DD267999B5 - Verfahren zur herstellung von 2-oxoglutarsaeure durch hefen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-Oxoglutarsäure durch Hefen mit geeigneten Kohlenstoffquellen unter aeroben, submersen Bedingungen und ist somit in das Gebiet der technischen Mikrobiologie einzuordnen.

2-Oxoglutarsäure findet zunehmend Interesse als Ausgangssubstanz für weiterführende chemische Synthesen.

Sie kann chemisch nur in aufwendigen Mehrstufenverfahren hergestellt werden. Es ist bekannt, dass

2-Oxoglutarsäure sowohl durch Bakterien als auch durch Hefen im Kulturmedium akkumuliert werden kann. Als Kohlenstoffquelle werden sowohl Glucose als auch Paraffine eingesetzt.

Mit dem Bakterium Arthrobacter paraffineus Nr. 2411 (ATCC 15 591) z. B. werden maximal 60 g/l 2-Oxoglutarsäure mit einer Produktbildungsgeschwindigkeit von 0,8 g/lh und einer Ausbeute von 74%, bezogen auf das eingesetzte Paraffin erhalten (GB-A 1.102.905,1965, Firma Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Mit dem gleichen Stamm werden infolge Nebenproduktbildung von L-Glutaminsäure geringere Leistungen erzielt (US-A 3.450.599,1965, Fa. Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Es ist bekannt, dass thiaminauxotrope Hefen, besonders der Gattung Candida lipolytica unter Thiaminmangelbedingungen auf der Basis von η-Paraffinen bevorzugt 2-Oxoglutarsäure und auf der Basis von Glucose bevorzugt Brenztraubensäure ausscheiden (Ermakova, J. T. u. a.

Prikladnaja Biochimija i Mikrobiologija 22 (1986) 3, 341-347). Die mit Hefen der Gattung Candida, z. B. Candida lipolytica, erzielten Säurekonzentrationen betragen maximal 48 g/l bei einer Produktbildungsgeschwindigkeit von 0,6 g/lh und einer Ausbeute von 60% (GB-A 1.187.006,1968, Fa. Ajinimoto Co., Inc.).

Mit dem Einsatz des diploiden Stammes von Candida lipolytica D 1805 (FR-A 2.207.989,1973, Inst. Francais du Petrole des Carburants et Lubrificants, Paris) konnten diese Leistungsparameter weit übertroffen werden, so dass eine 2-Oxoglutarsäurekonzentration von 185 g/l in 240 h (Produktivität 0,9 g/lh) mit einer Ausbeute von 80%, bezogen auf die eingesetzte Paraffinmenge, erzielt werden konnte.

Die Nachteile der aufgeführten Verfahren sind die geringen Produktbildungsraten und geringen Endkonzentrationen sowie die Bildung von Nebenprodukten, wie z. B. L-Glutaminsäure (GB-A 1.187.006 und US-A 3.450.599). Von diploiden Leistungsstämmen ist bekannt, dass eine Revertierung in haploide Formen mit geringerer Leistung auftreten kann.

Ziel der Erfindung ist es, mit einer Hefe aus unterschiedlichen Kohlenstoffquellen mittels eines Fermentationsverfahrens 2-Oxoglutarsäure in hohen Endkonzentrationen und mit hoher Produktbildungsgeschwindigkeit herzustellen.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine speziell hergestellte Hefemutante auszuwählen und unter spezifischen Verfahrensbedingungen zu kultivieren.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass man den Hefestamm Yarrowia lipolytica H 222-27-11 (ZIMET 43 856 - Hinterlegungsnummer bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig: DSM 8068) in bekannten Nährmedien bei einem pH-Wert <6,0, vorzugsweise von 3,0 - 4,0, einer optimalen, stammspezifischen Thiaminkonzentration von 0,05 - 0,15 μ9/Ι Thiaminhydrochlorid, einer Temperatur von <37 ⁰C, bevorzugt 28 - 32 "C und einer Gelöstsauerstoffkonzentration von 50 bis 90% kultiviert. Der Stamm zeichnet sich dadurch aus, dass er auf den unterschiedlichsten assimilierbaren Kohlenstoffquellen, wie z. B. η-Paraffinen, Glucose, glucosehaltigen Hydrolysaten, Invertzucker, Triglyceriden, Äthanol, Glycerin, Essigsäure bzw. Acetat in Gegenwart einer mineralischen Nährsalzlösung sowie genau dosierten Wuchsstoffen und Vitamin B1 wächst und 2-Oxoglutarsäure akkumuliert. Besonders auf der Basis von η-Paraffinen werden große Mengen an 2-Oxoglutarsäure mit hoher Produktionsbildungsgeschwindigkeit und hoher Ausbeute, die die bisher bekannten übertreffen, produziert. So beträgt die Produktionsbildungsgeschwindigkeit für 2-Oxoglutarsäure aus η-Paraffinen durchschnittlich 1,4 g/lh, d. h. die Produktionsbildungsleistung ist um etwa 50% höher als die beschriebene Bestleistung mit einem diploiden Stamm, die erzielte Ausbeute um etwa 10%. Eine weitere wesentliche Eigenschaft des Stammes ist darin begründet, dass er unterschiedliche C-Quellen, wie z. B. η-Paraffine und Glucose auch im Gemisch gleichzeitig verwerten kann oder aber, dass man unterschiedliche C-Quellen zu unterschiedlichen Zeiten verwendet, wie z. B. für die Wachstumsphase Paraffin und für die Produktbildungsphase Glucose oder umgekehrt.

Der Stamm behält seine Eigenschaft, 2-Oxoglutarsäure in großen Mengen mit hoher Geschwindigkeit und hoher Ausbeute zu produzieren, unverändert über einen langen Test-Zeitraum von mehreren Jahren.

Nachfolgend wird der neue Stamm charakterisiert:

Der Stamm H 222-27-11, ZIMET 43856 (DSM 8068) stellt eine methioninunabhängige Revertante der methioninbedürftigen, zitronensäureproduzierenden Mutante H 222-27 dar.

1. Morphologische Eigenschaften Kolonien nach 48 h auf YEP-G (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose, pH 5,5 bis 6,0): etwa 2 mm groß, rund, weißgrau, glatt (später faltig) mit glattem Rand. Zellen: deutlicher Dimorphismus, Hefezeilen oval, von unterschiedlicher Größe Hyphen bilden Pseudomyzel

2. Physiologische Eigenschaften Substratverwertung: Glucose + Fructose + Acetat + Äthanol + n-Alkane + Zitronensäure + L-Sorbose

Glyzerin +

Galactose

Lactose

Maltose

Saccharose

Stärke

Maximale Wachstumstemperatur: 25 bis 32 °C Vitaminbedarf: thiaminbedürftig

3. Genetische Eigenschaften Kernstatus: haploid Paarungstyp: A

Genotyp: A, metA, SUPA, SPO In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert:

Beispiel 1:

Zu 31 Medium folgender Zusammensetzung NH₄CI2%, KH₂PO₄ 0,2%, MgSO₄ 7H₂O 0,1%, FeSO₄TH₂O 10 mg/l, ZnSO₄TH₂O 44 mg/l, gelöst in destilliertem Wasser, werden 700 ml η-Paraffine der Kettenlänge Ci₂-Ci₈ zugesetzt.

Das Kulturmedium wird bei 120 ⁰C 30 min sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden 0,3 μg Thiaminhydrochlorid (in 10 ml destilliertem Wasser) gelöst und durch Filtration gesondert sterilisiert sowie 300 ml einer 24 Stunden gewachsenen Kultur der Hefe Yarrowia lipoytica H 222-27-11, ZIMET 43856 (DSM 8068) als Inokulum zugesetzt.

Das Medium für das Inokulum hat folgende Zusammensetzung:

NH₄CI 0,3%, KH₂PO₄ 0,07%, MgSO₄TH₂O 0,035%, Hefeextrakt 0,1%, η-Paraffine Ci₂-Ci₈ 2%, Spurenelemente:

CuSO₄ 5H₂O 1 mg/l, MnSO₄ 4H₂O 15 mg/l, ZnCI₂ 10 mg/l, CoSo₄TH₂O 4 mg/l, H₃BO₃ 40 mg/l, gelöst in

destilliertem Wasser. Die Fermentation wird in einem 12-l-Rührfermentor durchgeführt.

Fermentationsbedingungen: sterile Fermentationsweise, Luftmenge 50 bis 250 l/h, 30 ⁰C, Rührung 1500 bis 2000 U/min, pH-Wert der Wachstumsphase 4,0 bis 5,0, pH-Wert der Produktionsphase 3,5, pH-Regulation mit 40%iger NaOH.

Etwa 10 Stunden nach Wachstumsbeginn der Kultur beginnt die Akkumulation der 2-Oxoglutarsäure, zunächst langsam, später mit einer hohen Produktbildungsgeschwindigkeit von durchschnittlich 1,4 g/l h.

Nach weiteren 90 Stunden wird die Fermentation abgebrochen. Die Konzentration an gebildeter 2-Oxoglutarsäure im Kulturmedium beträgt 125 g/l (unter Berücksichtigung der Verdünnung durch das zugeführte Laugevolumen).

Die erzielte Ausbeute, bezogen auf die eingesetzte Paraffinmenge, einschließlich des Paraffinverbrauches für die Biomassebildung, beträgt 90%.

Beispiel 2

Es wird verfahren, wie im Beispiel 1 beschrieben worden ist. 50 Stunden nach Beginn der Produktbildung werden weitere 350 ml η-Paraffine in steriler Arbeitsweise zugegeben. Die Fermentation wird 100 Stunden fortgesetzt. Nach insgesamt 150 Produktionsstunden beträgt die 2-Oxoglutarsäurekonzentration 195 g/l.

Beispiel 3

Es wird verfahren, wie im Beispiel 1 beschrieben worden ist, wobei jedoch anstelle von Paraffin zur Produktbildung 450 g/l Glucose eingesetzt werden. Die Thiaminkonzentration wird auf 0,3 μ9 Thiaminhydrochlorid erhöht. Nach insgesamt 120 Stunden wird die Fermentation abgebrochen. Im Kulturmedium werden 36 g/l 2-Oxoglutarsäure und 16 g/l Brenztraubensäure bestimmt.

Beispiel 4

Verfahren nach Beispiel 1, wobei anstelle von 700 ml Paraffin zu Beginn der Fermentation ein Gemisch aus Paraffin (300 ml) und Glucose (75 g/l) als Kohlenstoffquellen vorgegeben werden. Nach 90 Stunden wird die Fermentation abgebrochen. Die Konzentration der gebildeten 2-Oxoglutarsäure beträgt 60 g/l.

Claims (3)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung von 2-Oxoglutarsäure durch Hefen, dadurch gekennzeichnet, dass eine stabile Leistungsmutante der Hefe Yarrowia lipolytica H 222-27-11 ZIMET 43856 (DSM 8068) bei einem pH-Wert < 6,0 und einer Temperatur < 37 ⁰C unter aeroben, submersen Bedingungen in bekannter Weise kultiviert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert im Bereich von 3,0-4,0 liegt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur 28 32 °C beträgt.