DE60129091T2

DE60129091T2 - Verfahren zur Herstellung eines Kulturmediums aus erneuerbarem Rohmaterial

Info

Publication number: DE60129091T2
Application number: DE60129091T
Authority: DE
Inventors: Jean-Jacques Caboche; Pierrick Duflot; Catherine Fouache; Laurent Seigueilha
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 2000-11-09
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2021-11-01
Also published as: NO20015422L; AU8927101A; NO20015422D0; FR2816321A1; ATE365809T1; EP1205557A1; JP2002171960A; CA2363287A1; EP1205557B1; DE60129091D1; MXPA01011435A; ES2288919T3; FR2816321B1; US20020079268A1; CN1353191A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren insbesondere zur Herstellung eines Kulturmediums aus einem erneuerbaren Rohmaterial.
Genauer betrifft die Erfindung ein Verfahren insbesondere zur Behandlung von einem erneuerbaren Rohmaterial, derartig, dass es möglich ist, es direkt für eine Fermentationen zur Herstellung von Metaboliten mit hoher Reinheit zu verwenden, ohne dass es notwendig ist, zahlreiche lange und teure Reinigungsschritte einzusetzen, um sie zu isolieren.
In der vorliegenden Erfindung versteht man unter "erneuerbarem Rohmaterial" Abfälle der Lebensmittelindustrie, welche billig, nicht raffiniert, im Allgemeinen nicht toxisch und reich an Stickstoff- und Kohlenstoffquellen sind.
Im Sinne der Erfindung versteht man ebenso unter "Metabolit" die Umwandlungsprodukte der Fermentation von Kohlenstoffquellen, welche direkt durch Mikroorganismen assimilierbar sind. Es handelt sich vorteilhafterweise um Metabolite ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus organischen Säuren, Vitaminen, Aminosäuren und Antibiotika, und vorzugsweise organischen Säuren wie L-Milchsäure.
Im Allgemeinen wird zugegeben, dass die Wahl des erneuerbaren Rohmaterials zugleich auf seiner Verfügbarkeit, seinen Kosten und seiner Fähigkeit, erhöhte Produktivitäten zu erlauben, basiert.
Es wird ebenso zugegeben, dass ein Kulturmedium nicht nur aus einer Kohlenstoffquelle gebildet werden muß, sondern ebenso aus einer Stickstoffquelle, zu welchen man Mineralien und organische Salze hinzufügt.
Die "Kohlenstoffquelle" kann aus erneuerbaren Rohstoffen wie Melasse, Hydrolysaten von Weizenstärke, Mais, Reis, Maniok oder Kartoffeln gezogen werden, aber die "direkt assimilierbaren Kohlenstoffquellen" sind Zucker, welche aus den genannten Kohlenstoffquellen raffiniert oder gereinigt werden, so wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Lactose oder Dextrine.
Beispiele von "Stickstoffquellen" oder Proteinnährstoffen sind diesbezüglich Hefeextrakte, Flüssigkeit von Maismaische (auch Corn Steep Liquor genannt), nichtdenaturierte Milch, Melasseproteine, Fleischextrakte oder Sojamehl. Aber es wird oft bevorzugt, Hefeextrakte als Stickstoffquelle und ebenso Vitamine und Mineralelemente als Ergänzung zu verwenden.
Das Kulturmedium besteht aus einer "direkt assimilierbaren Kohlenstoffquelle", das heißt Glucose oder Saccharose, und Hefeextrakten, wobei das Kulturmedium als Grundlage für eine ganze Anzahl von Fermentationen eingesetzt werden kann, wobei die Fermentationen zur Herstellung von organischen Säuren führen, wie Milchsäure, Propionsäure, Gluconsäure, Zitronensäure ..., essenziellen Aminosäuren wie Lysin, Antibiotika oder beliebigen anderen Metaboliten, welche von industriellem Interesse sind.
Diese Medien eignen sich ebenso für die Produktion von Biomasse (geeignet zur Herstellung von Milchfermenten).
Jedoch wird zugegeben, dass diese Medien den Nachteil aufweisen, dass sie nicht für die Herstellung in industriellem Maßstab genau dieser interessierenden Metabolite vorhersehbar sind (Schwierigkeit, über standardisierte Medien zu verfügen, was ihre Zusammensetzung und zusätzliche Kosten betrifft, welche durch die späteren Reinigungsschritte herbeigeführt werden).
Um die Kosten zu senken, wird beschlossen, Kulturmedien einzusetzen, worin eine der Stickstoff- oder Kohlenwasserstoffquellen durch ein billigeres Rohmaterial beigetragen wird und der andere Bestandteil des Kulturmediums raffiniert oder gereinigt ist.
Es ist zum Beispiel in US 5,416,020 für die Produktion einer organischen Säure wie Milchsäure beschrieben:

– ein Herstellungsverfahren von L-Milchsäure aus Molkepermeat oder Molke, aber es werden ebenfalls Hefeextrakte in Anwesenheit von zweiwertigem Mangan hinzugefügt, mit einer Mutante von Lactobacillus delbrueckii sub. bu/garicus ATCC 55163, welches im wesentlichen L-Milchsäure produziert.

Das Molkepermeat enthält gut von 75 bis 80 Gew.-% Lactose, aber es enthält keine großen Proteine mehr. Ihm fehlt also eine essenzielle Stickstoffquelle für das Wachstum von Mikroorganismen. Darum sind im Komplement Hefeextrakte notwendig. Die hinzugefügte Molke enthält im Wesentlichen in der Größenordnung von 65 bis 75 Gew.-% Lactose.
Das Hefeextrakt trägt nun zum Kulturmedium die Nährstoffe bei, welche nicht auf angemessene Weise durch das Molkepermeat und die Molke selbst beigefügt werden.

– In US 4,467,034 wird gezeigt, dass es möglich ist, Milchsäure aus Molke als Rohmaterial mit einem neuen Lactobacillus bulgaricus DSM 2129 herzustellen.

Die Molke muss jedoch noch mit einer Stickstoffquelle komplementiert werden, das heißt Fleischextrakt, eingeweichter Mais (Corn Steep) oder Sojamehl, und ebenso mit Vitaminen und Mineralsalzen.
Unter diesen Bedingungen, wenn der Einsatz dieser Kulturmedien die Kosten der verwendeten Rohstoffe etwas reduziert, sind bekannte Kombinationen bezüglich des Verhältnisses Stickstoff/Kohlenstoff plus dem Hinzufügen von notwendigen Komplementen für eine effektive Produktivität notwendig.
Außerdem sind diese "rekonstituierten" Medien nicht an die Produktion eines Metaboliten mit hoher Reinheit adaptiert, wie zum Beispiel Milchsäure, welche dann tatsächlich durch eine beliebige der zahlreichen konventionellen Techniken isoliert und gereinigt werden muss, wie Membrantrennungen, Zonenaustausch, Lösungsmittelextraktionen, Elektrodialyse und Präzipitationen von Lactatsalzen.
Es ist ebenso in US 4,769,329 beschrieben, dass es für die Herstellung von optisch reiner Milchsäure mit Lactobacillus notwendig ist, für sein Wachstum eine bestimmte Anzahl von Substanzen hinzuzufügen, welche es nicht selbst herstellen kann, zum Beispiel Biotin, Thiamin, Nikotinsäure, Pyridoxamin, p-Aminobenzoesäure, Pantothensäure und Cyanocobalamin.
Oder diese Bestandteile müssen in Form von komplexen Medien hinzugefügt werden, wie das MRS-Medium (entwickelt von MAN, ROGOSA und SHARPE), welches aber für die Herstellung von Milchsäure auf industrielle Weise nicht verwendbar ist (zu teuer, und es ist ebenso schwierig, was ihre Zusammensetzung betrifft, ein Standardmedium bereitzustellen).
Komplexe Medien aus Rübenmelasse oder Zuckerrohr oder Flüssigkeit von eingeweichtem Mais (Corn-Steep-Flüssigkeit) können nicht für die Herstellung von optisch reiner Milchsäure verwendet werden, obwohl sie das Wachstum von Bakterien stimulieren, weil sie selbst eine substantielle Menge racemischer Milchsäure enthalten.
Optisch reine Säure kann folglich nicht aus dieser racemischen Mischung erhalten werden, außer durch Präzipitations- und Umkristallisationsschritte von Salzen der D- und L-Milchsäure, welche schwierig und teuer sind.
Um eine optisch reine Säure zu erhalten, wird nun geraten, wie im Verfahren nach US 4,769,329 Bäckerhefe als Vitamin-, Stickstoff-, Zucker- und Spurenelementequelle zu verwenden. Das Medium enthält ebenso Glucose, Saccharose oder Lactose als direkt assimilierbare Kohlenstoffquelle, welche in Milchsäure umgewandelt werden kann.
Es ist folglich notwendig, zu einem raffinierten Medium zurückzukehren, welches folglich sehr teuer ist, um einen Metaboliten mit hoher Reinheit herzustellen, hier optisch aktive Milchsäure mit hoher Reinheit.
Eine bestimmte Anzahl von Lösungen wurde vorgeschlagen, um zu versuchen, die Nachteile des vorstehend zitierten Standes der Technik zu beheben.
Die erste Lösung besteht aus der Verwendung von Mikroorganismen, welche insbesondere resistent gegenüber bestimmten Kulturbedingungen sind, oder aus der Verwendung eines Cocktails von Mikroorganismen. Die zweite aus dem Einsatz von Techniken zur vorherigen Behandlung vor dem erneuerbaren Rohstoff. Es ist ebenso möglich, die beiden Lösungen zu kombinieren.
Daher ist also zum Beispiel die Verwendung von Mais in US 4,963,486 als erneuerbarer Rohstoff auf die Verbindung mit einem Rhizopus oryzae beschränkt, welches die einzigartige Fähigkeit hat, zugleich Enzyme zur Verzuckerung von Rohstoffen und Enzyme, welche die Fermentationen davon in L-Milchsäure erlauben, mitzubringen.
Die Fermentationen findet bei einer Temperatur umfasst zwischen 20 und 40°C, vorzugsweise bei 30°C statt. Ein Neutralisationsmittel muss hinzugefügt werden, um den pH zu stabilisieren. Vorzugsweise wird Calciumcarbonat gewählt, da es die Besonderheit aufweist, zur Bildung von Calciumlactat zu führen, welches bei 4°C präzipitiert und also die selektive Gewinnung einer Milchsäure mit hoher Reinheit erlaubt.
Das Reinigungsverfahren von Milchsäure ist jedoch nicht optimiert, da es große Mengen Gips erzeugt, welche für die Umwelt nachteilig sind.
In US 5,464,760 wird daran erinnert, dass die wichtige Bereitstellung von Nahrungsabfällen, welche direkt fermentierbar und im allgemeinen nicht toxisch sind, eine Quelle ist, welche reichlich vorhanden ist und für verschiedene aerobe und anaerobe Bakterien an Kohlenstoff und Stickstoff konzentriert ist. Milchsäure kann also direkt aus Permeat von Molke, Zuckerrohr oder Rüben sogar mit verschiedenen Milchsäurebakterien vom Typ Lactobacillus mit hohem Ertrag, durch Hydrolyse von Stärke aus Mais, Kartoffeln oder Reis gefolgt von der Biokonversion mit den genannten Mikroorganismen hergestellt werden.
Jedoch ist es notwendig, Kulturen zu verwenden, welche aus fünf Stämmen von Milchsäurebakterien gemischt sind, um eine Verzuckerung und eine Fermentationen zu bewirken.
Die Stärke wird extra verflüssigt, dann auf bestimmte pH- und Temperaturbedingungen gebracht, welche das gleichzeitige Einbringen von Glucoamylase mit Milchsäurebakterien erlauben.
Aber diese Lösung ist nicht empfehlenswert, da bekannt ist, dass hydrolysierte Stärke wie Kartoffelhyrolysate, welche aus Kartoffelabfällen oder Glucosesirup hergestellt werden, welche bei jeder Stärkefabrikation verfügbar sind, normalerweise bis 5% "Zuckerverunreinigungen" enthält, d. h. Pentosen, Maltose und Oligosaccharide, welche am Ende der Fermentationen unverbraucht zurückbleiben oder in andere Koprodukte umgewandelt werden, wie Milchsäure, wobei sie Probleme für die nachfolgenden Reinigungsschritte bereiten.
Es ist auch notwendig, ein Nahrungskomplement aus organischen Salzen und Mineralsalzen und Hefeextrakten hinzuzufügen.
Es ist sogar notwendig, Milchsäure entsprechend ihrer Bildung im Kulturmedium durch kontinuierliche Elektrodialyse zu entziehen, um zu vermeiden, dass die Population der eingebrachten Mikroorganismen aus dem Gleichgewicht gebracht wird, wie außerdem in MOTOVOSHI et al. in Appl. Environ. Microbiol. 1986, 52(2), 314-319 gelehrt wird.
Auf dieselbe Weise beschreiben TIWARI et al. in Zbl. Bakt. II. Abt. Bd., 134, 544-546 (1970) die Verwendung von gemischten Kulturen von Lactobacillus bulgaricus, L. casei mit oder ohne L. delbrueckii mit verdünnter Melasse für die Herstellung von Milchsäure.
Diese Technik wird verwendet, um zu versuchen, den Ertrag an Milchsäure aus Melassen zu erhöhen.
Aber der Ertrag geht nicht über 57,9% hinaus, und die Stämme interferieren am häufigsten in ihren jeweiligen Produktionskapazitäten miteinander.
Was die zweite Lösung betrifft, welche aus dem Einsatz einer besonderen Behandlung des erneuerbaren Rohstoffs besteht, kann man sich darauf beziehen, dass im Patent US 3,429,777 einer der erfindungsgemäßen Gegenstände die Nutzung der bemerkenswerten Eigenschaft von Magnesiumlactat, spontan aus Kulturmedium zu kristallisieren, welches Melasse enthält, in einem Reinigungsschritt ist, welcher ausreichend ist, um die Herstellung einer Milchsäure mit hohem Reinheitsgrad aus dem Magnesiumlactat zu erlauben.
Das Verfahren, welches Magnesium verwendet, scheint folglich einfacher und billiger zu sein, als solche, welche normalerweise im Stand der Technik beschrieben sind, wie zum Beispiel mit Calcium. Aber dadurch wird es nicht weniger wahr, dass der Reinheitsgrad des Magnesiumlactates in "roher Zuckerlösung" entsprechend der Natur und der Qualität des verwendeten erneuerbaren Rohmaterials variiert, auch wenn es in besserer Qualität vorliegt als das Calciumlactat.
Die dritte Lösung besteht schließlich aus gleichzeitigem Berücksichtigen von Mikroorganismen und der Behandlung des erneuerbaren Rohmaterials, welche in das Kulturmedium eingebracht werden.
Es wurde zum Beispiel oft vertreten, dass Stärke zum Beispiel eine billige Kohlenstoffquelle ist, aber dass kein Mikroorganismus fähig ist, diese zu metabolisieren, obwohl die Mehrzahl von ihnen Glucose metabolisiert.
Daher schlägt also das in FR 2,635,534 beschriebene Verfahren vor, die Milchsäurefermentationen in Anwesenheit von wenigstens einem Enzym durchzuführen, welches amylolytisch und verzuckernd ist, aber nichts wird über ein Mittel gesagt, um die Verunreinigungen des Kulturmediums zu entfernen, welches auf diese Weise behandelt wurde.
MANHEIM und CHERYAN beschreiben in JAOCSS, 69, 12 1992 die kontrollierte Verwendung von hydrolytischen Enzymen und die Membrantechnologie, um spezifische Fraktionen aus Weizengluten zu isolieren. Diese Techniken sind ebenso auf Soja übertragbar.
Um die Verwendung von Proteinen aus Mehl aus Weizengluten für die menschliche Ernährung zu stimulieren, hat diese Gruppe die Verwendung von Proteasen entwickelt, um einige ihrer funktionellen Eigenschaften zu modifizieren.
Jedoch ist die Verwendung dieser Proteine in der Fermentationsindustrie überhaupt nicht beschrieben oder nahegelegt, noch ist ihre Verwendung für die Herstellung von Metaboliten, welche aus diesen Kulturmedien bequem zu reinigen sind, überhaupt nicht beschrieben oder nahegelegt.
Andere Strategien, welche eingesetzt werden, haben vorgeschlagen, das Kulturmedium nicht zu sehr zu modifizieren und vielmehr die Entwicklung von Produktionsstämmen zu gewährleisten, um die mikrobielle Produktionsrate und den Widerstand gegenüber hohen Gehalten an Milchsäure zu verbessern.
Die klassischen Werkzeuge sind das Recyceln von Biomasse und immobilisierte Zellen.
Die Gewinnung der Milchsäure ist in diesem Falle entsprechend ihrer Herstellung notwendig, um ihre inhibitorische Wirkung auf das bakterielle Wachstum und die bakterielle Produktion zu vermeiden.
Verschiedene Techniken, welche mit der Fermentationen gekoppelt werden, werden verwendet, um Milchsäure kontinuierlich aus dem Kulturmedium zu gewinnen, z. B. Dialyse, Elektrodialyse, Ionenaustauschharze, bipartikuläre Fließbett-Bioreaktoren, Umkehrosmose und flüssig-flüssig-Extraktion.
Jedoch stellen die Kosten des Mediums mehr als 30% der Gesamtkosten der Herstellung dar. Deswegen sind billige Nährstoffe unentbehrlich.
Es scheint folglich so zu sein, dass zahlreiche Versuche gemacht wurden, um die Herstellungskosten von Metaboliten mit hoher Reinheit wie Milchsäure zu vermindern.
Aber aus dem Vorstehenden folgt, dass ein unbefriedigter Bedarf existiert, ein einfaches und wirksames Verfahren einzusetzen, welches erlaubt, mit einer Fermentationen Metaboliten zu produzieren, welche bequem zu reinigen sind, ohne schwierige, zahlreiche und teure Schritte einzusetzen, sowohl auf der Ebene der Herstellung des Kulturmediums als auch auf der Ebene der Gewinnung des Metaboliten aus demselben Kulturmedium.
Es ist folglich notwendig, die Fermentationsbedingungen noch einmal zu überarbeiten, welche alle Verunreinigungen entfernen, welche gewöhnlich die Herstellung des interessierenden Metaboliten begleiten und vor allem seine Reinigung erschweren.
Im Falle von Milchsäure handelt es sich um racemische Mischungen von D- und L-Milchsäure, welche schon im erneuerbaren Ausgangsrohmaterial enthalten sind, und ebenso um alle "zuckerartigen Verunreinigungen", welche vorher gebildet wurden und welche das Kulturmedium am Ende der Fermentationen blockieren.
Indem die anmeldende Gesellschaft bemüht ist, ein Verfahren zu entwickeln, welches es erlaubt, besser als die bereits existierenden auf die praktischen Beschränkungen zu antworten, hat die anmeldende Gesellschaft festgestellt, dass dieser Gegenstand durch ein Verfahren erreicht werden kann, bestehend aus Behandeln von einem erneuerbaren Rohmaterial durch eine Kombination von enzymatischen Schritten, um die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, welche direkt durch Mikroorganismen assimilierbar sind, freizusetzen, und besonderen Trennungsschritten durch Mikrofiltration und Nanofiltration oder Elektrodialyse, um aus dem Medium alle Bestandteile zu entfernen, welche die Qualität des zu isolierenden Metaboliten verändern können und welche ein Risiko zur Behinderung und/oder Erschwerung seiner späteren Reinigung darstellen.
Das Verfahren, welches durch die anmeldende Gesellschaft entwickelt wurde, kann also vorteilhafterweise für die Herstellung von beliebigen interessierenden Metaboliten gewählt werden, und bevorzugt von Metaboliten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus organischen Säuren, Vitaminen, Aminosäuren und Antibiotika.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere an die Herstellung eines Metaboliten ausgewählt aus organischen Säuren angepasst und ist vorzugsweise 1-Milchsäure.
Das Verfahren, welches durch die anmeldende Gesellschaft entwickelt wurde, kann ebenso für die Herstellung von interessierenden Mikroorganismenpopulationen gewählt werden, da es dazu führt, dass ein Kulturmedium erhalten wird, welches von allen Verunreinigungen befreit ist, welche diese Populationen vergiften können, oder von bestimmten Wachstumsinhibitoren, wie es nachstehend beispielhaft dargestellt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren der anmeldenden Gesellschaft zur Herstellung eines Kulturmediums, welches die Herstellung von Metaboliten mit hoher Reinheit aus einem erneuerbaren Rohmaterial erlaubt, ist dadurch gekennzeichnet, dass es besteht aus:

a) gegebenenfalls Behandeln des erneuerbaren Rohmaterials auf die Weise, dass es mit durch Mikroorganismen direkt assimilierbaren Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen angereichert wird, und auf die Weise, dass unlösliche Verunreinigungen entfernt werden,
b) Entfernen der Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht aus dem erneuerbaren Rohmaterial, ohne seinen Gehalt an direkt assimilierbaren Kohlenstoffquellen zu verändern, durch eine Technik ausgewählt aus der Gruppe gebildet aus Nanofiltration und Elektrodialyse, allein oder in Kombination,
c) Behandeln des auf diese Weise von seinen Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht befreiten Rohmaterials auf die Weise, dass es mit durch Mikroorganismen direkt assimilierbaren Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen ergänzt wird,
d) Gewinnen des auf diese Weise erhaltenen Kulturmediums.

Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht gegebenenfalls aus Behandeln des erneuerbaren Rohstoffes auf die Weise, dass darin direkt durch Mikroorganismen assimilierbare Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen angereichert werden, und ebenso auf die Weise, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen.
Diese Behandlungen sollen entsprechend der Natur des erneuerbaren Rohmaterials angepasst werden.
In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wählt man das erneuerbare Rohmaterial aus der Gruppe aus gebildet aus Koprodukten der Stärkeproduktion, vorzugsweise der Stärkeproduktion aus Weizen, Mais, Maniok, Kartoffel, oder den Koprodukten der Behandlung von Gerste, Erbsen, ...
Zum Beispiel wählt man für die Herstellung von L-Milchsäure vorteilhafterweise Koprodukte der Stärkeproduktion aus Weizen, stärker bevorzugt lösliche Stoffe von Weizen oder Koprodukte der Stärkeproduktion aus Mais, stärker bevorzugt die wässrige Flüssigkeit von Maismaische.
Die erneuerbaren Rohmaterialien enthalten hier gleichzeitig Stärke als Kohlenstoffquelle oder Glucose und Proteine mit hohem Molekulargewicht neben Peptiden und freien Aminosäuren als Stickstoffquelle.
Wenn jedoch zugegeben wird, dass bestimmte Mikroorganismen die Fähigkeit haben, Stärke oder Proteine mit hohem Molekulargewicht direkt zu assimilieren, weil sie über die enzymatische Ausstattung verfügen, welche für ihren Abbau, für ihr Wachstum und für die Herstellung von interessierenden Metaboliten notwendig ist, ist es für andere Mikroorganismen notwendig, sie unter Bedingungen zu bringen, unter denen die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen auf die Weise behandelt werden, damit sie direkt assimilierbar sind.
Lösliche Stoffe aus Weizen stammen zum Beispiel aus dem Fluss der Trennung von Weizenstärken "B", welche aus der Trennung von Stärke im Stärkeherstellungsverfahren aus feuchtem Weizen resultiert. Die Stärke "B" oder sekundäre Stärke ist die Stärke, welche im Wesentlichen aus einem überwiegenden Anteil kleiner Stärkekörner oder beschädigter Körner besteht und Verunreinigungen wie Pentosen, Proteine und Lipide enthält.
Diese Verunreinigungen, von denen einige den klassischen Verfahren zur Reinigung und Entmineralisierung entkommen, finden sich in den Hydrolysaten dieser Stärken und verunreinigen also die Stärke B zum Beispiel bei der Herstellung von Dextrose in Nahrungsmittelqualität. Derartige Stärken B finden also schwer industrielle Absatzmöglichkeiten.
Die anmeldende Gesellschaft rät, sie auf eine Temperatur von wenigstens 60°C zu erwärmen und sie mittels einer α-Amylase und einer Glucoamylase zu behandeln, um daraus fermentierbare Zucker freizusetzen, und gegebenenfalls mittels eines Enzyms, welches pflanzliche Fasern abbauen kann, ausgewählt aus der Gruppe aus Hemicellulasen, Pektinasen und Xylanasen, wie es nachstehend exemplarisch dargestellt wird.
Für die wässrige Flüssigkeit von Maismaische, welche direkt einem Silo zur Maisvermaischung entnommen ist, welche eine Trockenmasse umfasst zwischen etwa 9 und etwa 10% darstellt, das sind 35 bis 40 Gew.-% Proteine, wesentliche Bestandteile der wässrigen Flüssigkeit von Maische, welche den Nachteil aufweisen, dass sie kaum assimilierbar sind.
Die anmeldende Gesellschaft hat gezeigt, dass diese Proteine behandelt werden können, indem proteolytische Enzyme ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus alkalischen Proteasen unter pH- und Temperaturbedingungen verwendet werden, welche es erlauben, dass diese Proteine leichter im Fermentationsschritt metabolisiert werden können, welcher später durchgeführt wird. Eine Behandlung bei pH 7 und bei einer Temperatur von 60°C für etwa 6 h bei einer Dosis von 1 % Trockengewicht kann vorteilhafterweise eingesetzt werden.
In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wählt man ein erneuerbares Rohmaterial aus der Gruppe gebildet aus Koprodukten, welche bei der Behandlung von Milch, Gerste, Soja, Zuckerrohr, Zuckerrüben entstehen, allein oder in Kombination.
Zum Beispiel wählt man für die Herstellung von L-Milchsäure vorteilhafterweise Koprodukte, welche bei der Behandlung von Milch entstehen, stärker bevorzugt Molke, und Koprodukte, welche bei der Behandlung von Zuckerrüben entstehen, stärker bevorzugt Melassen.
Die verwendeten erneuerbaren Rohmaterialien enthalten hier Kohlenstoffquellen, welche leichter durch die Mehrzahl der Mikroorganismen assimilierbar sind.
Daher enthalten also die Rübenmelassen im wesentlichen Saccharose als Kohlenstoffquelle, welche von den Mikroorganismen direkt assimiliert werden kann, welche zum Beispiel Milchsäure produzieren.
Auf dieselbe Weise kann Lactose leicht assimiliert werden, welche ein essenzieller Zuckerbestandteil von Molke ist.
Jedoch sind es die Proteine, welche durch bestimmte Mikroorganismen schwer assimilierbar sind.
Im Falle von Koprodukten der Behandlung von Milch zum Beispiel für die Herstellung von Milchsäure kann man folglich vorteilhafterweise mit einer Proteolyse des aus Milch stammenden Ausgangsmaterials, welches Lactose enthält, fortfahren, bevor man die Mikroorganismen tätig werden lässt.
Dieser Proteolyseschritt bildet Peptide, die eine aktivierende Wirkung gegenüber Mikroorganismen haben, welche Milchsäure produzieren.
Das aus Milch stammende Ausgangsmaterial, welches Lactose enthält, kann zum Beispiel eine süße oder saure Molke, ein Permeat einer Ultrazentrifugationen von Molke, Lactose, Mutterlösungen der Lactosekristallisation sein, wobei diese Ausgangsmaterialien außerdem Molkeproteine oder Kasein enthalten können.
Die Proteasen, welche sich zur Verwirklichung der Proteolyse eignen, sollen aus der Gruppe von Pancreatin, Trypsin, Chymotrypsin, Papaïn ... ausgewählt werden.
Entsprechend dem gewählten erneuerbaren Rohmaterial ist es ebenso angemessen, danach gegebenenfalls aus dem Rohmaterial, welches so mit einer direkt assimilierbaren Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle angereichert wurde, die unlöslichen Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht zu entfernen.
Die unlöslichen Verunreinigungen können hauptsächlich aus Fasern bestehen.
Zum Beispiel wird für lösliche Stoffe aus Weizen, welche durch Verflüssigungsenzyme oder Verzuckerungsenzyme von Stärke behandelt werden, vorteilhafterweise mit der Trennung der unlöslichen Stoffe durch eine beliebige Technik fortgefahren, welche dem Fachmann anderweitig bekannt ist, wie Zentrifugationen oder Mikrofiltration, allein oder in Kombination, wie es nachstehend exemplarisch dargestellt wird.
Der zweite Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens, welcher ein wesentliches Merkmal davon darstellt, besteht aus Behandeln des Rohmaterials auf die Weise, dass hauptsächlich die Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht durch eine Technik ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nanofiltration und Elektrodialyse, allein oder in Kombination, entfernt werden, ohne seinen Gehalt an direkt assimilierbaren Kohlenstoffquellen zu verändern.
Die anmeldende Gesellschaft hat also ein technisches Vorurteil überwunden, gemäß dem die Anwendung des Schritts der Nanofiltration und/oder der Elektrodialyse als Anwendung auf ein Medium zur Produktion von Milchsäure am Ende der Fermentation verstanden werden muss, und nicht auf die Anwendung auf ein Kulturmedium selbst vor der Inokulation durch Produktionsmikroorganismen.
Die Kulturmedien, welche aus erneuerbaren Rohmaterial gebildet werden, enthalten eine gewisse Anzahl "Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht", d. h. kleine Moleküle im Sinne der Erfindung, welche die nachfolgenden Reinigungsschritte der Metabolite behindern, welche aus den Kulturmedien hergestellt wurden.
Diese kleinen Moleküle können zum Beispiel Zuckerreste sein, welche von den Mikroorganismen nicht assimilierbar sind, wie C5-Zucker, welche folglich das Kulturmedium vergiften.
Das können gleichermaßen organische Säuren sein, wie racemische D- und L-Milchsäure, welche im Falle der Produktion von Milchsäure als interessierendes Metabolit die bequeme Gewinnung einer optisch reinen Milchsäure verhindern.
Die klassischen Techniken, welche eingesetzt werden, um kleine Moleküle zu entfernen, sind dem Fachmann anderweitig bekannt und bestehen zum Beispiel aus Membranfiltrationstechniken oder einer konventionellen Elektrodialyse, welche an den Größenbereich der genannten Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht angepasst sind.
Jedoch werden diese technischen Lösungen vom Fachmann für die Behandlung von Kulturmedien gewöhnlich nicht in Betracht gezogen, da die Abtrennungsschwelle ebenso zur Entfernung von durch die Mikroorganismen direkt assimilierbaren Kohlenstoffquellen führt, wobei die Kohlenstoffquellen tatsächlich eine Größe im selben Größenbereich wie die Verunreinigungen aufweisen.
Alle diese Techniken, wie sie oben genannt sind, werden folglich tatsächlich wirklich auf das Medium angewendet, aber am Ende der Fermentation.
Die anmeldende Gesellschaft hat folglich das Verdienst, im Gegensatz zu allem, was klassischerweise im Stand der Technik angegeben ist, zu zeigen, dass diese Membranfiltrationstechniken und insbesondere Nanofiltration oder konventionelle Elektrodialyse es erlauben, die Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht auf überraschende und unerwartete Weise zu entfernen, ohne den Gehalt an durch Mikroorganismen direkt assimilierbaren Kohlenstoffquellen zu verändern.
Die Forschungen, welche durch die anmeldende Gesellschaft durchgeführt wurden, haben dazu geführt, Bedingungen des Einsatzes dieser Techniken zu etablieren, welche es erlauben, zu den gewünschten Ergebnissen zu gelangen.
Zum Beispiel hat die anmeldende Gesellschaft für die Herstellung von Milchsäure aus löslichen Stoffen von Weizen gezeigt, dass es das Bringen des Trockengewicht des Mikrofiltrats auf einen Wert umfasst zwischen 2 und 10%, vorzugsweise in der Größenordnung von 4%, wie es nachstehend für die Trennung durch Nanofiltration exemplarisch dargestellt wird, oder auf einen Wert umfasst zwischen 5 und 30%, vorzugsweise in der Größenordnung von 20% für die Passage durch Elektrodialyse erlaubt, alle Kohlenstoffquellen intakt zu lassen und racemische D- und L-Milchsäure praktisch vollständig zu entfernen, wobei den beiden ersten Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens gefolgt wird.
Was die Herstellung von Milchsäure aus der wässrigen Flüssigkeit von Maismaische betrifft, welche zum Beispiel mit alkalischen Proteasen behandelt wird, wie sie gemäß der Lehre der ersten Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wird, führt es ebenso zur Entfernung von praktisch der gesamten racemischen Mischung von D- und L-Milchsäure und der Gehalt an direkt assimilierbaren Kohlenstoffquellen wird nicht verändert, wenn sie wieder auf ein Trockengewicht umfasst zwischen 1 und 16%, vorzugsweise in der Größenordnung von 2% gebracht wird und wenn sie durch konventionelle Elektrodialyse behandelt wird, wie es nachstehend exemplarisch dargestellt wird.
Der dritte Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht aus Behandeln des Rohmaterials, welches so von seinen Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht befreit wurde, auf die Weise, dass es mit durch Mikroorganismen direkt assimilierbaren Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen ergänzt wird.
Man kann tatsächlich wählen, z. B. nach dem Nanofiltrationsschritt die Zufuhr an Stickstoffquellen des Rohmaterials, welches so von seinen Verunreinigungen befreit wurde, zu verbessern.
Im Falle von löslichen Stoffen von Weizen wird gewählt, das Retentat der Nanofiltration mit einer alkalischen Protease vom Typ ALCALASE^® von NOVO zu behandeln, wie es nachstehend exemplarisch dargestellt wird, um die Peptide freizusetzen.
Im Falle der wässrigen Flüssigkeit von Maismaische kann ein Komplement der Kohlenstoffquelle durch Glucose beigefügt werden, oder durch ein erneuerbares Rohmaterial, welches gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurde.
Der letzte Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht schließlich aus Gewinnen des so umgewandelten erneuerbaren Rohmaterials und dessen direkter Verwendung als Kulturmedium.
Die Anreicherung an direkt assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die Entfernung von unlöslichen Verunreinigungen und der Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht durch billige Trennungstechniken über Nanofiltrationsmembranen oder durch ein konventionelles Elektrodialysemodul erlaubt es folglich, ein Medium zu erhalten, welches ganz und gar an die Herstellung von interessierenden Metaboliten angepasst ist, und erlaubt sogar die Herstellung von Populationen von Mikroorganismen, welche von ihren Verunreinigungen befreit sind.
Im besonderen Falle der Herstellung von organischen Säuren und insbesondere von L-Milchsäure fordert folglich die Gewinnung einer optisch reinen Milchsäure, welche die Normen für pharmazeutische Reinheit (thermischer Stabilitätstest der "The United States Pharmacopeia") erfüllt und mit den Normen des "Fond Chemicals Codex" übereinstimmt, nur eine beschränkte Anzahl von Reinigungsschritten.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung erscheinen bei der Lektüre der folgenden Beispiele. Sie sind dennoch nur als Illustration und nicht als Beschränkung gegeben.
Beispiel 1
Lösliche Stoffe aus Weizen mit 4% Trockengewicht, welche aus dem Fluss der Trennung von Weizenstärken "B" stammen, werden für 15 h auf 60°C geheizt und werden mithilfe einer α-Amylase TERMAMYL IC von NOVO mit einer Menge von 0,05% bezogen auf das Trockengewicht und einer Amyloglucosidase OPTIDEX L 300 A von GENENCOR mit einer Menge von 1 % bezogen auf das Trockengewicht behandelt, um die fermentierbaren Zucker freizusetzen. Die unlöslichen Stoffe werden durch Mikrofiltration durch eine Membran von 0,14 μm entfernt.
Das erhaltende Filtrat mit einer Trockenmasse von 3,3% stellt die Zusammensetzung dar, welche in der folgenden Tabelle I gegeben ist. Tabelle I

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Glucose 40

Fructose 10

Hemicellulose 17

Proteine 15

D- und L-Milchsäure 10

Salze und Fette 8
Dieses Mikrofiltrat wird danach durch ein Pilotmodul EURODIA mit einer Oberfläche von 2,5 m², welches mit Nanofiltrationsmembranen vom Typ DL 2540 ausgerüstet ist, mit einem Druck in der Größenordnung von 20 bar nanofiltriert, wobei die Temperatur durch externe Kühlung auf 30°C reguliert wird. Das Permeat weist eine Trockenmasse von 0,3% auf und ist hauptsächlich aus 1 g/l D- und L-Milchsäure und in der Größenordnung von 1 g/l C5-Zuckern (Xylose und Arabinose) zusammengesetzt.
Das Retentat weist nach Konzentration durch die Nanofiltration um den Faktor 4,5 eine Trockenmasse von 16% auf, und die Zusammensetzung ist in der folgenden Tabelle II gegeben. Tabelle II

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Glucose 43

Fructose 10

Hemicellulose 20

Proteine 18

D- und L-Milchsäure 2

Salze und Fette 8
Dieser Schritt erlaubt nun die bedeutsame Entfernung des Racemats aus D- und L-Milchsäure, welches durch die löslichen Stoffe aus Weizen eingebracht wurde.
Die Hemicellulose wird am Ende der Fermentation mit der Biomasse entfernt, aber kann vorteilhafterweise vor dem Schritt der Nanofiltration mithilfe von Endo- und Exoxylanasen hydrolysiert werden, welche dem Fachmann anderweitig bekannt sind.
Man kann nach diesem Nanofiltrationsschritt eine Proteasebehandlung unter den folgenden Bedingungen durchführen, um die Peptide freizusetzen, welche zur Bildung der direkt assimilierbaren Stickstoffquelle des Kulturmediums notwendig sind.
Folglich ist hier keine zusätzliche Zugabe von Peptiden externen Ursprungs notwendig.
Der pH wird auf einen Wert von 7 eingestellt, und die Temperatur wird auf 60°C gebracht. 1 % Protease ALCALASE^® 2.4 L von NOVO bezogen auf das Trockengewicht werden hinzugefügt und bei 60°C für 4 h inkubiert.
Nach diesem Schritt der Proteasehydrolyse wird das Medium durch Erwärmen auf 120°C für 10 min sterilisiert und kann danach direkt als Kulturmedium verwendet werden.
Die folgende Tabelle 111 stellt die Zusammensetzungen von D- und L-Milchsäure dar, welche in einem Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 15 l mit 13 l löslichen Stoffen aus Weizen mit 16% Trockengewicht erhalten wurden, wobei die löslichen Stoffe aus Weizen behandelt oder nicht behandelt wurden.
1,5 l eines Mediums einer 7h-Vorkultur eines Stammes von Lactobacillus lactis werden verwendet, um diese Fermenter zu inokulieren.
Der pH, welcher auf 6,5 eingestellt wird, wird mit 12 N NH₄OH reguliert. Die Temperatur beträgt 40°C. Tabelle III

Nanofiltration Behandlung mit ALCALASE^® Dauer der Fermentation (h) bis Glc = 0 L-Milchsäure (g/l) D-Milchsäure (g/l)

Nein Ja 12 59 2,8

Ja Nein 50 59 0,5

Ja Ja 12 60 0,5
Die endgültige Zusammensetzung des Kulturmediums offenbart folglich lediglich Spuren von D-Milchsäure mit einem Medium, welches durch Nanofiltrationen vorbehandelt wurde.
Die löslichen Stoffe aus Weizen, welche so behandelt werden, erlauben folglich gut, eine effiziente Fermentationen in L-Milchsäure sicherzustellen, welche frei von bedeutsamen Verunreinigungen ist, welche ihre spätere Reinigung behindern könnten.
Beispiel 2
Lösliche Stoffe aus Weizen mit 20% Trockengewicht, welche aus dem Fluss der Trennung von Weizenstärken "B" stammen, werden für 12 h auf 60°C geheizt und werden mithilfe einer α-Amylase TERMAMYL IC von NOVO mit einer Menge von 0,05% bezogen auf das Trockengewicht und einer Amyloglucosidase OPTIDEX L 300 A von GENENCOR mit einer Menge von 1 % bezogen auf das Trockengewicht und einer Hemicellulose SPEZYME CP von GENENCOR mit einer Menge von 0,5% bezogen auf das Trockengewicht behandelt, um die fermentierbaren Zucker freizusetzen. Die unlöslichen Stoffe werden durch Mikrofiltration durch eine Membran von 0,14 μm entfernt.
Das erhaltende Filtrat mit einer Trockenmasse von 16% stellt die Zusammensetzung dar, welche in der folgenden Tabelle IV gegeben ist. Tabelle IV

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Glucose 55,4

Fructose 8,5

Hemicellulose 11

Proteine 6,4

D- und L-Milchsäure 3,8

Salze und Fette 6,3
Dieses Mikrofiltrat wird danach durch konventionelle Elektrodialyse in einem Elektrodialysemodul EUR6B EURODIA, welches mit Ionenaustauschmembranen (NEOSEPIA-TOKUYAMA SODA) vom kationischen Typ CMX-S und anionischen Typ AMX SB mit einer aktiven Oberfläche von 5,6 m² nach den Spezifikationen des Herstellers ausgerüstet ist, behandelt, so dass ermöglicht wird, eine verdünnte Fraktion mit 13,6% Trockengewicht zu erhalten, welche die Zusammensetzung aufweist, welche in der folgenden Tabelle V gegeben ist. Tabelle V

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Gesamtzucker 90,5

Hydrolysierte Proteine 7,5

D- und L-Milchsäure 1,5

Salze und verschiedenes 0,5
Dieser Schritt erlaubt nun die bedeutsame Entfernung des Racemats aus D- und L-Milchsäure, welches durch die löslichen Stoffe aus Weizen eingebracht wurde.
Man kann nach diesem Elektrodialyseschritt eine Proteasebehandlung unter den folgenden Bedingungen durchführen, um die Peptide freizusetzen, welche zur Bildung der direkt assimilierbaren Stickstoffquelle des Kulturmediums notwendig sind.
Folglich ist hier keine zusätzliche Zugabe von Peptiden externen Ursprungs notwendig. Der pH wird auf einen Wert von 7 eingestellt, und die Temperatur wird auf 60°C gebracht. 1 % Protease ALCALASE^® 2.4 L. von NOVO bezogen auf das Trockengewicht werden hinzugefügt und bei 60°C für 4 h inkubiert.
Nach diesem Schritt der Proteasehydrolyse wird das Medium durch Erwärmen auf 120°C für 10 min sterilisiert und kann danach direkt als Kulturmedium verwendet werden.
Die folgende Tabelle VI stellt die Zusammensetzungen von D- und L-Milchsäure dar, welche in einem Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 15 l mit 13 l löslichen Stoffen aus Weizen mit 15% Trockengewicht erhalten wurden, wobei die löslichen Stoffe aus Weizen behandelt oder nicht behandelt wurden. 1,5 l eines Mediums einer 7h-Vorkultur eines Stammes von Lactobacillus lactis werden verwendet, um diese Fermenter zu inokulieren. Der pH, welcher auf 6,5 eingestellt wird, wird mit 12 N NH₄OH reguliert. Die Temperatur beträgt 40°C. Tabelle VI

Elektrodialyse Behandlung mit ALCALASE^® Dauer der Fermentation (h) bis Glc = 0 L-Milchsäure (g/l) D-Milchsäure (g/l)

Nein Ja 18 80 2,2

Ja Ja 22 80 0,8
Die endgültige Zusammensetzung des Kulturmediums offenbart folglich lediglich Spuren von D-Milchsäure mit einem Medium, welches durch Elektrodialyse vorbehandelt wurde.
Die löslichen Stoffe aus Weizen, welche so behandelt werden, erlauben folglich gut, eine effiziente Fermentationen in L-Milchsäure sicherzustellen, welche frei von bedeutsamen Verunreinigungen ist, welche ihre spätere Reinigung behindern könnten.
Beispiel 3
Die wässrige Flüssigkeit von Maismaische, welche einem Zwischensilo der Maisvermaischung entnommen ist, weist eine Trockenmasse von 3,3% auf, wobei die Zusammensetzung in der folgenden Tabelle VII gegeben ist. Tabelle VII

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Gesamtzucker 3

Hydrolysierte Proteine 38

D- und L-Milchsäure 32

Salze und Verschiedenes 27
Da die Maisproteine kaum assimilierbar sind, führt man eine Vorbehandlung mit 1% ALACALASE^® von NOVO bezogen auf das Trockengewicht bei pH 7 bei 60°C für 6 h durch.
Das so erhaltene Mikrofiltrat wird danach durch konventionelle Elektrodialyse in einem Elektrodialysemodul EUR6B EURODIA, welches mit Ionenaustauschmembranen (NEOSEPIA-TOKUYAMA SODA) vom kationischen Typ CMX-S und anionischen Typ AMX SB mit einer aktiven Oberfläche von 5,6 m² nach den Spezifikationen des Herstellers ausgerüstet ist, behandelt, so dass ermöglicht wird, eine verdünnte Fraktion mit 2% Trockengewicht zu erhalten, welche die Zusammensetzung aufweist, welche in der folgenden Tabelle VIII gegeben ist. Tabelle VIII

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Gesamtzucker 4

Hydrolysierte Proteine 51

D- und L-Milchsäure 3

Salze und Verschiedenes 42
Die Vorbehandlung durch ALACALASE^® und die Entfernung von Aminosäuren durch konventionelle Elektrodialyse erlaubt es, am Beginn der Fermentationen über ein Proteinhydrolysat von Mais mit einem Hydrolysegrad von 44 gegenüber 36 der rohen wässrigen Flüssigkeit der Maische zu verfügen, wie es durch das Verhältnis von Aminostickstoff zum Gesamtstickstoff bestimmt wurde.
Die folgende Tabelle IX stellt die Zusammensetzungen von D- und L-Milchsäure dar, welche in einem Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 15 l mit 8,8 l wässriger Flüssigkeit aus Maismaische mit 2% Trockengewicht, zu welcher 60 g/l Glucose als direkt assimilierbare Kohlenstoffquelle hinzugefügt wurden, erhalten wurden, wobei die wässrige Flüssigkeit aus Maismaische behandelt oder nicht behandelt wurde.
1,5 l eines Mediums einer 7h-Vorkultur eines Stammes von Lactobacillus lactis werden verwendet, um diese Fermenter zu inokulieren. Der pH, welcher auf 6,5 eingestellt wird, wird mit 12 N NH₄OH reguliert. Die Temperatur beträgt 40°C. Tabelle IX

Elektrodialyse Behandlung mit ALCALASE^® Dauer der Fermentation (h) bis Glc = 0 L-Milchsäure (g/l) D-Milchsäure (g/l)

Nein Nein 18 62 3,3

Ja Nein 18 59 0,2

Ja Ja 15 59 0,2
Die wässrige Flüssigkeit von Maismaische, welche durch Elektrodialyse behandelt wird, erlaubt folglich gut, eine effiziente Fermentationen in Milchsäure sicherzustellen, welche hier noch frei von signifikanten Verunreinigungen ist, welche ihre spätere Reinigung behindern könnten. Es wird hier außerdem festgestellt, dass die Produktivität durch die Vorbehandlung des Kulturmediums mit ALACALASE^® verbessert wird.
Beispiel 4
Konzentrierte Rübenmelasse, welche wieder auf 10% Trockenmasse verdünnt wurde, wird durch konventionelle Elektrodialyse unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 2 behandelt.
Die Zusammensetzung des Produkts vor der Elektrodialyse wird in der folgenden Tabelle X gegeben. Tabelle X

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Zucker (Saccharose) 66 (95)

Proteine 14

Aschen 12

Organische Säure 4

Verschiedenes (davon Betain) 4
Durch den Schritt der Elektrodialyse erhält man eine Lösung mit 5,3% Trockenmasse, in welcher der Gehalt an Zuckern mehr als 70% beträgt, und der Gehalt an Proteinen in der Größenordnung von 16%.
Mehr als 90% der organischen Säuren, welche im Kulturmedium unerwünscht sind, werden also entfernt.
Beispiel 5
Unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 4 wird eine konzentrierte Rübenmelasse, welche diesmal auf 20% Trockenmasse wiederverdünnt ist, nach einer Mikrofiltration durch konventionelle Elektrodialyse unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 2 behandelt.
Die Zusammensetzung des Produkts vor der Elektrodialyse wird in der folgenden Tabelle XI gegeben. Tabelle XI

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Zucker (Saccharose) 65,4 (95)

Proteine 11,7

Aschen 12,3

Organische Säure 4,4

Verschiedenes (davon Betain) 6,2
Durch den Schritt der Elektrodialyse erhält man hier eine Lösung mit 16,5% Trockenmasse, in welcher der Gehalt an Zuckern mehr als 70% beträgt, und der Gehalt an Proteinen in der Größenordnung von 11%.
Mehr als 90% der organischen Säuren, welche im Kulturmedium unerwünscht sind, werden also entfernt.
Man stellt ein Kulturmedium her, welches 80 g/l elektrodialysierte Melasse wie vorstehend (Medium B) oder nicht elektrodialysiert (Medium A), 5 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4 und 0,5 g/l MgSO4 enthält.
Man sät diese Produktionsmedien mit 10% einer Bäckerhefe (S. cerevisiae) an, welche 24 h in einem Medium mit 50 g/l Glucose und 5 g/l Hefeextrakt vorkultiviert wurde.
Der pH wird mit 1 N NaOH auf 5 eingestellt, die Temperatur beträgt 30°C, und die Produktion der Biomasse wird in einem Reaktor mit 15 l Arbeitsvolumen unter 17 Stunden Rühren bei 600 rpm und einer Belüftung von 1 von durchgeführt.

Die folgenden Tabellen XII und XIII zeigen die Ergebnisse, welche für die Produktion von S. cerevisiae in den Produktionsmedien A bzw. B erhalten wurden. Tabelle XII

	Medium A
Zeit	Biomasse	Saccharose	Glc + Fru	EtOH	K	NH4	PO4
H	g/l	g/l	g/l	g/l	g/l	g/l	g/l
0	0,3	59	3,5	1,8	4,9	1,4	2,2
2	0,6	54,4	3	2,3	n.b.*	n.b.	n.b.
4	1	52,1	4	3	n.b.	n.b.	n.b.
6	1,5	38,5	9,9	4,8	n.b.	n.b.	n.b.
8	2,4	24	15	6,9	n.b.	n.b.	n.b.
14	8,8	0	0	18,5	6,4	0,9	2
17	7,4	0	0	16	n.b.	n.b.	n.b.
*: n.b.: nicht bestimmt

Tabelle XIII

	Medium B
Zeit	Biomasse	Saccharose	Glc + Fru	EtOH	K	NH4	PO4
H	g/l	g/l	g/l	g/l	g/l	g/l	g/l
0	0,3	63,2	0	1,8	1,2	1,3	1,3
2	0,6	60,5	0	2	n.b.	n.b.	n.b.
4	1	57,9	0	2,8	n.b.	n.b.	n.b.
6	1,8	48,5	4	4,4	n.b.	n.b.	n.b.
8	3,1	33,7	9,9	7,1	n.b.	n.b.	n.b.
14	9,6	0	0	18,5	4	0,5	0,8
17	11	0	0	17,5	n.b.	n.b.	n.b.

Es wird daraus gefolgert, dass in einem Medium, worin die Melasse elektrodialysiert wurde, der anfängliche Wachstumsgrad 0,29 h^–1 beträgt und der Biomassegehalt 24% beträgt, während wenn man eine nicht elektrodialysierte Melasse verwendet, erhält man nur einen Wachstumsgrad von 0,26 h^–1 mit einem Biomassegehalt von 17%.
Es scheint folglich so zu sein, dass die Behandlung der Melasse gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ganz und gar an eine effiziente Produktion von Hefen angepasst ist.
Beispiel 6
Molke wird durch konventionelle Elektrodialyse unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 2 behandelt.
Die anfängliche Zusammensetzung von Molke mit 6,6% Trockenmasse wird in der folgenden Tabelle XIV gegeben. Tabelle XIV

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Zucker 71

Proteine 12

Organische Säure 4

Salze 9

Fette 4
Durch den Schritt der konventionellen Elektrodialyse erhält man eine Lösung mit 4,3% Trockenmasse.
Der Gehalt an Zuckern liegt oberhalb von 80% für einen Gehalt an Proteinen in der Größenordnung von 14%.
Die Gesamtheit giftiger organischer Säuren des Mediums wird also entfernt.
Beispiel 7
Molke wird durch konventionelle Elektrodialyse unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 6 behandelt.
Die anfängliche Zusammensetzung von Molke beträgt hier 16,2% Trockenmasse wird in der folgenden Tabelle XV gegeben. Tabelle XV

Bestandteile Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht

Zucker 69,2

Proteine 11

Organische Säure 3,6

Salze 14,6

Fette 1,6
Durch den Schritt der konventionellen Elektrodialyse erhält man eine Lösung mit 14,6% Trockenmasse. Der Gehalt an Zuckern liegt oberhalb von 80% für einen Gehalt an Proteinen in der Größenordnung von 9%. Die Gesamtheit giftiger organischer Säuren des Mediums wird also entfernt.
Die so elektrodialysierte Molke wird unter denen folgenden Bedingungen in ein Medium zur Herstellung von Biomasse gebracht, worin Milchfermente (Streptococcus lactis) und Hefen (S. cerevisiae) vorhanden sind.
Ein Äquivalent "öse" von Zellen, welche aus Kolonien entnommen wurden, welche in Petrischalen kultiviert wurden, wird in einen Erlenmeyerkolben von 2 l, welcher 500 ml Produktionsmedium enthält, welches 80 g/l elektrodialysierte oder nicht elektrodialysierte (Kontrolle) Molke enthält, unter Rühren bei 150 rpm und bei einer Temperatur von 30°C für S. cerevisiae unter aeroben Bedingungen und von 40°C für Streptococcus lactis unter anaeroben Bedingungen gebracht.
Der Gehalt an Biomasse wird gemessen, indem die Zahl der Zellen verfolgt wird.
Die Tabelle XVI zeigt die Ergebnisse, welche nach einer Kultur für 24 Stunden erhalten wurden. Tabelle XVI

Streptococcus lactis S. cerevisiae

mikrofiltrierte Molke 0 1,7 10⁸

mikrofiltrierte und elektrodialysierte Molke 1,7 10⁸ 2,7 10⁸
Die erfindungsgemäße Behandlung durch Elektrodialyse hat folglich eine große Effizienz für die Kultur der beiden getesteten Stämme. Im Falle der klassischen Hefe erlaubt das elektrodialysierte Kulturmedium, die hergestellte Biomasse praktisch zu verdoppeln, während im Falle des Milchferments die mikrofiltrierte Molke sogar einen Wachstumsinhibitor enthält, welcher durch die Elektrodialyse entfernt werden kann.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Kulturmediums, welches die Herstellung von Metaboliten mit hoher Reinheit aus einem erneuerbaren Rohmaterial erlaubt, dadurch gekennzeichnet, dass es besteht aus: a) gegebenenfalls Behandeln des erneuerbaren Rohmaterials auf die Weise, dass es mit durch Mikroorganismen direkt assimilierbaren Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen angereichert wird, und auf die Weise, dass unlösliche Verunreinigungen entfernt werden, b) Entfernen der Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht aus dem erneuerbaren Rohmaterial, ohne seinen Gehalt an direkt assimilierbaren Kohlenstoffquellen zu verändern, durch eine Technik ausgewählt aus der Gruppe gebildet aus Nanofiltration und Elektrodialyse, allein oder in Kombination, c) Behandeln des auf diese Weise von seinen Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht befreiten Rohmaterials auf die Weise, dass es mit durch Mikroorganismen direkt assimilierbaren Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen ergänzt wird, d) Gewinnen des auf diese Weise erhaltenen Kulturmediums.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der durch Kultur hergestellte Metabolit aus der Gruppe gebildet aus organischen Säuren, Vitaminen, Aminosäuren, Antibiotika ausgewählt wird, und dass es vorzugsweise eine organische Säure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Säure L-Milchsäure ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das erneuerbare Rohmaterial ausgewählt wird aus der Gruppe gebildet aus Koprodukten der Stärkeproduktion, vorzugsweise Koprodukten der Stärkeproduktion aus Weizen, Mais, Maniok, Kartoffel oder den Koprodukten der Behandlung von Gerste, Erbsen, und die Gruppe wird vorzugsweise aus löslichen Stoffen von Weizen oder aus der wässrigen Flüssigkeit von Maismaische gebildet.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der erneuerbare Rohstoff ausgewählt wird aus der Gruppe gebildet aus Koprodukten, welche bei der Behandlung von Milch, Soja, Zuckerrohr, Zuckerrüben entstehen, und die Gruppe wird vorzugsweise aus Molke und aus Melassen gebildet.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das erneuerbare Rohmaterial mit einer durch Mikroorganismen assimilierbaren Kohlenstoffquelle angereichert wird, indem Enzyme zur Verflüssigung und Verzuckerung von Stärke und gegebenenfalls ein Enzym geeignet zum Abbau von Pflanzenfasern ausgewählt aus der Gruppe gebildet aus Hemicellulasen, Pektinasen und Xylanasen verwendet werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das erneuerbare Rohmaterial mit einer assimilierbaren Stickstoffquelle angereichert oder ergänzt wird, indem proteolytische Enzyme ausgewählt aus der Gruppe gebildet aus alkalischen Proteasen und sauren Proteasen verwendet werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das erneuerbare Rohmaterial mit einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle angereichert wird, indem Glucose hinzugefügt wird.
Kulturmedium, welches durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 erhalten werden kann.
Verwendung eines Kulturmediums gemäß Anspruch 9 zur Herstellung von Mikroorganismenpopulationen.