DE1517851C3

DE1517851C3 - Verfahren zur Erhöhung der Alkaloidproduktion in submersen Claviceps-Kulturen

Info

Publication number: DE1517851C3
Application number: DE1517851A
Authority: DE
Inventors: Eva Udvardy Dr.Med. Nagy Geb. Pehany Cserei; Tibor Dipl.- Ing.Chem.Dr. Perenyi; Geza Wack; Erzsebet Zsoka Geb. Somkuti
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1965-11-03
Filing date: 1966-11-03
Publication date: 1975-10-16
Also published as: DE1517851A1; CH501728A; GB1170600A; NL6615317A; US3483086A; DE1517851B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Alkaloidproduktion in submersen Claviceps-Kulturen unter Verwendung von hierfür üblichen, anorganische Salze enthaltenden Nährmedien.

Die Erzeugung von Mutterkornalkaloiden und verwandten Produkten durch saprophytische Züchtung von Claviceps-Stämmen tritt in den letzteren Jahren immer mehr in den Vordergrund des Interesses; es wurde in der Literatur schon mehrmals über die erfolgreiche Isolierung und Anwendung von Claviceps-Stämmen mit beträchtlicher Produktionsfähigkeit berichtet (vgl. die USA.-Patentschriften 2 809 920, 2 936 266; DT-AS 1073 689; HU-PS 150 631, 151 724 und 152 238). Das Ergebnis derartiger Versuche war aber — wie aus diesen und anderen Literaturangaben hervorgeht — außer von dem Auffinden und Selektieren produktionsfähiger Stämme sehr weitgehend von der Sicherung und Aufrechterhaltung solcher Arbeitsbedingungen abhängig, welche zur Förderung der Alkaloiderzeugung und zur Stabilisierung der Produktionsfähigkeit der alkaloiderzeugenden Stämme geeignet sind. Die optimalen Bedingungen für eine stabile und genügend hohe Alkaloidproduktion konnten aber trotz mannigfacher Untersuchungen und Teilerfolge bisher noch nicht vollständig geklärt werden.

Es wurde schon beobachtet, daß ein Zusammenhang zwischen der Höhe der Alkaloiderzeugung und der Konzentration des Zuckers im Nährboden besteht. Einerseits wird mit der Steigerung der Zuckerkonzentration auch die Menge der erzeugten Mycelien bis zu einer gewissen Grenze erhöht, andererseits erhöhen sich mit der Steigerung der Zuckerkonzentration auch die Geschwindigkeit der Zuckeraufnahme und der Zuckstoffwechsel, was ebenfalls zur Steigerung der Alkaloiderzeugung beiträgt.

Es wurde schon beobachtet, daß ein Zusammenhang zwischen der Höhe der Alkaloiderzeugung und der Zuckerkonzentration im Nährboden besteht. Über einen gewissen Zumsammenhang der Alkaloiderzeugung der Pilze mit dem osmotischen Druck des Mediums wurde schon berichtet; nach E. Teuscher (Die Pharmazie, 16, 570/1961) wurden die unter saprophytischen Bedingungen in Oberflächen- oder submerser Kultur gezüchteten Claviceps-Mycelien vom Nährboden getrennt und in eine Pufferlösung übertragen, und es wurde beobachtet, daß eine solche »ruhende«, in ihrem weiteren Wachstum gehemmte Kultur ebenfalls Alkaloide erzeugt und diese Alkoiderzeugung durch Steigerung des osmotischen Druckes der Pufferlösung (durch Zugabe von Mannit oder Salz) gesteigert werden kann. Über etwaige Beobachtungen bezüglich des osmotischen Druckes der zum Züchten der Pilze geeigneten Nährböden wurde aber in der bisherigen Literatur nichts berichtet.

Um diese Frage zu klären, wurde nun versucht, einerseits den osmotischen Druck des Nährbodens durch Zugabe von die Verwertungsfähigkeit der Pilze überschreitenden Mengen von Zucker weiter zu erhöhen und andererseits die durch die Steigerung der Zuckerkonzentration des Nährbodens bewirkte Erhöhung des osmotischen Druckes auch ohne Anwendung von zusätzlichen Zuckermengen, durch den Zusatz von anorganischen Salzen, besonders von Natriumchlorid, zu erreichen.

Anorganische Salze werden zur Ermöglichung der Lebensvorgänge der Mikroorganismen jedem Nährboden zugesetzt; die zu diesem Zweck angewendeten Sälzmengen sind aber klein, überschreiten im allgemeinen nicht die Grenze von 1 bis 2 g/Liter und ihr Beitrag zum osmotischen Druck der anderen (organische) Bestandteile in weitaus überwiegenden Mengen enthaltenden Nährböden ist praktisch belanglos ( (höchstens 1 atm).

-25 Aus den belgischen Patentschriften 652 378 und 652 379 sind bereits Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden durch submerse Züchtung von Claviceps-Stämmen bekannt, wobei Nährmedien mit osmotischen Drücken von bis zu 14,5 atm zum Einsatz kommen. Diese Nährmedien enthalten jedoch einen hohen Anteil an organischen Stoffen, wie Monosacchariden und organischen Säuren. Die durch die organischen Stoffe bedingte Erhöhung des osmotischen Druckes kommt jedoch nur am Anfang der Ferrnentation zur Geltung, da die Mikroorganismen die organischen Substanzen verbrauchen. Der durch die anorganischen Salze bedingte bleibende osmotische Druck beträgt jedoch nur 0,39 atm.

In überraschender Weise wurde nun gefunden, daß bei Zugabe von anorganischen Salzen in Konzentrationen, die die üblichen Salzkonzentrationen und das zehji- bis zwanzigfache überschreiten und die den osmotischen: Druck im Nährmedium um 2 bis 25 atm erhöhen, das Wachstum der Pilze überhaupt nicht

gehemmt wird; diese Zusätze haben im Gegenteil ' einen äußerst vorteilhaften Einfluß auf die Entwicklung der Kultur, indem sie den infolge des erhöhten Stoffwechsels oft auftretenden Zerfall der Hyphenzellen hemmen und eine sehr wesentliche Steigerung,

der Alkaloidproduktion verursachen. Es ist anzunehmen, daß die günstige Wirkung dem erheblich erhöhten osmotischen Druck zuzuschreiben sei, da die maximale Alkaliodproduktion bei gewissen Werten des osmotischen Druckes unabhängig von der Art des zur Erhöhung des osmotischen Druckes angewendeten Salzes erreicht werden konnte.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Erhöhung der Alkaloidproduktion in submersen Claviceps-Kulturen unter Verwendung von hierfür übliehen, anorganische Salze enthaltenden Nährmedien, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Konzentration der anorganischen Salze 5 bis 50 mg/ml Nährmediüm beträgt.
Zur Steigerung des osmotischen Druckes können beliebige, für die Pilze nichttoxische wasserlösliche Salze, vor allem Alkali- oder Erdalkalichloride, -sulfate, Alkalicarbonate, Alkaliphosphate usw. verwendet werden; sowohl aus wirtschaftlichen als auch

i. ι \j

aus technologischen Gesichtspunkten ist aber die Anwendung von Natriumchlorid besonders vorteilhaft.

Die gewünschte Steigerung des osmotischen Duckes im Kulturmedium könnte zwar auch durch Erhöhung der Zuckerkonzentration des Nährmediums erreicht werden; dies ist aber gar nicht zweckmäßig, da — von den wirtschaftlichen Nachteilen abgesehen — einerseits durch die zu diesem Zweck erforderliche hohe Zuckerkonzentration auch die Viskosität des Mediums allzusehr erhöht und dadurch die Belüftung sowie die Aufarbeitung des Kulturmediums erschwert würde. Weiterhin wird durch die hohe Zuckerkonzentration eine intensive Polysaccharidbildung bei den Claviceps-Stämmen hervorgerufen, wodurch die Züchtung derartiger Kulturen in Fermentoren erschwert und in manchen Fällen sogar unmöglich gemacht wird. Bei der Anwendung von Salzen, besonders von Kochsalz, zur Steigerung des osmotischen Druckes wird dagegen die Polysaccharidbildung sogar herabgesetzt oder völlig gehemmt. Ein weiterer Vorteil der Anwendung von anorganischen Salzen, besonders von Kochsalz, ist der Umstand, daß von diesen Salzen — infolge ihres viel niedrigeren Molekulargewichtes — wesentlich kleinere Mengen zur Erzielung eines gegebenen osmotischen Druckes erforderlich sind, als von den höhere Molekulargewichte zeigenden organischen Zusätzen, besonders von Zuckern.

Der vorteilhafte Einfluß der Steigerung des osmotischen Druckes ist aber nicht unbegrenzt; bei mit steigenden Salzkonzentrationen in sonst gleichen Nährmedien unter Anwendung der gleichen Claviceps-Stämme durchgeführten Versuchsreihen hat sich gezeigt, daß das Wachstum der Myzelien bis zu einem bestimmten Wert des osmotischen Druckes ebenfalls gesteigert wird, dann aber, bei weiterer Steigerung des osmotischen Druckes eine teilweise und allmählich eine völlige Hemmung des Wachstums eintritt. Die Alkaloidproduktion zeigt mit der Steigerung des osmotischen Druckes ein ähnliches Verhalten, erreicht ebenfalls einen maximalen Wert und wird dann bei weiterer Steigerung des osmotischen Druckes verringert. Das Maximum der Alkaloidproduktion wird bei demjenigen osmotischen Druck erreicht, bei welchem das Wachstum der Pilze eben schon teilweise gehemmt wird.

Diese Verhältnisse bestehen in ähnlicher Weise bei jedem, zum saprophytischen Züchten der Claviceps-Stämme geeigneten Nährmedium, die tatsächlichen optimalen, eine maximale Alkaloidproduktion gewährleistenden Werte des osmotischen Druckes sind aber vom gegebenen Nährmedium sowie vom angewendeten Qaviceps-Stamm abhängig. Es kann also bei jedem alkaloidproduzierenden Claviceps-Stamm und bei jedem zur Alkaloidproduktion geeigneten flüssigen Nährmedium durch Zugabe eines für die Pilze nichttoxischen wasserlöslichen anorganischen Salzes ein optimaler osmotischer Druck des Nährbodens leicht experimentell ermittelt und eingestellt werden, bei welchem nebst einer minimalen Hemmung des Wachstums der Kultur eine wesentlich erhöhte Alkaloidproduktion eintritt.

Der durch die Zugabe von anorganischen Salzen erhöhte osmotische Druck wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren während der ganzen weiteren Dauer der alkaloidproduzierenden Fermentation aufrechterhalten. Sollte sich der osmotische Druck des Nährmediums infolge des Verbrauchs der organischen Nährstoffe während der Fermentation erheblich verringern, so können zum Ausgleich des eingetretenen Verlusts weitere Mengen des anorganischen Salzes zugesetzt werden. . .

Um möglichst einfache Bestimmungs- bzw. Berechnungsmethoden bei der Zusammensetzung der Nährböden und bei der Betriebskontrolle zu ermöglichen, wird der osmotische Druck für praktische Zwecke auf Grund der Van t'Hoffschen Formel

" - —n- berechnet, worin T die Temperatur des

Mediums in ⁰K, V die molare Konzentration der gelösten Stoffe bedeuten und R = 0,0821 ist; bei den molaren Konzentrationen der wasserlöslichen anorganischen Salze ist auch die elektrolytische Dissoziation zu berücksichtigen, wobei der Dissoziationsgrad der praktisch in Betracht kommenden Salze einfach als 100 % angenommen werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich grundsätzlich von den von E. Teuscher beschriebenen Versuchen, da bei diesen Versuchen keine hohen Salzkonzentrationen angewendet wurden. Die Mycelien wurden erst nach Abbruch der in üblicher Weise ausgeführten Fermentation vom Fermentationsmedium abgetrennt, in ein zum.Weiterzüchten der Kultur nicht geeignetes Medium übertragen und in diesem, die zum weiteren Wachstum der Pilze erforderlichen Nährstoffe nicht enthaltenden Medium wurde der osmotische Druck durch die Zugabe von Zuckern oder Salzen erhöht und das Myce-Hum in diesem Medium 2 bis 3 Tage weiter inkubiert.

Dieselbe, sogenannte »Replacement«-Methode wurde

auch von anderen, von E. Teuscher zitierten Autoren angewendet. Bei dieser Methode werden nicht die im Entwicklungszustand befindlichen, sondern sogenannte ruhende Kulturen dem Einfluß von erhöhtem osmotischem Druck ausgesetzt, was nicht nur eine prinzipiell andersartige Methode bedeutet, sondern auch in praktischer Hinsicht zum Erreichen der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht geeignet ist, da in diesem Fall die Steigerung der Alkaloidproduktion infolge des späten Eintretens der osmotischen Wirkung erheblich geringer (2- bis 3fach gegenüber der erfindungsgemäß erreichbaren 5- bis lOfachen Steigerung) ist, ferner wird auch der beim erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft mitwirkende günstige Einfluß des erhöhten osmotischen Druckes zur Verhinderung des Zellenzerfalls und der Polysaccharidbildung nicht ausgenützt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch technisch wesentlich zweckmäßiger, da das bei der »Replacemente-Methode nötige Abtrennen und Weiterinkubieren der Macelien unter betrieblichen Verhältnissen ziemlich kompliziert und schwer durchführbar wäre und die Alkaloidgewinnung durch diese weitere Inkubation erheblich verzögert würde. Diese Schwierigkeiten und Nachteile treten bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf.

Das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt sämtliche Nachteile des sogenannten »Replacement»-Verfahrens; durch die Erhöhung des osmotischen Druckes des Nährmediums um 2 bis 25 atm werden die folgenden Vorteile bei der betrieblichen Alkaloidproduktion durch Züchten von Claviceps-Stämmen in submerser Kultur erreicht:

1. Die Alkaloidproduktion wird (im Vergleich zu der ohne Salzzusatz gezüchteten Kultur) auf das 5- bis 1Ofache gesteigert;

2. eine erhebliche Alkaloidproduktion wird auch in solchen Nährmedien erreicht, in welchen die Pilze sich ohne Salzzusatz zwar gut entwickeln, aber keine Alkaloide produzieren;

3. auch Claviceps-Stämme, die unter den üblichen Umständen überhaupt keine oder nur unerhebliche Mengen von Alkaloiden produzieren, zeigen unter Einwirkung des erfindungsgemäßen Salzzusatzes eine erhebliche Produktion von Mutterkornalkaloiden;

4. die bei der Anwendung von zur Polysaccharidbildung neigenden Stämme auftretende nachteilige Erhöhung der Viskosität des Nährmediums wird verhindert, die Fermentationsbrühe kann ohne Schwierigkeiten gerührt und belüftet werden. .

Das erfindungsgemäße Verfahren hat sich bei der Produktion von Mutterkornalkaloiden beider Typen, also sowohl bei den Alkaloiden vom Peptid-Typ als auch bei den Clavin-Alkaloiden, gut bewährt. Unter technischen Bedingungen wurden mit den verschiedensten Arten von Claviceps-Stämmen gute Ergebnisse unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielt; es wurden unter anderem die folgenden Claviceps-Stämme angewendet: der von Korn-Sklerotien stammende, Ergotoxin produzierende mutante Claviceps-purpurea-Stamm Ix 13-26 (OKI 22/1964) sowie der Claviceps-purpurea-Stamm ATCC 15 383.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Von einer 30tägigen, an schrägem Malz-Agar-Nährboden gezüchteten Kultur des Ergotoxin produzierenden Claviceps-purpurea-Stammes Ix 13-26 (OKI 22/1964) wurde die Mycelienschicht in sterilem Wasser suspendiert, und mit dieser Suspension wurden 100 ml eines flüssigen Nährmediums der nachstehenden Zusammensetzung beimpft:

Saccharose, %

Bernsteinsäure, % ..

Ca(NOa)₂, %

KH₂PO₄, %

MgSO₄, %

KCl, %

pH-Wert (mit
NH₄OH eingestellt)

0,1
0, 025

0,025

0,012

5,2

Osmotischer
Druck, atm

6,7

2,05

0,43

0,08

0,10

0,08

Die Kultur wurde bei 24 ⁰C auf einen Schütteltisch inkubiert; nach 7 Tagen wurden 2 Portionen des obigen Nährmediums mit je 25 ml dieser Kultur beimpft und bei 24° C 6 Tage geschüttelt. Mit dem auf diese Weise gewonnenen Inoculum wurden dann in Laboratoriumsfermentoren mit je 6 Liter Nährboden der obigen Zusammensetzung zwei parallele Fermentationen begonnen, wobei zu einer dieser Kulturen noch 2,0 % Kochsalz (osmotischer Druck 6,4 atm) zugesetzt wurden, während die andere Kultur zum Vergleich ohne diesen Salzzusatz fermentiert wurde.

Die Fermentation wurde unter Belüftung (0,5 VoI/ Vol/Min) bei 24⁰C 8 Tage lang durchgeführt, dann wurden die produzierenden Alkaloide mit einem Gemisch von Chloroform und Isopropanol extrahiert, der organische Extrakt wurde mit 1 %iger wäßriger Weinsäurelösung ausgeschüttelt und der Alkaloidgehalt der wäßrigen Phase mit van Urkschem Reagenz (auf Ergotamin-Tartrat bezogen) bestimmt.

Die 2,0% NaCl enthaltende Fermentationsbrühe hatte einen Alkaloidgehalt von 1800 mg/Liter, während in dem ohne diesen Salzzusatz erhaltenen Fermentationsprodukt nur ein Alkaloidgehalt von 400 mg/Liter nachgewiesen werden konnte.

B ei sp i el 2

Mit einer an Malz-Agar gezüchteten Kultur des Stammes Ix 13-26 wurden 10 Portionen von je 200ml des im Beispiel 1 beschriebenen flüssigen Nährmediums beimpft. Nach 8tägigem Schütteln bei 24° C wurden je 400 ml der erhaltenen Inoculum-Kulturen in 5 Laboratoriumsfermentoren, welche je 6 Liter des gleichen, aber mit 2 % Kochsalz ergänzten Nährmediums enthielten, eingetragen. Die Kulturen wurden bei 24° C unter Rühren (220 U/min) und Belüften (1 Vol/Vol/Min.) 7 Tage inkubiert, dann wurden die Kulturen vereinigt, und 25 Liter dieser Kultur wurden in einen 400 Liter des im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums enthaltenden Betriebsfermentor übertragen, in welchem die Fermentation unter den gleichen Umständen 4 Tage lang fortgesetzt wurde. Nach 4 Tagen zeigte das Fermentationsmedium einen pH-Wert von 4,6 bis 4,8, einen Trockensubstanzgehalt von 1,0 bis 1,2% und einen Alkaloidgehalt von 80 bis 120 mg/Liter.

300 Liter dieser Kultur wurden dann in einen 3000 Liter Nährmedium enthaltenden säurefesten Fermentor übertragen; dieses Nährmedium hatte die gleiche Zusammensetzung wie die bisher angewendeten, enthielt aber als Zusatz noch 2,0% Natriumchlorid (osmotischer Druck 6,4 atm). Die Fermentation wurde unter Rühren (200 bis 300 U/min) und Belüften (0,5 bis 1,0 Vol/Vol/Min.) bei 25⁰C 10 Tage lang fortgesetzt.

Nach 10 Tagen zeigte das Fermentationsmedium einen Gesamt-Alkaloidgehalt von 520 mg/Liter.

Das in üblicher Weise isolierte Alkaloidgemisch hatte die folgende Zusammensetzung:

_t 80 mg/Liter Ergotoxin-Base,
105 mg/Liter Ergometrin-Maleat,,
20 mg/Liter Cannoclavin, .

15 mg/Liter verschiedene Clavin-Alkaloide.

Beispiel3

Eine von der American Type Culture Collection erhaltene, dort schon längere Zeit aufbewahrte Schrägagarkultur des Stammes Claviceps-purpurea ATCC 15 383 wurde in 5 ml Bouillon suspendiert und auf Kartoffel-Glucose-Agar geimpft. Nach lOtägiger Inkubierung wurde das Mycel im Wasser suspendiert, homogenisiert und auf folgenden Nährboden geimpft:

Glucose... 10,0%

Zitronensäure 1,0%

Hefeextrakt 0,1 %

KH₂PO₄ , 0,05%

MgSO₄ 0,03%

pH-Wert (mit NH₄OH) auf 5,2 eingestellt.

Die Kultur wurde bei 24⁰C auf einem Schütteltisch inkubiert; nach 6 Tagen wurden dreimal 100 ml der

15

nachstehenden Nährböden mit je 10 ml dieser Kultur beimpft:

a) Saccharose 10,0 %

Asparagin 1,0 %

Hefeextrakt 0,01 %

Ca(NO₃), 0,1%

KH₂PO₄ 0,03%

KCl 0,015%

Cystein 0,001%

pH-Wert (mit NH₄OH) auf 5,5 bis 6,0 eingestellt.

b) Desgleichen mit Zusatz von 3 % NaCl

c) Desgleichen mit Zusatz von 5 % NaCl

851

Die Kulturen wurden 9 Tage bei 24° C geschüttelt. Die produzierten Alkaloide wurden mit einem Gemisch aus Chloroform und Isopropanol extrahiert, die organische Phase mit l%iger wäßriger Weinsäurelösung ausgeschüttelt und der Alkaloidgehalt der wäßrigen Extrakte nach der van Urkschen Farbreaktion (auf Ergotamin-Standard bezogen) bestimmt. Es wurden folgende Lysergsäurewert gefunden:

a) 30 mg/Liter,

b) 84 mg/Liter,

c) 90 mg/Liter.

Obwohl die alkaloidproduzierende Wirksamkeit dieses Stammes infolge der längeren Aufbewahrung nachgelassen hatte, ist der Einfluß der Salzzugabe signifikant.

509 642/9

Claims

ί I UOJ.

Patentanspruch:

Verfahren zur Erhöhung der Alkaloidproduktion in submersen Claviceps-Kulturen unter Verwendung von hierfür üblichen, anorganische Salze enthaltenden Nährmedien, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der anorganischen Salze 5 bis. 50 mg/ml Nährmedium beträgt.