DE2301079A1

DE2301079A1 - Verfahren zur herstellung von citronensaeure und bzw. oder isocitronensaeure auf mikrobiologischem wege

Info

Publication number: DE2301079A1
Application number: DE2301079A
Authority: DE
Inventors: Kenichiro Takayama; Tomoko Tomiyama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1972-01-13
Filing date: 1973-01-10
Publication date: 1973-07-19
Also published as: JPS537514B2; JPS4875734A; FR2167911A1; US3809611A; GB1376562A; DE2301079B2; DE2301079C3; FR2167911B1

Description

Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und bsw. oder Isocitronensäure auf mikrobiologischem Wege

Priorität: 13. Januar 1972, Japan, Nr. 5524/72

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und bzw. oder Isocitronensäure aus Essigsäure auf mikrobiologischem Wege unter Verwendung von bestimmten Hefestämmen.

Citronensäure findet in der Arzneimittel-, Nahrungsmittel- und Waschmittelindustrie vielseitige Anv.'endung.

Es ist. bekannt, Citronensäure au Γ rr.ilcrobiclc^ische-a: Vage durch Züchtung eines Pilses, wie a&pergiJlus niger, in einein Nährmedium, das ein Kohlonr.ydr&t ο Is Kohlenstoff ['quelle enthält, her-

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zustellen. In letzter Zeit wurde vielfach versucht, Citronensäure unter Züchtung von Hefen in einem Nährmedium, das n-Paraffine als Kohlenstoffquelle enthält, herzustellen. Nach dem Verfahren der "US-PS 3 689 539 gelingt es, aus billigen Ausgangsmate-ria™ lien Citronensäure in hohen Ausbeuten herzustellen. Bei diesem Verfahren werden in der Gärmaische mindestens 100 mg/ml Citronensäure angereichert.

In jüngster Zeit haben sich durch Portschritte auf dem Gebiet der Petrochemie Kostensenkungen bei der Herstellung von Essigsäure ergeben. Dies hatte zur Folge, daß Essigsäure als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Lysin, auf mikrobiologischem Wege verwendet wird. Die Verwendung von Essigsäure als Rohmaterial in mikrobiologischem Verfahren hat eine Reihe von Vorteilen. Da sich Essigsäure leicht in gleichbleibender Reinheit herstellen läßt, bereitet die Kontrolle der mikrobiologischen Verfahren keine Schwierigkeiten. Ein weiterer Vorteil ist die Löslichkeit von Essigsäure in Vfasser. Dazu kommt, daß die Stoffwechselprodukte und die Mikroorganismenzellen leichter als bei mikrobiologischen Verfahren unter Verwendung von Paraffinen gewonnen werden können. Schließlich enthalten die ..-.,·. unter Verwendung von Essigsäure hergestellten Stoffwechselprodukte und Mikroorganismenzellen weniger toxische Produkte als dies bei Verwendung von Paraffinen der Fall ist.

Trots dieser Vorteile wurde bisher der Verwendimg vcn Lacigsäui'e als Rohmaterial zur Herstellung von Citronensäure wenig Beachtung

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geschenkt. Die GB-PS 1 199 700 beschreibt die Herstellung von Isocitronensäure durch Züchtung eines Candida-Stammes unter Verwendung von Essigsäure, wobei als Nebenprodukt Citronensäure auftritt. Gemäß dem Verfahren der FR-PS 7 005 215 erhält man durch Züchtung von Candida .τeylanoides ATCC 15585 in einem Nährmedium, das 5 Prozent Essigsäure enthält, 12 mg/ml Citronensäure und 10 mg/ml Isocitronensäure.

Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und baw. oder Isocitronensäure auf mikrobiologischem Wege zu schaffen, das in hohen Ausbeuten verläuft. Diese Aufgabe ■wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und bzw. oder Isocitronensäure auf mikrobiologischem Wege unter Verwendung von Essigsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Candida ^eylanoides ATCC 203*17 in einem Essigsäure als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und die in der Gärmaische angereicherte Citronensäure und bzw. oder Isocitronensäure gewinnt.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Stamm wurde durch Mutation von Candidazeylanoides ATCC 15585 erhalten und als Candida zeylanoides Mr. 19-5 bezeichnet.

Die Züchtung von Candida zeylanoides ATCC 203^7 kann nach übli-

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chen Verfahren in natürlichen oder synthetischen Nährmedien durchgeführt werden. Als Kohlenstoffquelle können Essigsäure, Essigsäuresalze, wie das Natrium-, Ammonium- oder Calc.iumsalz, öder Essigsäureester, wie der Äthyl- oder Methylester, verwendet werden. Um das Wachstum des verwendeten Stammes zu fördern, können zu Beginn der Züchtung Glucose, Glycerin und bzw. oder η-Paraffine dem Nährmedium in einer Menge von 1 bis 2 Prozent (Gewicht/Volumen oder Volumen/Volumen) als Kohlenstoffquelle zusätzlich zur Essigsäure zugesetzt werden. Es würde erfindungsgemäß festgestellt, daß insbesonders durch Glycerinzusatz die

oder Ausbeuten an Citronensäure und bzw.vIsocitronensäure verbessert

werden.

Vorzugsweise wird die Essigsäurekonzentration im Nährmedium kontrolliert, um unerwünscht hohe Konzentrationen am Beginn der Züchtung zu vermeiden. Vorzugsweise wird die Essigsäure dem Nährmedium stufenweise zugesetzt·.

Als Stickstoffquelle können beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat und als anorganische Verbindungen beispielsweise Kaliumdihydrogenphasphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen(II)-sulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat, Natriumchlorid und Calciumchlorid verwendet werden. Außerdem können dem Nährmedium Wachstumsfaktoren, wie Thiamin, Biotin, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Fleischextrakt und Pepton zugesetzt werden. Die vorgenannten natürlichen organischen Materialien können auch als

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Stickstoffquelle verwendet werden.

Vorzugsweise wird der erfindungsgemäß verwendete Stamm zuerst in einem Anzuchtmedium unter geeigneten Wachstumsbedingungen, beispielsweise etwa 24 Stunden, gezüchtet und anschließend als Inokulum in das Hauptnährmedium übertragen. ---.π.-.:Γ.

Vorzugsweise wird die Züchtung unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 15 bis 4O⁰C und einem pH-Bereich von 3 bis 7 durchgeführt. Gegebenenfalls wird der pH-Wert durch Zusatz von Calciumcarbonate Calciumhydroxid oder Natriumhydroxid eingestellt. Im allgemeinen ist die Züchtung nach 2 bis 5 Tagen beendet. Innerhalb dieser Zeit werden in der Gärmaische beträchtliche Mengen an Citronensäure und Isocitronensäure angereichert. Diese Säuren werden nach üblichen Verfahren isoliert. Beispielsweise wird das nach dem Abfiltrieren der Mikroorganismenzellen erhaltene Filtrat auf übliche Weise konzentriert. Aus dem Konzentrat werden Citronensäure und Isocitronensäure durch Ausfällung der entsprechenden Calcium- oder Natriumsalze unter Ausnutzung der Löslichkeitsuntersehiede isoliert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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:: ■· ■■■■, ·. - β -

Beispiel 1

Candida zeylanoides ATCC 203^7 wird 24 Stunden bei 30°C auf einem schräggestellten Malzextrakt-Agar-Nährboden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einem mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen, der 20 ml des folgenden Anzuchtnährmediums enthält, eingeimpft:

Glucose	2g/dl
Calciumacet at	0,5 g/dl
Na₄Co	0,3 g/dl
KH₂PO₄	0,05 g/dl
MgSO₄·7 H₂O	0,05 g/dl
Hefeextrakt	0,2 g/dl
pH-Wert	5,5

Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Die so erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen mit Prallplatten versehenen Erleneyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen, der 20 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält, eingeimpft:

Glucose ■ 2 g/dl

' Calciumacetat- monohydrat	3	g/dl
NH₁₁Cl	0	,3 g/dl
KH₂PO₁J	0	,05 g/dl
MgSO₄*7 H₂O	0	,05 d/dl

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jj'll H₂O 1 mg/Liter

Thiamin 100 yg/Liter

CaCO 1 g/dl

(CaCO, getrennt sterilisiert) pH-Wert 5,5

Die Züchtung wird unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. ^8 und 72 Stunden nach der Inokulation wird das Nährmedium mit zusätzlichem sterilisiertem Oalciuinacetat-monohydrat in solchen Mengen versetzt, daß die Konzentration von 3 g/dl aufrechterhalten wird. Nach beendeter Züchtung erhält man 15»2 mg/ml Citronensäure und .10,0 mg/ml Isocitronensäure in Form von Calciumsalzen, wobei insgesamt 60 mg/ml Essigsäure (90 mg/ml Calciumsalz) eingesetzt worden sind.

Züchtet man den Stamm Candida zeylanoides ATCC 15585 auf die gleiche Weise, so werden 10,5 mg/ml Citronensäure und 11,5 mg/ml Isocitronensäure gebildet.

Beispiel 2

Candida zeylanoides ATCC 203^7 wird auf einem schräggestellten Malzextrakt-Agar-Nährboden 2k Stunden bei 30°C gezüchtet. Die_ erhaltene Kultur wird in einen mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 250 ml Passungsvermögen, der 20 ml eines Anzuchtiiährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält, eingeimpft .

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	2 ml/dl	2301079
η-Paraffine	1 g/dl
Glycerin	0,5 g/dl
Ammöniumacetat.	0,05 g/dl
KH₂IK)₄.	0,05 g/dl
MgSO₄-7 H₂O	5 mg/1
PeSO₁.-7 H₀O	2 mg/1
MnSO₁₁. iJ H₂O	100 pg/1	^: - - . - ■'-.. ■-. - --
Thiamin	1 g/dl
CaCO,

(CaCO, getrennt sterilisiert) > . ,.,■

Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 250.ml Passungsvermögen, der 20 ml eines Nährmediums der gleichen'Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium . enthält, eingeimpft. Die Züchtung wird unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Nach HO Stunden wird der pH-Wert des Mediums mit einer 30prozentigen Acetatpufferlösung oder 30prozentigen Essigsäurelösung auf 5 bis 6 eingestellt. Nach 96stündiger Züchtung . reichern sich 48 mg/ml Citronensäure und 18 mg/ml Isocitronensäure an, wobei 85 mg/ml Essigsäure eingesetzt worden sind.

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Beispiel 3

Gähdida zeyiänoides ATCC 2034? wird 24 Stünden bei 3O⁰C auf einem Böhr"äggeBteHten Maiaextrakt-Agär^Nährboden gezüchtet» Öi'e ei¹*. hältene Kultur wird in einen mit Prällplatten versehenen meyerkölben von 250 ml Fassungsvermögen, der* 20 iftl eines züöhtnährmediunis der folgenden äusaffimensetzüng erithaife,

Glucose 2 g/dl

Glycerin 1 g/dl

Ammoniumäcetät 0,5 g/dl

KO₂POj₄ ÖJÖ5 g/dl

•T H₂O 0,05 g/dl

•7 H₂O 5 mg/1

^•S H₂O 2 mg/1

Thiamin 100 ug/l

OaCO₃ 1 g/dl tCaCO-4 getrennt sterilisiert)

pH-Wert 5 »5

Die Züchtung wird 24 Stunden bei 3O⁰C"unter Schütteln durchgeführt. Öle erhaltene Ansuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen mit Prallplatten Versehenen Erienmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen, der 20 ml eines Mhrmediuras der gleichen Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium enthält«, eingeimpft. Die Züchtung wird unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Nach 40stündiger Züchtung wird dör pH-Wert des

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«Ι-Π *■ ,I

mit 3öpröientigei> AoetatpufferlOsung oder §§1* EMiitsäMrelÖSüiii äüf 5 bis β eingestellt, Näeh Jp ifehtUhi Reichern Sieh 4ö mg/iftl Citronensäure und~ 13 'mg/ml

an^ viöBei 8ö rag/ffil Essigsäure eingeäeSzt

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s AiCO 203^7 wird 2Ά Stunden l3gl'3Ö^oC auf söhräggesteliten felzexträMt^Ägär'-llährbödeo geiüöhtet* Die. iuitur wird in einen mit fprallplätten versehenen Erlen*

h 2 1 Fassungsvermögen, der 200 ml eines mediums dir folgenden iusämmenset^ung enthält_s eingeimpft:

üälciumaöetat O₁S gfdl"

Cl ^V "'- ^;: 0,3 g/dl · ⁰!} O₄OS g/dl

g/dl ^:

Mefttüng wird 2^1 Stunden bei 3Ö°C unter Rühren durchgeführt.

fcie erhaltene Anäuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Pro- i Volumen /Volumen) in einen Fermenter voti 30 1' Passungsver— i der 15 1 eines Nährmediums der 'folgenden 2usammenset2ung

enthält j eingeimpft:

Glucose 2 g/dl

Calciumacetat- monohydrat	3 .g/dl
NH₁JCl	. 0,3 g/dl
KH₀PO₁. ά A	0,05 g/dl
MgSÖ^-7 H₂O	0,05 g/dl
MnSO₁₁* 4 H₂O	1 mg/1
Thiamin	100 ug/1
CaCO,	1 g/dl
CaCO, getrennt	sterilisiert)
pH-Wert	5,5

Die Züchtung wird bei 30⁰C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. . Während der Züchtung wird das Medium mit zusätzlichem Calciumacetat-monohydrat in solchen Mengen versetzt, daß die Konzentration von 3 g/dl aufrechterhalten wird. Nach beendeter Fermentation werden 66 mg/ml Citronensäure und 30 mg/ml Isocitronensäure in Form der CaIeiumsalze"erhalten, wobei insgesamt 188 mg/ml Essigsäure (270 mg/ml Calciumsalz) verwendet worden sind.

Beispiel 5

Candida zeylanoides ATCC 203^7 wird 2·\ Stunden bei 3O⁰C auf einem ,schräggestellten Malzextrakt-Agar-Nährboden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einen mit Prallplatten versehenen Erlenir.eyerkolbon von 2 1 Fassungsvermögen, der 200 ml eines Anzucht-

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	2 ml/dl	2301079
	1 g/dl	eingeimpft:
¹ folgenden Zusammensetzung enthält,	0,5 g/dl
n-Paraffine	0,05 g/dl
Glycerin	0,05 g/dl
Ammo η i uma c e t at	5 mg/1
KH₂PO₄	2 mg/1
MgSO₄-7 H₂O	100 yg/1
PeSO₄.7 H₂O	1 g/dl
MnSO₄*4 H₂O
Thiamin
CaCO

(CaCO-. getrennt sterilisiert)
pH-Wert 5,5

Die Züchtung wird 2k Stunden bei 3O⁰C unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen Permenter von 30 1 Passungsvermögen, der 15 1 eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium enthält, eingeimpft. Die Züchtung wird bei 3O⁰C unter Belüftung und Rühren durchgeführt, Nach kO Stunden wird der pH-Wert des Mediums mit 30prozentiger Acetatpufferlösung oder 30prozentiger Essigsäurelösung auf 5 bis 6 eingestellt. Nach 96stündiger Züchtung reichern sich I68 mg/ml Citronensäure und 72 mg/ml Isocitronensäure an, wobei kOO mg/ml Essigsäure verwendet worden sind.

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Beispiel 6

Candida zeylanoides ATCC 20347 wird 2H Stunden bei 3O°C auf einem schräggestellten Malzextrakt-Agar-Nährboden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einem mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 2 1 Fassungsvermögen, der 2ÖÖ ml eines Anzuchtjnediums der folgenden Zusammensetzung enthält, eingeimpft.:

n-Paraffine	2 ml/dl
Glycerin	1 g/dl
Ämmoniumacetat	0,5 g/dl
KH₂POjJ	0,05 g/dl
MgSO₂₁-7 H₂O	0,05 g/dl
FeSO₄*7 H₂O	5 mg/1
MnSO₁₄. 4 H₂O	2 mg/1
Thiamin	100 yg/1
CaCO,	1 g/dl
(CaCO, getrennt pH-Wert	sterilisiert) 5.5

Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30 C unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen Fermenter von 30 1 Fassungsvermögen, der 15 1 eines Hährmediums der gleichen Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium enthält, eingeimpft. Die Züchtung wird unter Schütteln bei 3O⁰C durchgeführt. Nach HO Stunden wird der pH-VJert des Mediums mit 30proaentiger AcetatpufforLösung oder 30prozentiger Essigsäurelösung auf 5 bis 6 eingestellt. Nach

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96sfcilndiger Zücnfeung r;eicfrern -sich, 84. mg/ml Citronensäure und

und 35 mg/ml Isocitronensäüre an, wobei 2Ό3 nig/mil »Essigsäure .v.trw&ndef worden, .sind.;-_;;-.. ;;·_. ;■..-..·■;.-:.:■-;.Λ' ·λ

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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und bzw. oder Isocitronensaure auf mikrobiologischem Wege unter Verwendung von Essigsäure, dadurch gekennzeichnet , daß man Candida zeylanoides ATCC 203^7 in einem Essigsäure als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und die in der Gärmaische angereicherte Citronensäure und bzw. oder Isocitronensaure gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die. Züchtung bei Temperaturen von 15 bis 40⁰C und einem pH-Wert von 3 bis 7 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch I₅ dadurch gekennzeichnet, daß man die Essigsäure dem ITährmedium während der Züchtung stufenweise zusetzt.

*J. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Essigsäure dem Mährmedium in Form von Salzen der Essigsäure zusetzt.

5. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man die Essigsäure dem Nährn:edium in Form von Escdgsäureentern zusetzt.

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