch-
^l , j, τ, , , _, Stickstoff quellen
tet, das verwertbare Kohlenstoff- und / und Eisenionen oder Eisen enthaltende Ionen enthält, und die in der ~ Gärmai geheangereicherte Citronensäure isoliert.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Hefemutanten■haben
also einen Nährstoffbedarf an Eisen. Unter Mutanten mit
einem Nährstoffbedarf sind solche zu verstehen, die in einem
Minimalmedium, in dem der Ausgangsstamm wachsen kann, kein
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Wachstum aufweisen, aber in einem Minimalmedium, das mit einem speziellen Nährstoff versetzt wird, ebenso gut wie der Ausgangsstamm
wachsen. Derartige Mutanten werden gelegentlich auch als auxotrophe Mutanten bezeichnet. Auxotrophe Mutanten sind solche,
die Wachstumsfaktoren benötigen, für die bei den Ausgangsstämmen kein Bedarf vorliegt.
Der Eisenbedarf der erfindungsgemäß verwendeten Mutanten wird durch die Gegenwart von Eisenionen oder Eisen enthaltenden Ionen
befriedigt. In der Praxis werden dazu dem Nährmedium Verbindungen zugesetzt, die Eisenionen oder Eisen enthaltende Ionen
aufweisen.
Es ist schwierig festzustellen, ob die Ausgangsstamme der
im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mutanten einen Eisenbedarf aufweisen oder nicht, da es praktisch unmöglich ist,
einen Stamm in absoluter Abwesenheit von Eisenionen zu züchten. Wie bereits erwähnt, ist die Verunreinigung des Nährmediums
durch Eisenionen, die durch Fermentationsrohstoffe und Glasapparaturen eingeschleppt werden, unvermeidlich. Daher werden
solche Stämme als Ausgangsstamme ohne Eisenbedarf definiert,
die in einem Nährmedium, das nicht absichtlich mit Eisenquellen versetzt ist, ein ausreichendes Wachstum zeigen. Die
Ausgangsstamme benötigen also allenfalls Spurenmengen an
Eisen. Demgegenüber zeigen die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Mutanten in einem Nährmedium, das nicht absichtlich
mit Eisenquellen versetzt ist, ein schlechteres Wachstum als die Ausgangsstamme. Andererseits ist das Wachstum der Mutanten in
mit Eisenquellen versetzten Nährmedien vergleichbar mit dein der
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"P-
AusgangsStämme. Exakt ausgedrückt weisen die im erfindungsgemäßen
Verfahren verwendeten Mutanten also nicht einen "Eisenbedarf " sondern einen "erhöhten Eisenbedarf" auf.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mutanten weisen
in Gegenwart von mindestens 0,1 mg/Liter und vorzugsweise mindestens 0,2 mg/Liter Eisen ein Wachstum auf, das mit dem des
Ausgangsstammes vergleichbar ist. Besonders bevorzugt sind folgende durch Mutation von Candida zeylanoides Nr. 19-5,
ATCC 203^7 erhaltene Mutanten: Candida zeylanoides T-15,
ATCC 20391, Candida zeylanoides T-20, ATCC 20392, Candida
zeylanoides T-57, ATCC 20393 und Candida zeylanoides IC 142, ATCC 20367. Diese Mutanten sind bei der American Type Culture ·
Collection, Rockville, Maryland, V.St.A. hinterlegt und der
Öffentlichkeit frei zugänglich. Die vorgenannten Mutantenstämme weisen einen höheren Eisenbedarf als der Ausgangsstamm auf.
Candida zeylanoides IC 142, ATCC 20367 benötigt neben Eisen zusätzlich noch Glycerin.
Zur Erläuterung ihres Nährstoffbedarfs werden die Stämme
Candida zeylanoides T-15 ATCC 20391, T-20 ATCC 20392, T-57 ATCC 20393 und IC 142 ATCC 20367 sowie der Ausgangsstamm
Candida zeylanoides Nr. 19-5 ATCC 20347 in einem Grundnährmedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:
Glucose 30 g/Liter
NH4Cl 3 g/Liter
KH2PO4 0,5 g/Liter
MgSO4.7H2O , 0,5 g/Liter
MnSO4.4H2O 2 mg/Liter
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ZnSO4.7H2O 2 mg/Liter
CuSO4.5H2O 50 jig/Liter
Thiaminlydrochlorid 100 ug/liter
CaCO5 10 g/Liter
Glycerin (nur beim Stamm
IC 142, ATCC 20367) 0,5 g/Liter
pH-Wert ■ 7,0
Dieses Grundmedium wird mit FeSO4.7H2O in folgenden Konzentrationen
versetzt: 0,25 mg/Liter (etwa 0,05 mg/Liter Eisenionen), 0,5 mg/Liter (etwa 0,1 mg/Liter Eisenionen), 1 rag/Liter (etwa
0,2 mg/Liter Eisenionen) 2,5 mg/Liter (etwa 0,5 mg/Liter Eisenionen) und 5 mg/Liter (etwa 1,0 mg/Liter Eisenionen). Jeder
der zu untersuchenden Stämme wird auf einem Malzextrakt-
Schrägagar, cfer durch Lösen von 4 g Glucose, 4 g Hefeextrakt
und 10g Malzextrakt in Wasser bei einem Gesamtvolumen
von 1 Liter und durch Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 hergestellt ist, 24 Stunden bei 30°C angezüchtet. Die erhaltenen
Kulturen werden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspensionen werden auf 10 ml des Grundmediums, bzw. auf die
mit den Zusatzstoffen versetzten Nährmedien überimpft. Die Züchtung wird in einem großen Reagensglas bei einer Zellenkonr
zentration von 10' Zellen/ml 48 Stunden unter Schütteln bei
300C durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird das Wachstum
durch Messung der optischen Dichte der Gärmaische bei 660 mu
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
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| ATCC | 20391' | 0 | Tabelle | I | 12,0 | an Eisenionen 0,2 0,5 1,0 mg/ mg/ mg/ Liter Liter Liter |
13,0 | 14,0 | |
| ATCC | 20392 | 5,2 | Viachstum | 12,2 | 12,8 | 13,0 | 13,8 | ||
| Stämme | ATCC | 20393 | 5,1 | Konzentration 0,05 0,1 mg/ mg/ Liter Liter |
12,4 | 12,9 | 13,2 | 14,0 | |
| \2, ATCC 20367 | 5,0 | 8.,0 | 12,2 | 1.3,0 | 13,0 | 13,8 | |||
| T-15 | I9-5 ATCC 20347 | 4,5 | 8,5 | _ | 12,5 | 14,2 | 14,4 | ||
| Τ-20 | 13,3 | 9,0 | 13,5 | ||||||
| Τ-57 | 7,0. | ||||||||
| IC· -12 | MM | ||||||||
| Nr. ' | |||||||||
-stamme Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die MutantenA'andida
zeylanoides T-15 ATCC 20391, T-20 ATCC 20392, T-57 ATCC 20393
und IC 142 ATCC 20367 in Gegenvrart von 0,1 mg/Liter Eisen etwa 90 Prozent des Wachstums des AusgangsStammes Candida zeylanoides
19-5 ATCC 20347 auf v/ei s en, während sie in Gegenwart von 0,2 mg/
Liter Eisen oder mehr ein ebenso gutes Wachstum wie der Ausgangsstamm zeigen.
Obgleich im erfindungsgemäßen Verfahren Mutanten von Candida zeylanoides bevorzugt verwendet v/erden, können auch andere
Citronensäure bildende Hefestämme zu Stämmen mit einem höheren Eisenbedarf mutiert und im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt
werden. Vorzugsweise eignen sich Hefen der Familie Cryptococcaceae und der Gattung Candida. Diese Hefen sind im
allgemeinen multipolar sprossend und bilden Pseudomycelien und gelegentlich Mycelien. Ferner sind sie fermentativ.
Die erfindungsgemäßen Mutanten mit einem erhöhten Eisenbedarf können nach zur Herstellung von Stämmen mit einem Nährstoffbe- _,
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darf üblichen Verfahren hergestellt werden. Diese mutagene Behandlung
kann beispielsweise durch Bestrahlung mit Röntgen- oder UV-Strahlen oder durch Behandlung mit Stickstofflost oder
Nitrosoguanidin erfolgen. Beispielsweise werden Hefezellen in
suspendiert,
einem Tris-Maleat-Puffer vom pH-Wert 9,0/ der bei einer Zellenkonzentration
von 108 Zellen pro 1 ml 200 y/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
enthält. Die Suspension wird 15 Minuten stehengelassen. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert,
mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, auf eine Agarplatte überimpft und inkubiert. Aus den erhaltenen Kolonien
werden nach üblichen Verfahren Reinkolonien hergestellt. Die Reinkolonien werden nach dem vorgenannten Verfahren im Vergleich
zum Ausgangsstamm untersucht. Stämme, die den gewünsch- . ten Eisenbedarf auf v/eisen, werden für das erfindungsgeraäße Verfahren
ausgewählt.
Die Züchtung der Hefen wird in hierfür üblichen Nährmedien durchgeführt. Diese Nährmedien enthalten verwertbare Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls
Je nach dem Bedürfnis des verwendeten Hefestamms andere
Wachstumsfaktoren.
Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenwasserstoffe, wie
η-Paraffine und Kerosin, Kohlenhydrate, wie Glucose und Rohrzuckermelasse,
und Essigsäure. Beispiele für Stickstoffquellen
sind anorganische Verbindungen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat,
Harnstoff und natürliche stickstoffhaltige Materialien, wie Pepton, Fleischextrakt und Maisquellwasser. Gegebenenfalls
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Können zusätzlich anorganische Salze, wie Kaliumdihydrogenphosphat,
Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-Chlorid und Zinksulfat verwendet werden.
Eisen(II)-sulfat und Eisen(III)-chlorid werden zwar dem Nährmedium
vorzugsweise als Quellen für Eisenionen zugesetzt, es können aber auch alle anderen löslichen Eisensalze verwendet
werden, die keine toxische Wirkung auf die Mikroorganismen ausüben.
Beispiele für Eisen enthaltende Ionen sind Kaliumferrocyanid,
Natriumferrocyanid, Kaliumferricyanid, Natriumferricyanid und
Eisenalaun.
Die Züchtung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen bei 20 bis 40°C bei leicht saurem bis neutralem pH-Wert von etwa
3 bis 7 durchgeführt. Nach etwa 2-bis 5-tägiger Züchtung reichern
sich beträchtliche Citronensäuremengen in der Gärmaische
an. Der pH-Wert wird gegebenenfalls durch Zusatz von Calciumcarbonat, Natriumhydroxid oder Ammoniaklösung eingestellt.
Nach beendeter Züchtung werden die Mikroorganismen/aus der Gär- >
maische, beispielsweise durch Filtrieren, entfernt, anschließend wird das Filtrat eingeengt. Durch Zusatz von Calciumhydroxid
zum Filtrat läßt sich die Citronensäure leicht als Calciumcitrat gewinnen. Das Calciumcitrat wird durch -Zusatz von Schwefelsäure
unter Ausfällung von Calciumsulfat in Citronensäure übergeführt. Selbstverständlich kann die Citronensäure auch nach
anderen üblichen Reinigungsverfahren gewonnen werden.
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Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Es werden Candida zeylanoides T-15 ATCC 20391, T-20 ATCC 20392
und T-57 ATCC 20393, die jeweils mindestens 0,1 mg/Liter Eisen·
benötigen, verwendet. Als Vergleichsstamm wird Candida zeylanbides Nr. 19-5 ATCC 20347 verwendet,- der diesen Eisenbedarf
nicht aufweist. Die Stämme werden jeweils in einem Malzextrakt -Schrägagar, das durch Lösen von 4 g Glucose, 4 g Hefeextrakt
und 10 g Malzextrakt in Wasser bei einem- Gesamtvolumen von 1 Liter und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 hergestellt
ist, 24 Stunden bei 30°C gezüchtet. Die erhaltenen Kulturen werden auf 20 ml eines Anzuchtnähnaediums der folgenden Zusammensetzung
überimpft. Dieses Anzuchtnährmedium befindet sich in einem mit Prallplatten ausgerüsteten 250 inl fassenden Erlenmeyerkolben.
η-Paraffine .
NH4Cl
KH2PO4
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O
FeSO4.7H2O CuSO4.5H2O
Thiamin-hydrochlorid
CaCO, (getrennt sterilisiert) 10 g/Liter
pH-Wert 6,0
| 30 | ml/Liter |
| 5 | g/Liter |
| 0, | 5 g/Liter |
| 0, | 5 g/Liter |
| 2 | mg/Liter |
| 2 | mg/Liter |
| 1 | mg/Liter |
| 50 | ug/LIter |
| 100 | ug/Liter |
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Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30 C unter einer Schüttelbev/egung
von 200 U/min durchgeführt. Jeweils 2 ml dieser Anzuchtkulturen
werden sodann auf 20 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung, das sich in einem 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben befindet, überimpft.
n-Paraffine
NH4Cl
KH2PO4
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
FeSO4.7H2O
CuSO4.5H2O Thiamin-hydrochlorid
CaCO^ (getrennt sterilisiert) pH-Wert
| 100 | ml/Liter | 0 |
| 5 | g/Liter | |
| 0, | 5 g/Liter | |
| o, | 5 g/Liter | |
| 2 | mg/Liter | |
| 2 | mg/Liter | |
| 10 | mg/Liter | |
| 50 | -ug/Liter | |
| 100 | ug/Liter | |
| 80 | g/Liter | |
| 6, |
Die Züchtung wird 96 Stunden bei 300C unter einer Schüttelbewegung
von 200 U/min durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
| Stämme | Citronensäure, (mg/ml) |
Isocitronensäure (m^/ral) |
| T-15 ATCC 20391 | 77 | 2,0 |
| T-20 ATCC 20392 | 84 | 3,7 |
| T-57 ATCC 20393 | 77 | 2,9 |
| Nr. 19-5 ATCC 20347 | ■ 48 | 30,0 |
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Beispiel 2
Es werden die Stämme Candida zeylanoides IC 142 ATCC 20367,
der/0,1 mg/Liter Eisen benötigt, und Candida zeylanoides Nr. 19-5 ATCC 20347, jeweils 24 Stunden bei 300C auf einem gemäß
Beispiel 1 hergestellten Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet. Die
erhaltenen Kulturen werden auf Jeweils 20 ml des in Beispiel 1 angegebenen Anzuchtmediums gegeben, das aber zusätzlich
5 g/Liter Glycerin enthält. Dieses Anzuchtmedium befindet sich in 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben.
Die Züchtung wird 24 Stunden bei 300C unter einer Schüttelbewegung von 200 U/min durchgeführt. Jeweils 2 ml der
erhaltenen Anzuchtkulturen werden anschließend auf 20 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung, das sich in 250 ml
fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben befindet,
überimpft.
n-Paraffine Glycerin NH4Cl
KH2PO4 MgSO4.7H2O MnSO4.4H£0 ZnSO
KH2PO4 MgSO4.7H2O MnSO4.4H£0 ZnSO
4.
FeSO4.7H2O
CuSO4.5H2O Thiamin-hydrochlorid
CaCO5 (getrennt sterilisiert) pH-Wert
100 ml/Liter
1 g/Liter 5 g/Liter 0,5 g/Liter 0,5 g/Liter
2 mg/Liter 2 mg/Liter
0-100 mg/Liter *
50 ug/Liter 100 ug/Liter 80 g/Liter 6,0
*FeS04.7H20 wird in verschiedenen, in Tabelle III angegebenen
Mengen zugegeben. _j
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Die Züchtung wird 96 Stunden bei 30°C unter einer Schüttelbewegung
von 200 U/min durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.
Stämme FeSO^.7H2O Citronensäure Isocitronen-
säure
- (mg/Liter) (mg/ml) (mg/ml)
- (mg/Liter) (mg/ml) (mg/ml)
IC 142 ATCC 20367
| 0 | 65 | 0,8 |
| 0,2 | 68 | 0,8 |
| 1 | 70 | 2,0 |
| 10 | 73 | 3,2 |
| 20 | 71 | 4,5 |
| 100 | 70 | 8,0 |
| 0 | 58 | 12,0 |
| 1 | 52 | 18,0 |
| 10 | 42 | 26,0 |
| 100 | 40 | 30,5 |
No. 19-5 ATCC 20347
Beispiel 3
Die Stämme Candida zeylanoides IC 142 ATCC 20367 und Nr. 19-5
ATCC 20347 werden 24 Stunden bei 300C auf einem gemäß Beispiel
1 hergestellten Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet. Von den erhaltenen
Kulturen werden jeweils drei Ösen voll auf 200 ml
eines Anzuchtmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Bei- · spiel 2 auf 2 Liter fassende, mit Prallplatten ausgerüstete
Erlenmeyerkolben überimpft und unter Schütteln 24 Stunden bei 300C gezüchtet. Jeweils 300 ml der erhaltenen Kulturflüssigkeit (entsprechend dem Volumen von 1 1/2 Korben) werden auf
3 Liter Nährmedium, das sich in 5 Liter fassenden Glasfermentern befindet, überimpft. Das Nährmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 2 mit einem Gehalt an 1 mg/Liter _j
eines Anzuchtmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Bei- · spiel 2 auf 2 Liter fassende, mit Prallplatten ausgerüstete
Erlenmeyerkolben überimpft und unter Schütteln 24 Stunden bei 300C gezüchtet. Jeweils 300 ml der erhaltenen Kulturflüssigkeit (entsprechend dem Volumen von 1 1/2 Korben) werden auf
3 Liter Nährmedium, das sich in 5 Liter fassenden Glasfermentern befindet, überimpft. Das Nährmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 2 mit einem Gehalt an 1 mg/Liter _j
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FeSO^.7HpO. Jedoch enthält dieses Nährmedium kein CaCO^. Die
Züchtung wird unter Einhaltung einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min
90 Stunden bei 300C durchgeführt. YJährend der Züchtung wird der
pH-Wert des Nährmediums mit wäßriger Ammoniaklösung auf 6,0 eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Stämme - : Citronensäure Isocitronensäure
' (mg/ml) (mg/ml)
IC 142 ATCC 20367 105,0 3,0
No. 19-5 ATCC 20347 84,0 - 18,0
3 Liter der vorstehenden, durch Züchtung von IC 142 ATCC 20367 erhaltenen Gärmaische, die 315 g Citronensäure enthält,
wecfen zur Entfernung der Mikroorganismenzellen abfiltriert. Das
zellfreie Filtrat wird mit 200 g Calciumhydroxid versetzt.. Man
erhält 350 g Calciumcitrat.
Es werden Candida zeylanoides IC 142 ATCC 20367 und Nr. 19-5 ATCC 20347 verwendet. Außerdem werden die aus der US-PS/bekannten,
Citronensäure bildenden Stämme Candida lipolytica ATCC 20237, Candida sp. ATCC 20238, Candida sp. ATCC 20239,
Candida sp. ATCC 20241 und Candida tropicalis ATCC 20240 ver- "
wendet. Diese Stämme v/erden jeweils 24 Stunden bei 300C auf
einem Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet. Proben der erhaltenen Kulturen werden auf jeweils 20 ml eines Anzuchtmediums, das
sich in 250 ml fassenden, mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben
befindet, überimpft. Das Anzuchtmedium hat die gleiche
Zusammensetzung wie in Beispiel 2, mit der Ausnahme, daß es_j
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50 ug/Liter Thiamin-hydrochlorid und 20 g/Liter CaCO5 enthält.
Die Anzucht wird 24 Stunden bei 300C unter einer Schüttelbewegung
von 200 U/min durchgeführt. Anschließend werden jeweils 2 ml der erhaltenen Anzuchtkulturflüssigkeiten auf jeweils
20 ml der Nährmedien A und B, die sich in 250 ml fassenden ErIenmeyerkolben befinden, überimpft. Das Medium A hat die gleiche
Zusammensetzung wie in Beispiel 1, mit-der Ausnahme, daß
es kein FeSO^.7H2O enthält. Das Medium B hat ebenfalls die gleiche
Zusammensetzung wie in Beispiel 1, enthält aber 500 mg/Liter FeSO^.7H2O. Die Züchtung wird 120 Stunden bei 300C unter
einer Schüttelbewegung von 200 U/min durchgeführt. Die Ergeb- ·»
nisse sind in Tabelle V (Medium A) und Tabelle VI (Medium B) zusammengestellt.
| Medium A: FeSO^ | * .7H2O: 0 mg/Liter |
|
| Stämme | - Citronensäure | Isocitronensäure |
| (mg/ml) | (rag/ml) | |
| IC 142 ATCC 20367 | 87,1 ' | 3,0 |
| Nr. 19-5 ATCC 20347 | 77,0 | 30,0 |
| ATCC 20237 | 73,9 | 12,4 |
| ATCC 20238 | 5,0 | 1,5 |
| ATCC 20239 | 4,8 | 1,4 |
| ATCC 20240 | 24,1 | 4,1 |
| ATCC 20241 | 65,2 | 31,8 |
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| Tabelle VI | 7H2O: 500 rag/Liter | |
| Stämme | Medium B: FeSO4. | Isocitronensäure |
| Citronensäure | (mg/ml) | |
| (mg/ml) | 13,8 | |
| IC 142 ATCC 20367 | 95,5 | 32,2 |
| Nr. 19-5 ATCC 20347 | 36,7 | 21,0 |
| ATCC 20237 | 59,4 | '7,4 |
| ATCC 20238 | 10,1 | 7,7 |
| ATCC 20239 | 6,2 | 17,0 |
| ATCC 20240 | " 25,8 | 46,2 |
| ATCC 20241 | 37,0 . | |
Es werden Candida zeylanoides IC 142 ATCC 20367 und Candida lipolytica ATCC 20237 (beschrieben in der US-PS
3 689 359) Jeweils auf 20 ml eines ersten Anzuchtmediums der folgenden Zusammensetzung, das sich in einem 250 ml fassenden
ErIenmeyerkolben befindet, überimpft.
n-Paraffine KH2PO4
MgSO4.7H2O
KCl
NaCl
FeSO4.7H2O
Thiamin-hydrochlorid CaCO3
Glycerin (nur beim Stamm IC 142, ATCC 20367) pH-Wert
| 30 | ml/Liter |
| 1 | g/Liter |
| 4 | g/Liter |
| 5 | g/Liter |
| 0,1 | g/Liter |
| 1 | g/Liter |
| 10 | mg/Liter |
| 300 | ug/Liter |
| 10 | g/Liter |
| 5 | g/Liter |
6,0
409839/0827
Die Züchtung wird 48 Stunden bei 30 C unter Schütteln durchgeführt.
Die auf diese- V/eise erhaltenen ersten Anzuchtkulturen werden auf jeweils 300 ml eines zweiten Anzuchtmediums, das
sich in 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben befindet und die gleiche Zusammensetzung wie das erste Anzuchtmedium aufweist,
überimpft und darin 48 Stunden bei 300C gezüchtet. Die zweiten
Anzuchtkulturen werden sodann auf jeweils 3 Liter eines dritten
Anzuchtmediums der gleichen Zusammensetzung, das sich in 5 Liter fassenden Glasfermentern befindet, überimpft und darin
24 Stunden bei 300C gezüchtet. Jeweils 300 ml der dritten Anzuchtkulturen
werden sodann auf jeweils 3 Liter der Nährmedien C und D, die sich in 5 Liter fassenden Glasfermentern befinden,'
überimpft. Die Medien C und D haben die folgende Zusammensetzung:
Medium C
Medium D
| η-Paraffine | 100 ml/Liter | 100 | ml/Liter |
| KH2PO4 | 0,25 g/Liter | 0, | 5 g/Liter |
| (NH4)2S04 | 4 g/Liter | - | |
| NH4Cl | - | 5 | g/Liter |
| MgSO4.7H2O | 0,5 g/Liter | 0, | 5 g/Liter |
| KCl | 0,5 g/Liter | - | |
| NaCl | .0,1 g/Liter | - | |
| ZnSO4.7H2O | 1 mg/Liter | 2 | rag/Liter |
| CuSO4.5H2O | 100 ug/Liter | 50 | ^ig/Liter |
| FeSO4.7H2O | 100 mg/Liter | 100 | mg/Liter |
| MnSO4.4H2O | ■ - | 2 | mg/Liter |
| Thiamin-hydrochlorid | 50 ug/Liter | - 50 | ug/Liter |
| CaCO, | 1 g/Liter |
409839/0827
Die Züchtung wird 96 Stunden bei .3O0C unter Einhaltung einer
Ruhrgeschwindigkeit von 600 U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min durchgeführt, wobei der pH-Yfert mit
wäßriger Ammoniaklösung auf 6,0 eingestellt wird. D.ie Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt:
| Stämme | Medium | Züchtungs dauer. (Std.) |
Citronen säure (mg/ml) |
Isocitronen- säure |
| IC 142 | C | 72 96 |
85,9 87.7 - |
12,2 11,4 |
| ATCC 20367 | D |
CM VO
in cn |
88,6 101,9 |
6,8 4.2 |
| ATCC 20237 | C | 72 96 |
76,0 71.7 |
17,3 17,3 |
| D | 72 96 |
66,7 69'..9 |
12,8 12,4 |
Es werden Candida zeylanoides IC 142 ATCC 20367 und
Nr.. 19-5 ATCC 20347 jeweils £4 Stunden bei 300C auf einem gemäß
Beispiel 1 hergestellten Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet.
Die erhaltenen Kulturen werden auf jeweils 20 ml eines Anzuchtnährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 2,
das sich in 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben befindet, überimpft und darin 24 Stunden bei
300C unter einer Schüttelbewegung von 200 ü/min gezüchtet. Jeweils
2 ml der so erhaltenen Anzuchtkulturen werden auf 20 ml eines in 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten
Erlenmeyerkolben befindlichen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung
überirapf t. ^1
409839/0827
Glucose 20 g/Liter
Calciumacetat-monohydrat 7,5 g/Liter
Glycerin 1 g/Liter
NH4Cl 5 g/Liter
KH2PO4 ' 0,5 g/Liter
MgSO4.7H2O 0,5 g/Liter
MnSp4.4H2O . 2 mg/Liter
ZnSO4.7H2O . 2 mg/Liter
FeSO4.7H2O 1 mg/Liter
CuSO4.5H2O 50 ug/Liter
Thiarain-hydrochlorid 100. ug/Liter
CaCO3 (getrennt sterilisiert) 10 g/Liter
pH-Wert 6,0,
Die Züchtung wird 96 Stunden bei 300C unter einer Schüttelbewegung
von 200 U/min durchgeführt. Dabei werden dem Medium nach Ablauf von 24, 48 und 72 Stunden jeweils 29,4 g/Liter
Calciumacetat-monohydrat zugesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengestellt.
Stämme Citronensäure Isocitronensäure ' (mg/ml) (mg/ml)
IC 142 ATCC 20367 32,0 0,7
Nr. 19-5 ATCC 20347 27,0 . 7,5
40 9839/QS Π
Es Werden Candida zeylanoides IC 142 ATCC 20367 und Nr. 19-5 ATCC 20347 24 Stunden bei 3O0C auf einem gemäß Beispiel
1 hergestellten Malzextrakt-Schrägagar gezüchtet. Von den erhaltenen Kulturen wird jeweils eine Öse voll auf jeweils
20 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung überimpft: 150 g/Liter (berechnet als Zucker) mit Invertase behandelte
Rohrzuckermelasse, 1 g/Liter NH4Cl, 0,5 g/Liter MgSO4.7H2O,
1 g/Liter Glycerin und 60 g/Liter. CaCO5 (pH-Wert 6,0). Dieses
Medium befindet sich in 250 ml fassenden, mit Prallplatten ausgerüsteten Erlenmeyerkolben. Man züchtet 120 Stunden bei 300C '
unter Schüttelbewegung von 200 U/min. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt.
Stämme Citronensäure Isocitronensäure (mp/ml) A
IC 142 ATCC 20367 85,0 1,5
Nr. 19-5 ATCC 20347 70,0 8,2
YiIe sich aus den vorhergehenden Beispielen ergibt, läßt sich
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren praktisch selektiv Citronensäure herstellen.
409839/0827
Claims (11)
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure
unter Verwendung von Hefen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Hefemutante, die einen größeren
Bedarf an Eisenionen oder Eisen enthaltenden Ionen als der Ausgangsstamm aufweist, in einem Nährmedium züchtet, das verwertbare
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Eisenionen oder Eisen enthaltende Ionen enthält, und die in der Gärmaische angereicherte
Citronensäure isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Mutante der Gattung Candida verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Mutante der Gattung Candida zeylanoides verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Candida zeylanoides ATCC 20391, Candida zeylanoides ATCC 20392,
Candida zeylanoides ATCC 20393 oder Candida zeylanoides ATCC 20367 verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei 20 bis 40°C durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Quelle für Eisenionen FeSO^.7H2O verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Züchtung in Gegenwart von mindestens 0,1 mg/Liter Eisenionen oder Eisen enthaltenden Ionen durchführt.
8. Candida zeylanoides ATCC 20391.
9. Candida zeylanoides ATGC 20392.
10. Candida zeylanoides ATCC 20393.
11. Candida zeylanoides ATCC 20367.
J 409839/0827
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-
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