DD227448A1 - Verfahren zur herstellung von zitronensaeure auf mikrobiellem wege - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensaeure auf mikrobiellem Wege. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensaeure mit geringem Isozitronensaeureanteil unter Verwendung aminosaeurebeduerftiger Hefestaemme. Das Ziel der Erfindung ist es, Zitronensaeure auf mikrobiellem Wege ohne Verwendung physiologisch bedenklicher Zusaetze zwecks Reduzierung des Isozitronensaeureanteils herzustellen. Ihre Anwendung liegt in der technischen Mikrobiologie. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass aminosaeurebeduerftige Hefestaemme, insbesondere der methioninbeduerftige der Hefestamm ZIMET 43728 der Art Yarrowia (Saccharomycopsis) lipolytica aerob in fluessigen Medien mit geeigneten C-, N-, P-Quellen, Mineralsalzen und geringen Methionmengen kultiviert werden, die Zitronensaeureausscheidung aus den Hefezellen durch den Verbrauch des extrazellulaeren Methionins induziert und die Saeure mit geeigneten Methoden aus dem Medium isoliert wird.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure auf mikrobiellem Wege

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobielle Herstellung von Zitronensäure durch Hefestämme mit geeigneten Kohlenstoffquellen, wie z.B. Glucose, unter submersen, aeroben Bedingungen«

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der technischen Mikrobiologie·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bekanntlich wird Zitronensäure in der Gegenwart überwiegend durch Fermentation hergestellt. Als Mikroorganismen werden dabei am häufigsten Stämme der Pilzart Aspergillus niger sowie verschiedene Hefearten, insbesondere Yarrowia (Saccha-» romycopsis) lipolytica, und einige Candida-Arten (STOTT-MEISTER, U. j BEHRElTS,' U₀; WEISSBROT, S.; BARTH, G.; FRAlIKE-EIMEE, Do; SCHULZE, E.; Z. AlIg, Mikrobiol., 22 (1982) 399) benutzt. Hierbei ist bekannt, daß bei der Benutzung von Aspergillus niger die Fermentation sehr lange dauert und die Instabilität der Stämme zahlreiche Schwierigkeiten bereitet.

Die Verwendung von Hefestämmen bringt zwar den Vorteil, daß die Fermentationsdauer kurzer ist und Mchtkohlenhydrat-Kohlenstoffquellen zur Zitronensäureproduktion genutzt 7/erden können, hat aber den Nachteil, daß viele dieser Hefearten neben Zitronensäure größere Mengen an Isozitronensäure ausscheiden (STOTTLiEISTER, U. u. a»; Z. AlIg. Mikrobiolo, 22, (1982) 399). Das Vorhandensein von Isozitronen-

säure neben Zitronensäure ist von Nachteil, v/eil Mischungen von beiden Säuren schwierig zur Kristallisation zu bringen sind und somit ein kristallines Endprodukt nur mit hohem technologischen Aufwand herstellbar ist* Die Komplexbildungskonstanten der Isozitronensäure sind geringer als die der Zitronensäure, wodurch die Einsatzmöglichkeiten eines Gemisches beider Säuren mit hohem. Isozitronensäureanteil eingeschränkt werden<> Eine Trennung von Zitronen- und Isozitronensäure ist technologisch sehr aufwendig« Deshalb wird nach Möglichkeiten gesucht, die Ausscheidung von Isozitronensäure durch Hefestämme zu verringern, ohne die Zitronensäureausscheidung wesentlich zu beeinträchtigen

Ss ist bereits beschrieben γ/orden, daß durch den Zusatz von Substanzen zum Fermentationsmedium die Ausscheidung von Isozitronensäure verringert bzw. völlig verhindert werden kann. Besonders wirksam erwiesen sich Monofluorazetat und cC_f pC Dipyridyl (HAIMESHI, T.; YAMOMOTO, M₀; KIMURA, K*; TAHAKA, . K.; J· Ferment«, Technol·, j50 (1972) 855)» Diese Substanzen sind aber für den Einsatz in Fermentationsprozessen nicht geeignet^- weil sie teils toxisch sind, sowie teils nur mit hohem ökonomischen Aufwand bereitgestellt werden können«

Es sind mittels Mutagenese und anschließender Selektion Stämme von verschiedenen Hefearten hergestellt worden, die keine oder nur geringe Mengen Isozitronensäure, aber große Mengen Zitronensäure bilden (AKIYAM, S., SUZUKI, T., SUMIHO, YV, ΗΑΚά.0, Υ.·., FUKUDA, Η.·, Agr. Biol, Chera., 37 (1973) 879; IKEHO, Y., MASUDA, M,, TAMO, K· , OOMORI, I„, TAKAHiISHI, H.., J. Ferment. Technol·, £2 (1975) 752; JA-PS 744 1588; DT-OS 2· 113· 961; DT-OS 2. 264; Sammelbericht mit Zusammenfassung der Patentschriften in: STOTTMEISTER, U. u. a·, Z. AlIg. Mikrobiol., 22 (1982) 399). Hierbei ist von Nachteil, daß solche Stämme nur indirekt, somit sehr aufwendig, über zitratnichtverwertende, monofluorazetatresistente oder -sensitive Zellisolate erhalten werden können. Außerdem lassen sich über diesen Weg nur von bestimmten Hefen solche Stämme isolieren, weil viele Hefe-Zitratproduktionsstämme bereits eine hohe Resistenz gegen Monofluorazetat besitzen

(DT-OS 2.2δ4ο7β4) und monofluorazetatsensitive Isolate τοη diesen Hefen eine Abnahme der Zitratproduktion sowie eine erhöhte Isozitratausscheidung zeigen (BARTH, G_e, Dissertation,, AdW der .DDR, 1980)_o

Bekannt ist weiterhin, daß von Wildstämmen der Hefeart Yarrowia (Saccharomycopsis) lipolytica metMoninbedürftige Stämme durch Mutagenese und nachfolgender Selektion herstellbar sind (OGRIDZIiIE:, D., BASSEL, J., COIiTOPOlILOU, R,, MOKDIMSR, R· , Molec. Gen. Genet., 1β3 (1378) 229; BARTH, G., Y/EBER, H., Z. AlIg* Mikrobiol,,.23 (1983) 147)· Diese Stämme werden technisch bisher nicht genutzt.

Die Zitronensäure-Zlsozitronensäureproduktion wird in den bekannten mikrobiellen Herstellungsverfahren überwiegend durch den Verbrauch des Stickstoffs im Medium eingeleitet. Dabei ist von Nachteil, daß eine neutralisation mit stickstoffhaltigen leutralisationsmitteln, die zu einem höheren Anteil ausgeschiedener Zitronensäure führen (HATTORI, K·, YOKOO, S·, IMADA, 0·, J. Perment. Technol., 52! (1974) 542), nicht möglich ist*

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, Zitronensäure auf mikrobiellem Wege herzustellen,

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mikrobielles Verfahren zu beschreiben, das es erlaubt, Zitronensäure mit Hilfe eines Mikroorganismus in großen Mengen bei gleichzeitig niedrigem Isozitronensäureanteil aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen und ohne Verwendung physiologisch bedenklicher Zusatzstoffe herzustellen«

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Hährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Phosphat-Stickstoffquellen und Mineralsalzen ein aminosäurebedürftiger Mikroorganismus kultiviert wird und die Zitronensäureaus-

Scheidung aus den Zellen durch Auszehrung der benötigten Aminosäure eingeleitet wird·

Der aminosäurebedürftige Mikroorganismus, der in dem vorliegendem Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure verwendet wird, wurde durch Mutagenese-Selektionsprozesse aus Populationen der Hefeart Yarrowia _i (Saccharomycopsis) lipolytica (Stamm H 222) gewonnen und in der ZIMST-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Jena-DDR, unter der Hummer ZIME! 43728 hinterlegt. Danach gehört dieser Zitronensäureproduzent, der Methionin zum Wachstum benötigt, zur Hefeart Saccharomycopsis lipolytica, die nach VAU DER ΙΕΑΙιΐ und VON AEX als larrowia lipolytica zu bezeichnen ist_e

Die Kultivierung des methioninbedürftigen Stammes ZIME02 43728 der Hefeart Yarrowia (Saccharomycopsis) lipolytica erfolgt unter aeroben Bedingungen· Lyophil getrocknetes oder auf komplexen Agarnährböden kultiviertes und bei +4 ⁰C aufbewahrtes Zellmaterial wird auf geeignete., aminosäureenthaltende Agarnährböden geimpft, 1 bis 2 Tage bei 24 ⁰G bis 34 ⁰C bebrütet und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Hährmedien geimpft, die die benötigte Aminosäure mindestens in Konzentrationen von 25 mg/1 enthalten, und unter Schütteln bis zum Erreichen der stationären Wachstumsphase nach 20 h - bis 36 h bei 24 ⁰C bis 34 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰G, inkubiert„ Der pH-Wert dieses Vorkultivierungsraediums beträgt pH 5 bis pH 7, vorzugsweise pH δο Mit dieser dichten Hefezellsuspension wird eine vorher sterilisierte ITährstoff brühe, die eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoff- und Phosphorquelle, Mineralsalze und Kiiamin in Konzentrationen von mindestens 200 ^c- /1, sowie die benötigte Aminosäure in Mengen von höchstens 5 mg/1 enthalten, angeimpft« Je nach der Produktivität des eingesetzten Hefestammes wird 6 bis 8 lage bei 24 ⁰C bis 34 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C, und einem pH-Wert zwischen pH 2,5 und pH 6,5» vorzugsweise pH 5» inkubiert·· Die pH-Regulierung erfolgt z.B. mit Kalziumkarbonat, natronlauge oder Stickstoff-haltigen Heutralisationsmitteln, wie Ammoniak-Wa s ser <.

ITach Abbruch der Fermentation erfolgt die Abtrennung der Hefezellen und die Gewinnung der Zitronensäure aus dem Permentationsmediura in an sich bekannter Art tind Weise·

Die Hauptvorteile der Erfindung bestehen darin, daß ohne den Einsatz toxischer Substanzen eine wesentliche Steigerung des Zitronensäureanteils an der insgesamt ausgeschiedenen Säuremenge erreicht wird und außerdem der Einsatz stickstoffhaltiger Heutralisationsmittel, wie Ammoniak-Wasser, die ebenfalls den Anteil der Zitronensäure beträchtlich erhöhen, technologisch einfach möglich ist₀

Von Vorteil ist außerdem, daß eine Verfahrenskontrolle, die prüfen soll, inwieweit der vorliegende Stamm im Permenter noch dem ursprünglich eingesetzten Stamm entspricht, einfach möglich ist, weil nur auf die entsprechende Aminosäurebedürftigkeit getestet werden muß«

Ausführungsbeispiel ,

Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken·

1· Eine 50 ml-Steilbrustflasche wird mit 10 ml des folgenden Anzuchtmediums gefüllt:

Glucose 2 %

Pep ton 2 %

Hefeextrakt 1 %

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 120 ⁰G. Acidität nach Sterilisation liegt bei 6,O₀ Diese Kulturflüssigkeit wird mit einer Impföse voll Zellmaterial des methioninbedürftigen Stammes Yarrowia (Saccharomycopsis) lipolytica ZIMSI 43728 beimpft und 24 Std. bei 28 ⁰C geschüttelt» Von dieser Zellsuspension wird 1 ml in einen gezähnten 100 ml Erlenmeyerkolben gegeben, der 10 ml des sterilen Vorkulturmedium folgender Zusammensetzung enthält:

ITH₄Cl 1 g/l

KH₂PO₄ 0,25 g/l

MgSO₄ 0,12 g/l

CaCO₃ 1,5 g/l

Spurensalze: CuSO₄ χ- 5H₂O 0^014 g/l j ZnCl 0,007 g/l; CoSO₄ χ 7 H₂O 0_?002 g/l; UmSO₄ ζ 5H₂O 0_?014 g/l; H₃BO₃ 0,020 g/l

Der Kolben wird in üblicher Weise 35 min bei 120 ⁰C sterilisiert. Danach erfolgt die Zugabe der durch Filtration sterilisierten Glucose- (20 g/l), Thiamin-(300^&s /1) und Methioninlösungen (50 rag/l Endkonzentration)· Die Kultivierung wird bei 28 ⁰C für 24 Std_e auf einem Rotationsschüttler durchgeführt· Aus dieser Zellsuspension werden 2 ml Kulturflüssigkeit entnommen und in einen gezähnten 100 ml Erlenmeyerkolben gegeben, in dem sich 10 ml des sterilen Produktionsmediums befinden· Dieses Produktionsmedium enthält die gleichen Mengen an Mineralsalzen wie das Vorkulturmedium, aber größere Mengen an Glucose (80 g/l), Kalziumkarbonat (20 g/l) Thiamin (500^/1) sowie eine geringere Menge an Methionin (5 mg/1)· Diese Hefezellsuspension wird 7 lage bei 28. ⁰C auf einem Rotationsschüttler inkubiert* Nach Abbruch der Fermentation wird Salzsäure der Kulturbrühe zugesetzt, bis ein pH-Wert von etwa pH 2 erreicht ist· Danach werden die Hefezellen durch Zentrifugation von der ITährbrühe abgetrennt· Das Gemisch von Zitronen- und Isozitronensäure wird aus dem Überstand in an sich bekannter Weise isoliert"· Der Hefestamm hatte unter den beschriebenen Bedingungen 41 g/l beider Säuren, davon 39 g/l Zitronensäure, in die KuIturflüssigkeit abgegeben·

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß dem Vorkulturmedium statt Methionin und Thiamin 1,5 g/l Hefeextrakt zugegeben wird und das Produktionsmedium' statt Methionin 0,2 g/l Hefeextrakt enthält»

Man verfährt wie im Beispiel 1 oder im Beispiel 2 mit dem Unterschied, daß dem Produktionsmedium kein Kalziumkarbonat zugesetzt wird, sondern'durch Zugabe von Ammoniak-Wasser ?/ähr end der Produktionsphase ein pH-Wert von pH 5fO bis pH 5,5 eingestellt wird·

Claims (3)

Erfindungsanspruch

1· Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure auf mikrobiellem Wege, gekennzeichnet dadurch, daß aminosäurebedürftige Stämme der Hefeart Xarrowia (Sac charomycop si s ) lipolvtica unter aeroben Bedingungen in flüssigen ITährmedien, die eine Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphatquelle, Mineralsalze sowie die benötigte Aminosäure in wachstumslimitierender Konzentration enthalten, bei einer Temperatur von 24 ⁰G bis 34 ⁰G während eines Zeitraumes von 6 bis 8 Tagen in einem pH-Bereich von pH 2₉5 bis pH 6,5 kultiviert werden und große Mengen Zitronensäure und geringe Mengen Isozitronensäure aus dem Produktionsmedium nach Abbruch der Fermentation mit üblichen Methoden iso·? liert werden»

2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der methioninbedürftige Stamm ZIMET 43728 der Hefeart Yarrowia (Saccharomvcopsis) lipolytica in methioninhaltigen flüssigen ETährmedien bei 28 ⁰G 7 Tage kultiviert wird·

3· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Einstellung des-pH-Wertes von pH·5 bis pH 5>5 während der Produktionsphase sowohl stickstoffreie als auch stickstoffhaltige Neutralisationsmittel dem Medium zugegeben werden«