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Verfahren zur Gewinnung von Vitaminen der B12-Gruppe Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Vitaminen der B12 Gruppe.
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Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen in mehr oder weniger
hohem Ausmaß zur Bildung von Vitamin B12 befähigt sind. So erwiesen sich verschiedene
Stämme von Mycobact. smegmatis, Lactobacillus arabinosus, Bacillus subtilis, Strept.
roseochromogenum, Str. griseus und Str. antibioticus als Vitamin-B,2-Bildner. Auch
über die Isolierung von Vitamin B12 aus einem griseinbildenden Stamm von Strept.
griseus ist bereits berichtet worden. An anderer Stelle wurde besonders bei einem
Bacillus-megatherium-Stamm eine sehr erhebliche Vitamin-Bi.-Bildung festgestellt.
Ferner wurde die Bildung des »animal protein factors« durch Strept. aureofaciens
und die Isolierung von kristallisiertem Vitamin B12 aus einem streptomycin-bildenden
Stamm von Streptomyces griseus beschrieben. Schließlich soll noch Erwähnung finden,
daß die Bildung reichlicher Mengen von Vitamin B12 (bis a y/ccm) durch einen Stamm
von Streptomyces olivaceus bekannt ist. Auch andere Streptomyces-Arten erwiesen
sich zur Bildung von Vitamin B12 (bis a y/ccm) befähigt, und in einer vergleichenden
Untersuchung wurden zahlreiche Actinomyceten als Vitamin-B12-Bildner erkannt.
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In den vorerwähnten Arbeiten wurden Medien zur Erzeugung von Vitamin
B12 empfohlen, die außer Kohlenhydraten, den üblichen Nährsalzen
und
Kobaltionen proteinreiche Materialien, wie z. B. Sojabohnen- und Erdnußextraktrückstände,
Getreideschlempen, Maisquellwasser, Kaseinhydrolysate, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Pepton usw., enthalten. Alle diese bisher benutzten Medien bieten jedoch noch keine
Basis für die Vitamin-B1.-Erzeugung in großem Maßstab, da die erforderlichen Rohstoffe;
wie z. B. Pepton, Fleischextrakt, Kasein usw., entweder zu kostspielig oder infolge
ihres Eiweißgehaltes, wie z. B. bei Verwendung von pflanzlichen Extraktrückständen,
Getreide- oder Melassenschlempen usw., zu leicht infizierbar sind und daher eine
streng sterile Gärführung' erforderlich machen.
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Um die Vitamin-B12-Produktion in größtem Ausmaß durchführen zu können,
mußte daher ein Ausgangsmaterial gesucht werden, das möglichst billig ist und keine
absolut sterile Gärführung notwendig macht, zugleich aber eine zufriedenstellende
Vitamin-B"-Produktion ermöglicht.
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Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, die bei der Zellstofferzeugung
anfallenden Sulfitablaugen und Sulfitablaugenschlempen als Substrate zur Züchtung
von Mikroorganismen zu verwenden.
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Es ist bereits bekannt, daß verschiedene Hefen oder hefeartige Mikroorganismen
zur Züchtung in Sülfitablaugen befähigt sind. Ferner wurde die Erzeugung von Mycelmassen,
z. B. von Aspergillus niger oder Oospora lactis in Sulfitablaugen mit Erfolg durchgeführt.
Auch zur Gewinnung verschiedener Gärprodukte erwiesen sich Sulfitablaugen als geeignet;
so wird vor allem die Spriterzeugung aus Sulfitablaugen in großtechnischem Maßstab
durchgeführt. Bei allen diesen Prozessen ist es notwendig, die Sulfitablaugen in
der Weise vorzubereiten, daß man sie neutralisiert und von schwefliger Säure befreit,
um sie für das Wachstum von Mikroorganismen,geeignet zu machen. Bei anderen Prozessen
müssen die Sulfitablaugen noch viel weitgehender von schädlichen Stoffen befreit
werden. Dies gilt z. B. für deren Vergärung auf Milchsäure, wobei zunächst Kalziumsulfit
ausgefällt werden muß. Noch empfindlicher sind die Butanol-Aceton erzeugenden Clostridien.
Zur erfolgreichen Durchführung der Butanol-Aceton-Gärung in Sulfitablaugen erwies
sich nicht nur deren weitgehende Befreiung von Furfurol und Ameisensäure als notwendig,
sondern auch die Ausfällung der Ligninsulfosäuren in Form von basischen Erdalkalisalzen.
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Zur Verwertung der Sulfitablaugen sind mithin bereits zahlreiche mikrobiologische
Prozesse herangezogen worden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet nun eine weitere
neuartige Verwertungsmöglichkeit von Sulfitablaugen; da sich überraschenderweise
zeigte, daß verschiedene vitamin-B12 bildende Mikroorganismen nach der Adaptation
in Sulfitablauge gezüchtet und zur Produktion von vitamin-B12 haltigem Mycel benutzt
werden können. Vor allem Streptomyceten, wie z. B. Streptomyces olivaceus u. a.,
erwiesen sich zur Züchtung in neutralisierten Sulfitablaugen als geeignet, was nicht
ohne weiteres zu erwarten war, da bekannt ist, daß dieselben nach der bisherigen
Meinung recht empfindlich und wählerisch in ihren Ernährungsansprüchen sind. Besonders
überraschend ist es aber, daß die Sulfitablaugen zwecks Erzeugung von Vitamin B12
durch Züchtung von Streptomyces-Arten nicht so weitgehend vorbehandelt werden müssen,
wie dies z. B. bei ihrer Vergärung auf Milchsäure (Ausfällung von Sulfit) oder auf
Butanol-Aceton (Ausfällung von Sulfit und Lig-ninsulfosäur.en) notwendig ist, und
daß sogar noch nicht einmal die Abtreibung von Schwefeldioxyd erforderlich ist,
wie dies z. B. zur Hefezüchtung und Spriterzeugung, sowie alle anderen bisher in
Sulfitablaugen durchgeführten Züchtungs- und Gärprozesse, notwendig ist. Es genügt
erfindungsgemäß vielmehr lediglich eine Neutralisation der Sulfitablauge.
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Zur Züchtung der Vitamin B12 erzeugenden Streptomyces-Arten können
sowohl die überwiegend hexosehaltigen Nadelholzsulfitablaugen als auch die überwiegend
pentosehaltigen Laub-_holzsulfitablaugen oder die nach der Spritgewinnung aus Nadelholzsulfitablaugen
anfallenden Schlempen dienen. Auf Grund der mit Sulfitablaugen gemachten Erfahrungen
ist es daher nicht mehr weiter überraschend, daß auch Holzhydrolysate in praktisch
gleicher Weise zur Züchtung von Vitamin B12 bildenden Streptomyceten dienen können.
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Die Züchtung der vitamin-B12 =bildenden Streptomyces-Arten in Sulfitablaugenoder
Sulfitablaugenschlempen wird vorteilhafterweise in der Submerskultur unter Belüftung
vorgenommen. Dabei zeigte sich aber, daß es nicht unter allen Umständen möglich
ist, ein Mycel mit zufriedenstellendem Vitamin-B12-Gehalt zu erzeugen. Abgesehen
von der Eignung des -verwendeten Stammes ist die erfolgreiche optimale Durchführung
des Prozesses noch von einer Anzahl bestimmter Faktoren abhängig. Vor allem ist
hierfür von entscheidender Bedeutung, daß man die submers-aerobe Züchtung in Sulfitablaugen
so leitet, daß dabei ein fadenförmiges Mycel entsteht, da Mycelbruchstücke und Sporen
von Streptomyceten technisch nur schwer vom Kulturmedium abgetrennt werden können,
während das fadenförmige, innig verfilzte Mycel leicht gewonnen werden kann. Für
die Entstehung eines vitamin-B"-reichen fadenförmigen Mycels von Streptomyces-Arten
ist - wie ermittelt wurde - die pH-Führung in der Vorkultur sowie bei der Hauptgärung
und die Vermeidung einer Zerschlagung des Mycels durch das Belüftungssystem von
entscheidender Bedeutung. Diese Verfahrensschritte müssen gemeinsam angewendet werden,
um die Züchtung vitamin-B" reicher Streptomyceten in Sulfitablaugen.oder Sulfitablaugenschlempen
mit Erfolg und optimalen Ergebnissen.durchzuführen.
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Es wurde nämlich gefunden, daß z. B. bei Strept. olivaceus nur solche
Vorkulturen geeignet sind; in denen während ihrer Aufzucht der pH-Wert niemals unter
6,6 absinkt, da es sonst nicht gelingt, bei der Hauptgärung ein Mycel mit hohem
Vitamin-B,2-Gehalt zu erzeugen. Ferner muß ein Anstieg des
pH-Wertes
über 7,3 vermieden werden. Ein solcher Anstieg wird normalerweise auch nicht eintreten,
da die Vorkultur zur Weiterzüchtung verwendet wird, bevor noch der PH-Wert ansteigt.
Auch während der Hauptzüchtung muß dafür Sorge getragen werden, daß der PH-Wert
nicht unter 6,6 sinkt und daß der PH-Wert, solange noch assimilierbarer Zucker im
Medium vorhanden ist, also Wachstum stattfinden kann, nicht über 7,3 ansteigt, damit
eine vorzeitige Autolyse vermieden wird. Die Aufrechterhaltung des optimalen pH-Bereiches
gelingt entweder durch Anwendung eines eiweißreichen Mediums, aus dem während der
Entwicklung der Streptomyceten Ammoniak frei wird, oder dadurch, daß während der
Heranzüchtung der Vorkultur und der Hauptkultur fortlaufend der günstigste pH-Bereich
durch Zusatz von Ammoniak, Soda oder anderen Neutralisationsmitteln eingestellt
wird. Der zweite erfindungsgemäß wesentlicheFaktor zur Erzeugung eines vitamin-13,2-reichen
Streptomyceten-Mycels ist die Vermeidung einer Zerschlagung des @lycels durch die
Belüftung. Es muß daher ein Belüftungssystem angewendet werden, bei dem das Mycel
in schonender Weise mit Luft versorgt wird, also eine heftige Bewegung, die zu einem
Zerreißen von Mycelfäden führt, vermieden wird.
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Charakteristisch für das vorliegende Verfahren ist, daß die erwähnten
Faktoren gemeinsam berücksichtigt werden müssen, wenn erfindungsgemäß die Erzeugung
eines vitamin-B,2-reichen Streptomyces-Mycels in Sulfitablaugen erzielt werden soll;
neben einer optimalen PH-Führung bei der Züchtung der Vor- und Hauptkultur ist mithin
die Zerreißung der Mycelfäden zu vermeiden.
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Ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal des Verfahrens ist, daß lediglich
die Heranführung der Vorkultur unter streng sterilen Bedingungen vorgenommen wird,
während bei der zur Gewinnung des v itamin-B"-haltigen Mycels dienenden Hauptgärung
auf die Einhaltung absolut steriler Bedingungen verzichtet werden kann.
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Es ist wohl bekannt, daß bei manchen Gärprozessen, wie z. B. bei der
Sprit- oder Hefeerzeugung, eine absolut sterile Gärführung nicht notwendig ist.
In diesen Fällen hängt dies damit zusammen, daß man unter solchen Bedingungen arbeitet,
die eine Infektionsgefahr von vornherein auf ein Mindestmaß herabdrücken, indem
vor allem bei tiefen PH-Werten gearbeitet wird oder indem anaerobe Verhältnisse
vorliegen oder indem durch Alkoholbildung eine Infizierbarkeit eingeschränkt wird.
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Im vorliegenden Fall muß aber bei einem hohen PH-Wert gearbeitet werden,
also unter Bedingungen, die von vornherein eine hohe bakterielle Infektionsgefahr
mit sich bringen. Aber -auch die anderen für die bisher bekanntgewordenen Verfahren
der nicht absolut sterilen Gärführung zutreffenden Voraussetzungen fehlen in diesem
Fall. Die nicht absolut sterile Gärführung wird vielmehr erfindungsgemäß in der
Weise erzielt, daß man solche Mikroorganismen anwendet, die außer Vitamin B12 noch
ein Antibiotikum bilden, durch das das Aufkommen von Fremdorganismen verhindert
oder zumindest beträchtlich eingeschränkt wird. Außerdem wird die Infektionsgefahr
durch die Verwendung der nur neutralisierten, nicht aber von schwefliger Säure befreiten
Sulfitablaugen noch weiter eingeschränkt.
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Im folgenden soll die Erfindung an Hand von einigen Beispielen erläutert
werden. Beispiel i i oo Teile Fichtenholzablaugenschlempe mit einem Gehalt von o,8°/o
reduzierender Substanz werden mit o,5 % eines Hefehydrolysates, o,2% Diamonphösphat,
0,0250/0 Magnesiumsulfat und i mg°/o Kobaltsulfat versetzt. Nach dem Einstellen
des pH-Wertes auf 7,2 wird mit 5 bis ioo/o einer Vorkultur des Streptomyces olivaoeus
beimpft. Die Vorkultur wird in der Weise erzeugt, daß eine Sporensuspension des
Organismus unter submersen Bedingungen zur Entwicklung gebracht wird, wobei man
folgendes Medium verwendet: 1,5 % technische Glukose, o,5 % Hefehydrolysat, o,2
% Diamonphosphat und o,o25 % Magnesiumsulfat. Es wird dafür Sorge getragen, daß
der pH-Wert während der etwa 24stündigen Vorzüchtung zwischen 6,6 und 7,3 gehalten
wird. In dem mit dieser Vorkultur beimpften oben angeführten Hauptmedium findet
unter submers-aeroben Bedingungen bei etwa 27° eine lebhafte Entwicklung des Streptomyces
olivaceus in Mycelform statt. Der PH-Wert wird in den Grenzen 6,6 bis 7,3 gehalten,
was einerseits durch Zusatz von Ammoniak, andrerseits durch Zusatz von Schwefelsäure
erreicht wird. Nach einer Züchtungsdauer von 36 bis ,48 Stunden ist das Reduktionsvermögen
des Mediums praktisch verschwunden bzw. .auf einen konstanten Wert abgesunken. Durch
Filtration auf einem Saugfilter erhält man einen Mycelbrei, der in üblicher Weise
gewaschen und getrocknet wird. Bezogen auf verbrauchte reduzierende Substanz erhält
man 35 bis ¢5 % an Trockenmycel mit einem Vitamin-Bi.-Gehalt von q.o bis 6o mg j
e kg. Beispiel e ioo Teile Buchenholzsulfitablauge werden in üblicher Weise mit
Kalk neutralisiert und nach dem Abtrennen der unlöslichen Anteile auf einen Gehalt
von o,611/o reduzierender Substanz eingestellt. Im übrigen wird in der gleichen
Weise wie im Beispiel i vorgegangen. Sobald bei der Züchtung des Streptomyces der
Zuckergehalt auf o,2a/o gefallen ist, läßt man kontinuierlich weitere Mengen des
gleichen Mediums zufließen unter gleichzeitiger Entnahme der gleichen Menge anvergorener
Flüssigkeit. Im Verlauf der weiteren Züchtung steigert man allmählich die Konzentration
des zufließenden Mediums in dem Ausmaß, wie die reduzierende Substanz verbraucht
wird, so daß im Fermenter ein annähernd konstanter Gehalt an reduzierender Substanz
aufrechterhalten wird. Der Prozeß wird so lange durchgeführt, als.das Streptomyces-Wachstum
einwandfrei und der Gehalt des Mycels an Vitamin B12 zufriedenstellend ist. Die
Gewinnung des Mycels erfolgt in der gleichen Weise wie in Beispiel
i.
Bezogen auf verbrauchte reduzierende Substanz erhält man q.o bis 45 % an Trockenmycel
mit einem Vitamin-B12-Gehalt von 2o bis 30 mg je kg. Beispiel 3 ioo Teile
Fichtenholzsulfitablauge werden wie in Beispiele vorbereitet und auf ein Reduktionsvermögen
von o,8 % eingestellt. Man beimpft mit io°/o einer Vorkultur des -Streptomyces,
die in einem Medium hergestellt wurde, das i,5 % technische Glukose, 0,5°/o Pepton,
0,5% Fleischextrakt und 0,5 % Natriu.mchlorid enthält. Nach 36- bis 48stiin diger
Züchtung unter submers-aeroben Bedingungen wird das Mycel durch Filtration geerntet,
gewaschen und getrocknet. - Bezogen auf verbrauchte reduzierende Substanz erhält
man q.o bis 45)/o an Trockenmycel mit einem Vitamin-Bl2-Gehalt von 5obis6omgjekg.
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Beispiel q.
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ioo Teile einer nach der teilweisen Verhefung anfallenden Buchenholzsulfitablauge
mit einem Gehalt von o,6% an reduzierender Substanz werden nach Abtrennung des größten
Teils der Hefe aufgekocht und nach Ergänzung des Stickstoffs und des Phosphates
mit einer wie in Beispiel i vorbereiteten Kultur des Streptomyces beimpft. Nach
24-stündiger Züchtung unter submers-:aeroben Bedingungen werden 9o Teile des Mediums
entnommen und zur Mycelgewinnung verwendet. Die restlichen io Teile dienen zum Anstellen
eines in gleicher Weise vorbereiteten Mediums. Dieser Prozeß wird so lange fortgesetzt,
als das Mycelwachstum einwandfrei und der Gehalt an Vitamin B12 zufriedenstellend
ist. Man erhält 35 bis q.o% an Trockenmycel, bezogen auf verbrauchte reduzierende
Substanz mit einem Vitamin-B12 Gehalt von 3o bils 35 mg je kg Trockensubstanz.
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Die nicht absolut sterile Gärführung in der Hauptgärbütte bringt den
Vorteil mit sich, daß das Verfahren im größten Ausmaß durchgeführt werden kann,
was bei den bisher üblichen Methoden, also bei Verwendung absolut steriler Fermenter,
nur mit hohen Kosten möglich ist.
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Ein weiterer beträchtlicher Vorteil des Verfahrens liegt darin, daß
die Sulfitablaugen erfindungsgemäß nicht von schwefliger Säure befreit werden müssen,
wie dies für alle bisher bekanntgewordenen mikrobiologischen Prozesse erforderlich
ist, die sich der Sulfitablaugen als Ausgangsmaterial bedienen. Erfindungsgemäß
ist es nur notwendig, die Sufitablaugen zu neutralisieren und auf den gewünschten
pH-Wert einzustellen. Derartige Maßnahmen stellen einen sehr bedeutsamen Formschritt
in der mikrobiologischen Verwertung von Sulfitablaugen dar. Ein außerordentlicher
Vorteil ist ferner darin zu sehen, daß die aus dem Zellstoff-Kochprozeß stammenden
Sulfitablaugen von vornherein steril sind. Es können sowohl die überwiegend hexösehaltigen
Nädelholzsulfitablaugen als auch die überwiegend pentosehaltigen Laubholzsulfitablaugen
verwendet werden. Schließlich können auch die bei der Spritgewinnung aus Sulfitablaugen
oder Holzhydrolysaten anfallenden Schlempen, die gleichfalls beim Verlassen der
Destillierapparate steril sind, als Ausgangsmaterialien dienen. Die erfindungsgemäße
Verwendung von Sulfitablaugen oder Sulfitablaugenschlempen zur Erzeugung von vitamin-B12
haltigem Streptomyceten-Mycel besitzt daher auch wesentliche wirtschaftliche Vorteile,
da die betreffenden Rohprodukte in größtem Ausmaß anfallen und bisher nicht ausreichend
verwertet werden können.