DE69930070T2

DE69930070T2 - Fermentations-Verfahren zur Herstellung von Erythritol mittels neuer Zellen von Pichia

Info

Publication number: DE69930070T2
Application number: DE69930070T
Authority: DE
Inventors: Sang Yong Kwangmyung-Shi Kim; Deok Kun Oh; Soo Ryun Songpa-Ku Jung
Original assignee: Bolak Co Ltd; BioNgene Co Ltd
Current assignee: Bolak Co Ltd; BioNgene Co Ltd
Priority date: 1999-09-28
Filing date: 1999-09-28
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2019-09-29
Also published as: DE69930070D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Fermentationsverfahren mit einer neuen Mutante von Pichia, das eine hohe Produktivität aufweisen soll, genauer, zur Herstellung von Erythritol unter optimalen Fermentationsbedingungen für die Herstellung maximaler Mengen Erythritols durch Optimierung der Kulturmilieubedingungen, wie pH, Temperatur, und durch Kontrolle des osmotischen Drucks, wobei eine zweistufige Fermentation, bei welcher der osmotische Druck während der Wachstumsphase auf ein niedriges Niveau und während der Herstellungsphase, durch kontinuierliche Zugabe von Glucose, NaCl oder KCl, auf ein relativ hohes Niveau eingestellt wird, verwendet wird.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Erythritol, ein Zuckeralkohol mit vier Kohlenstoffatomen, ist ein natürlich auftretender Stoff und ist weit verbreitet in der Natur. Wie die meisten anderen Polyole ist es ein Metabolit oder eine Speicherverbindung in Seetang und Muscheln. Früchte wie Melonen, Trauben oder Pfirsiche enthalten auch Erythritol. Da es häufig von Bakterien, Pilzen und Hefe hergestellt wird, tritt Erythritol regelmäßig in fermentierten Nahrungsmittelsystemen wie Weinen oder Bieren und vergärten Gemüsen wie Sojasoße oder der orientalischen Misobohnenpaste auf.
Erythritol ist ein mäßig süßes Quellmittel mit 60-70% der Süße von Saccharose in einer 10%-igen Lösung. Seine hohe negative Lösungswärme stattet das kristalline Material mit einem stark kühlenden Effekt aus. Da es einen Geschmack hat, der Saccharose sehr nahe kommt, ohne bitteren Nachgeschmack, ist es ideal zur Verbesserung des Geschmacks einer Kombination mit starken Süßstoffen wie Aspartam.
Erythritol hat, da es ein kleines Molekül ist, stark kolligative Eigenschaften, d.h. einen starken Schmelzpunkt erniedrigenden und Siedepunkt erhöhenden Effekt sowie einen hohen osmotischen Druck. In Verbindung mit seiner niedrigen Hygroskopizität und Viskosität in Lösung ist es sehr nützlich, um die Wasseraktivität von Nahrungsmitteln herabzusetzen und zu steuern.
Eine Erythritolherstellung aus seinen natürlichen Quellen wie Früchten und Gemüsen ist unpraktisch aufgrund der relativ geringen Mengen. Erythritol kann durch Reduktion von Meso-Tartrat, Oxidation und Reduktion von 4,6-O-Ethyliden-D-Glucose, Hydrolyse von Dialdehydstärke oder Addi tion von Wasserstoff chemisch hergestellt werden. Da die Erythritolherstellung durch chemische Methoden sich als sehr teuer erwiesen hat, ist es lohnenswert, ein alternatives Verfahren zur effektiven Herstellung von Erythritol unter Verwendung von Mikroorganismen zu erforschen.
Erythritol kann durch mikrobielle Methoden mit den osmophilen Hefen hergestellt werden, insbesondere mit Spezies der Gattung Torulopsis, wie T. magnoliae, T. veratilis, und T. candida; Endomycopsis chodati; Hansenula supelliculsa, Pichia miso; Monilliella tomentosa var. pollinis; Trigonopsis variabilis; Trichosporonoides; Candida zeylanoides und Aureobasidium. Manche Bakterien wie Leuconostoc oenos können auch Erythritol herstellen. Monilliella fomentosa var. pollinis stellte Erythritol in einem Medium, das 35,7% Glucose enthielt, mit einer Ausbeute von 45,6% her. Eine Erythritolherstellung unter Verwendung dieses Stammes war aufgrund von Nebenprodukten wie Glyzerin und Ribitol nicht auf industrielle Maßstäbe anwendbar. Eine industrielle Produktion von Erythritol wurde mit einer Mutante von Aureobasidium durchgeführt. Die Mutante wurde in einer gemeinsamen Studie von Nikken Chemical und dem National Research Institute of Japan isoliert und entwickelt. Die Mutante produzierte Erythritol mit einer Ausbeute von 47,6% in einem Medium, das 22,5% Glucose enthielt, und einer Volumenproduktivität von 2 g/l·h. Eine Methode zur Herstellung von Erythritol unter Verwendung von Pichia farinosa Zellen wird in U. Hoetmann et al. (1991) Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 258-263 beschrieben.
Es wurde festgestellt, daß die meisten Polyol herstellenden Stämme unter Bedingungen mit hohem osmotischen Druck, wie hohe Konzentrationen von Zuckern und Salzen, wachsen können. Diese Tatsache legt nahe, daß Polyolproduktion mit osmotischem Druck zusammenhängt. Reed et al. berichteten, daß durch Kultivieren eines glycerinherstellenden Stammes unter Bedingungen mit hohem osmotischem Druck die Glycerinproduktivität verbessert wurde. Eine Erythritolherstellung durch Steuerung des osmotischen Drucks wurde jedoch nicht beschrieben.
Daher wurde bei dieser Erfindung ein wilder Stamm von Pichia sp., ein an der Woosuk Universität, Chonbuk, Korea aus der Luft in einer 40%-igen Saccharoselösung isolierter Stamm, für die Produktion von Erythritol ausgewählt. Der wilde Stamm wurde durch Behandlung mit NTG (N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitroguanidin) mutiert. Eine der Mutanten hat im Vergleich zum wilden Stamm bessere Eigenschaften bei der Erythritolausbeute aus Glucose, der volumetrischen Produktivität und der Zuckertoleranz. Unter Verwendung der Mutante von Pichia sp. wurde der Einfluß von osmotischem Druck auf die Erythritolherstellung untersucht und eine zweistufige Fermentation, bei welcher der osmotische Druck während der Wachstumsphase auf ein niedriges Niveau und während der Herstellungsphase auf ein relativ hohes Niveau eingestellt wurde, wurde unter kontinuierlicher Zugabe von Glucose und NaCl oder KCl durchgeführt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, für die Herstellung von Erythritol mit hoher Produktivität neue mutante Zellen von Pichia sp. zur Verfügung zu stellen, die beim Korean Culture Center of Microorganism unter der Hinterlegungsnummer KCCM-10129 am 12. Juni 1998 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt wurden.
Das weitere Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die optimalen Fermentationsbedingungen für die Produktion maximaler Mengen an Erythritol unter Verwendung mutanter Zellen durch Steuerung der folgenden Bedingungen zur Verfügung zu stellen;

i) Fermentieren von Glucosemedium mit mutanten Zellen, wobei a) das Medium für die maximale Produktion von Erythritol sich aus 10-50 (w/v)% Glucose, 0,5-4,0 (w/v)% Hefeextrakt, 0,2-1,0 (w/v)% KH₂PO₄, 0,01-0,04 (w/v)% MgSO₄·7H₂O, 0-5 (w/v)% NaCl, 0-5 (w/v)% KCl zusammensetzt, b) der pH des Kulturmediums 4,5-5,5 beträgt, c) die Kultivierungstemperatur 27-33 °C beträgt, d) die Belüftungsrate des Mediums 0,5-2,0 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute beträgt und e) die Rührgeschwindigkeit des Mediums 300-1200 U.p.M. beträgt;
ii) Entfernen der mutanten Zellen und anderer Rückstände aus dem Fermentationsmedium und
iii) Abtrennen und Gewinnen von Erythritol aus dem Fermentationsmedium von Stufe (ii).

Das weitere Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem die für die Fermentation verwendeten mutanten Zellen durch Kultivieren von Pichia sp. KCCM-10129 in YM-Medium, welches 0,8-1,2 (w/v)% Glucose, 0,4-0,6 (w/v)% Pepton, 0,2-0,4 (w/v)% Hefeextrakt und 0,2-0,4 (w/v)% Malzextrakt enthält, bei 27-33 °C für 20-28 h hergestellt werden.
Das weitere Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen, wobei der osmotische Druck gesteuert wird durch:

i) der osmotische Druck wird auf 0,2-0,7 Osm/kg während der Wachstumsphase und 0,8-1,2 Osm/kg während der Phase der Erythritolherstellung eingestellt und
ii) eine Nährlösung, die Glucose, NaCl oder KCl enthält, die kontinuierlich oder unterbrochen der Kulturbrühe während der Phase der Erythritolherstellung zugeführt. wird, so daß diese 10-20% Glucose, 0-5% NaCl bzw. 0-5% KCl enthält, für die effiziente Herstellung von Erythritol.

Das weitere Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Isolierung von Pichia sp. Mutanten zur Verfügung zu stellen, welches die folgenden Stufen umfaßt:

i) Auftragen und Kultivieren von Wildtyp-Pichia sp. auf Hefe-Malz- (YM-) Medium, welches 0,01 % NTG (N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitroguanidin) enthält,
ii) mindestens dreimaliges Isolieren der erzeugten Kolonien auf YM-Medium,
iii) Auftragen und Kultivieren der Kolonien aus Stufe (ii) auf YM-Medium unter UV-Lichtbestrahlung bei 250-270 nm und
iv) Isolieren der wachsenden Kolonien.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erythritolherstellung mit einer hohen Ausbeute und einer hohen Volumenproduktivität in einer Mutante von Pichia sp., durch Steuerung des osmotischen Drucks.
Die mutanten Zellen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, werden mit dem folgenden Verfahren isoliert.
Pichia sp. wurde bei 28-32 °C für 24 h auf der Fermentationsagarplatte, die 18-22% Glucose enthielt, inkubiert. Eine Einzelkolonie wurde in einem 250 ml Kolben, der 50 ml YM-Brühe enthielt, inkubiert. Sie wurde bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. inkubiert, bis die optische Dichte der Kulturbrühe bei 600 nm den Wert 1,0 erreicht hat. Die gewachsenen Zellen wurden bei 3.000 g für 20 Min. abgetrennt und mit 0,1 M Citratpuffer, pH 5,5, gewaschen. Die abgetrennten Zellen wurden in der Pufferlösung, die 0,01 % NTG enthielt, resuspendiert und bei 28-32 °C für 25-35 Min. inkubiert. Nach der Behandlung mit NTG wurden die Zellen in YM-Brühe bei 28-32 °C für 8-12 h inkubiert und auf der Agarplatte, die 40% Glucose und 2,0% Hefeextrakt enthielt, für die Selektion einer hohe Mengen an Erythritol herstellenden Mutante ausplattiert. Einzelkolonien wurden als schnell wachsende Mutanten ausgewählt. Die ausgewählten Kolonien wurden in das Fermentationsmedium, das 18-22% Glucose enthielt, überführt, zur Untersuchung der Erythritolherstellungsleistung im Schüttelkolben. Nach Inkubation bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. für 100-140 h wurde eine Mutante, die viel Erythritol herstellte, ausgewählt und eine erzeugte Kolonie durch mehr als dreimaliges Wiederholen eines Vereinzelungsverfahrens vereinzelt. Die erhaltene Kolonie wird nochmals ausgestrichen und auf YM-Medium unter UV-Bestrahlung bei 250-270 nm kultiviert. Schließlich wird eine wachsende Kolonie isoliert und als mutante Zellen erhalten und als herstellender Stamm in dieser Erfindung verwendet. Diese mutanten Zellen wurden beim Korean Culture Center of Microorganism mit der Hinterlegungsnummer KCCM-10129 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Das folgende ist ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von Erythritol unter Verwendung mutanter Zellen.
Impfkultur
Gefrorene (–70 °C) mutante Zellen von Pichia sp. wurden in einem 250 ml-Kolben, der 40-60 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5 Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthielt, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. für 20-28 h kultiviert und diese Impfkultur für die Herstellung von Erythritol in einer Hauptkultur in einen 5 l Fermenter überführt.
Hauptkultur
Experimente im Kolben mit Fermentationsmedium wurden bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. für 80-120 h durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus 10-50% Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,5-4,0% Hefeextrakt als Stickstoffquelle, und 0,2-1,0% KH₂PO₄ und 0,01-0,04% MgSO₄·7N₂O wurden als anorganische Quellen verwendet. Für experimentelle Zwecke wurde die Glucosekonzentration eingestellt. Batch und Fed-Batch-Kultur in dem Fermenter wurden bei 27-33 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag im Bereich von 0,5-2,0 vvm. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Erhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300 auf 1200 U.p.M. erhöht. Das Arbeitsvolumen bei Batch-Kultur war 3 l. Die Fed-Batch-Kultur wurde mit einem anfänglichen Medium von 1,8 l und einem Endvolumen von 3 l durch kontinuierliche Zugabe von 1,2 l Nährmedium durchgeführt. Das anfängliche Medium von 1,8 l bestand aus 144-288 g Glucose und 60 g Hefeextrakt, 15 g KH₂PO₄ und 0,6 g MgSO₄·7N₂O. Die 1,2 l Nährmedium enthielten 912-1056 g Glucose und 60 g NaCl. Die Konzentration von Glucose während der Fermentation konnte in dem Bereich von 7,0-9,0%, 9,0-11,0%, 11,0%, 13,0-15,0% und 15,0-17,0% für die entsprechenden Konzentrationseinstellungen von 8,0%, 10,0%, 12,0%, 14,0%, 16,0% durch Einstellen der Pumpgeschwindigkeit des Nährmediums gesteuert werden.
Das Fermentationsverfahren wird bevorzugt durch ein Fed-Batch-Verfahren durchgeführt. Nachdem die Glucose in dem Medium vollständig aufgebraucht ist, wird die Menge an Erythritol durch High Performance Liquid Chromatography mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das Trockenzellgewicht wird unter Verwendung einer Kalibrierungskurve, die aus dem Verhältnis zwischen optischer Dichte bei 600 nm und Trockenzellgewicht erstellt wurde, abgeschätzt. Die Glucose wird mit einem Glucoseoxidase-Kit (Sigma, USA) gemessen. Der osmotische Druck wird mit einem automatischen Halbmikro-Osmometer bestimmt. Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit wird durch die Steigung des Auftrags von Zeit (X) und logarithmischer Zellmasse (Y) bestimmt, und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol wird durch Teilen der Zellmasse durch die Steigung der Erythritolherstellung gegen die Zeit unter Verwendung von polynomischer Regression bestimmt.
Die gemessene Ausbeute an Erythritol beträgt 45-55% des Glucoseverbrauchs und die Volumenproduktivität beträgt 2,0-3,0 g/l·h, welche im Vergleich zu einer herkömmlichen Fermentationsausbeute und -produktivität um das 2 bis 5 -fache gesteigert sind.
Schließlich wird das Fermentationsmedium zentrifugiert, um Zellen und andere Rückstände zu entfernen, und der Überstand wird zur Gewinnung von Erythritol gefiltert und dialysiert.
Die vorliegende Erfindung kann durch die nachfolgenden Beispiele genauer erklärt werden.
BEISPIEL I
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter kultiviert, der Fermentationsmedium, das aus 10-40% Glucose und 2,0% Hefextrakt, 0,5% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O besteht, zur Herstellung von Erythritol in einer Hauptkultur enthält. Die Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 30 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag in dem Bereich von 0,5-2,0 vvm. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Erhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300-1200 U.p.M. erhöht. Das Arbeitsvolumen betrug 3 l.
Nach 40 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 10% Glucose (Osmolarität = 0,52 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 30 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,75 g/l·h.
Nach 66 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 20% Glucose (Osmolarität = 0,9 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 89 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 1,35 g/l·h.
Nach 90 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 30% Glucose (Osmolarität = 1,56 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 158 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 1,76 g/l·h.
Nach 160 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 40% Glucose (Osmolarität = 2,08 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 85 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 0,53 g/l·h und die Restglucose beträgt 8,9%.
BEISPIEL II
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter kultiviert, der Fermentationsmedium, das aus 15% Glucose und 0,75% Hefeextrakt, 0,5% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O, 0,0-0,84 M KCl besteht, zur Produktion von Erythritol in einer Hauptkultur enthält. Die Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 30 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag im Bereich von 0,5-2,0 vvm in 60 h. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Erhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300-1200 U.p.M. erhöht. Das Arbeitsvolumen betrug 3 l.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 0,0 M KCl (Osmolarität = 0,79 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltende Erythritol beträgt 58 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,97 g/l·h.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 0,27 M KCl (Osmolarität = 1,07 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltende Erythritol beträgt 68 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 1,13 g/l·h.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 0,62 M KCl (Osmolarität = 1,66 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltende Erythritol beträgt 81 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 1,35 g/l·h.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 0,0 M KCl (Osmolarität = 2,08 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltende Erythritol beträgt 39 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,65 g/l·h und die Restglucose beträgt 1,5%.
BEISPIEL III
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter kultiviert, der Fermentationsmedium, das aus 15% Glucose und 0,75% Hefeextrakt, 0,5% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O, 0,0-0,82 M NaCl besteht, zur Produktion von Erythritol in einer Hauptkultur enthält. Die Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 30 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag im Bereich von 0,5-2,0 vvm in 60 h. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Erhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300-1200 U.p.M. erhöht. Das Arbeitsvolumen betrug 3 l.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 0,0 M NaCl (Osmolarität = 0,79 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltende Erythritol beträgt 58 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,97 g/l·h.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 0,27 M NaCl (Osmolarität = 1,07 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltende Erythritol beträgt 67 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 1,12 g/l·h.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 0,61 M NaCl (Osmolarität = 1,64 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltende Erythritol beträgt 79 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 1,32 g/l·h und die Restglucose beträgt 0,3%.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 0,0 M KCl (Osmolarität = 2,06 Osm/kg) durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltende Erythritol beträgt 36 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,60 g/l·h und die Restglucose beträgt 1,9%.
BEISPIEL IV
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml-Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l-Fermenter kultiviert, der 3 l Fermentationsmedium, das aus 15% Glucose, 0,75% Hefeextrakt, 0,5% KH₂PO₄ und 0,02% MgSO₄·7H₂O besteht, zur Produktion von Erythritol in einer Hauptkultur enthält. Die Fermentation wird bei 30 °C für 60 h durchgeführt und die Belüftungsrate beträgt 1,0-2,0 vvm, die Rührgeschwindigkeit beträgt 300-1200 U.p.M. und der pH beträgt 3,5-8,5.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und pH 3,5 durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 40 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 0,67 g/l·h und die Restglucose beträgt 1,7%.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und pH 5,5 durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 58 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 0,97 g/l·h.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und pH 7,5 durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 40 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 0,67 g/l·h und die Restglucose beträgt 0,8%.
BEISPIEL V
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter kultiviert, der 3 l Fermentationsmedium, das aus 15% Glucose, 0,75% Hefeextrakt, 0,5% KH₂PO₄ und 0,02% MgSO₄·7H₂O besteht, zur Produktion von Erythritol in einer Hauptkultur enthält. Die Fermentation wird bei pH 5,5 für 60 h durchgeführt und die Belüftungsrate beträgt 1,0-2,0 vvm, die Rührgeschwindigkeit beträgt 300-1200 U.p.M. und die Temperatur beträgt 26-34 °C.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 26 °C durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 32 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 0,53 g/l·h und die Restglucose beträgt 2,4%.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 30 °C durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 58 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 0,97 g/l·h.
Nach 60 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 15% Glucose und 34 °C durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 45 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 0,75 g/l·h und die Restglucose beträgt 1,0%.
BEISPIEL VI
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6 Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter kultiviert, der Fermentationsmedium, das aus 10-40% Glucose und 2,0% Hefextrakt, 0,5% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O besteht, zur Herstellung von Erythritol in einer Hauptkultur enthält. Die Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 30 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag in dem Bereich von 0,5-2,0 vvm. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Erhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300-1200 U.p.M. erhöht. Das Arbeitsvolumen betrug 3 l.
Eine Fermentation mit 10% Glucose (Osmolarität = 0,52 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,13 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,05 g/g·h.
Eine Fermentation mit 20% Glucose (Osmolarität = 0,99 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,13 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,10 g/g·h.
Eine Fermentation mit 30% Glucose (Osmolarität = 1,56 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,13 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,13 g/g·h.
Eine Fermentation mit 40% Glucose (Osmolarität = 2,08 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,13 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,09 g/g·h.
BEISPIEL VII
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter kultiviert, der Fermentationsmedium, das aus 15% Glucose und 0,75% Hefeextrakt, 0,5% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O, 0,0-0,84 M KCl besteht zur Produktion von Erythritol in einer Hauptkultur enthält. Die Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 30 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag im Bereich von 0,5-2,0 vvm in 60 h. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Erhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300-1200 U.p.M. erhöht. Das Arbeitsvolumen betrug 3 l.
Eine Fermentation mit 15% Glucose und 0,0 M KCl (Osmolarität = 0,79 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,12 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,07 g/g·h.
Eine Fermentation mit 15% Glucose und 0,27 M KCl (Osmolarität = 1,07 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,11 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,10 g/g·h.
Eine Fermentation mit 15% Glucose und 0,62 M KCl (Osmolarität = 1,66 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,10 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,13 g/g·h.
Eine Fermentation mit 15% Glucose und 0,84 M KCl (Osmolarität = 2,08 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,06 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,09 g/g·h.
BEISPIEL VIII
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter kultiviert, der Fermentationsmedium, das aus 15% Glucose und 0,75% Hefeextrakt, 0,5% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O, 0,0-0,82 M NaCl besteht, zur Produktion von Erythritol in einer Hauptkultur enthält. Die Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 30 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag im Bereich von 0,5-2,0 vvm in 60 h. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Erhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300-1200 U.p.M. erhöht. Das Arbeitsvolumen betrug 3 l.
Eine Fermentation mit 15% Glucose und 0,0 M NaCl (Osmolarität = 0,79 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,12 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,07 g/g·h.
Eine Fermentation mit 15% Glucose und 0,27 M NaCl (Osmolarität = 1,07 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,11 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,10 g/g·h.
Eine Fermentation mit 15% Glucose und 0,61 M NaCl (Osmolarität = 1,64 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,10 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,12 g/g·h.
Eine Fermentation mit 15% Glucose und 0,82 M NaCl (Osmolarität = 2,06 Osm/kg) wird durchgeführt. Die erhaltene spezifische Wachstumsgeschwindigkeit beträgt 0,06 h^–1 und die spezifische Herstellungsgeschwindigkeit von Erythritol beträgt 0,08 g/g·h.
BEISPIEL IX
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter zur Produktion von Erythritol in einer Hauptkultur kultiviert. Experimente mit einem Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 30 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag im Bereich von 0,5-2,0 vvm. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Erhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300-1200 U.p.M. erhöht. Eine Fed-Batch-Kultur wurde mit einem anfänglichen Medium von 1,8 l und einem Endvolumen von 3 l durch kontinuierliche Zugabe von 1,2 l Nährmedium durchgeführt. Das anfängliche Medium von 1,8 l bestand aus 144-288 g Glucose und 60 g Hefeextrakt, 15 g KH₂PO₄, und 0,6 g MgSO₄·7H₂O. Die 1,2 l Nährmedium enthielten 912-1056 g Glucose. Die Konzentration von Glucose während der Fermentation konnte im Bereich von 7,0-9,0%, 9,0-11,0%, 11,0%, 13,0-15,0% und 15,0-17,0% entsprechend der jeweiligen Einstellung der Konzentration auf 8,0%, 10,0%, 12,0%, 14,0%, 16,0% durch Anpassen der Pumpgeschwindigkeit des Nährmediums gesteuert werden.
Nach 104 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 40% Glucose durch Steuerung der Glucosekonzentration auf 8,0% gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 167 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 1,61 g/l·h.
Nach 86 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 40% Glucose durch Steuerung der Glucosekonzentration auf 12,0% gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 205 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 2,38 g/l·h.
BEISPIEL X
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter kultiviert, der Fermentationsmedium enthält, welches aus 15% Glucose, 0,75% Hefeextrakt, 0,5% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O besteht, zur Produktion von Erythritol in einer Hauptkultur enthält. Die Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 30 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag im Bereich von 0,5-2,0 vvm. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Aufrechterhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300-1200 U.p.M. erhöht. Das Arbeitsvolumen betrug 3 l.
Nach 90 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 30% Glucose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 160 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 1,78 g/l·h.
BEISPIEL XI
Die gefrorenen (–70 °C) mutanten Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129) werden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (0,8-1,2% Glucose, 0,4-0,6% Pepton, 0,3-0,5% Hefeextrakt und 0,2-0,4% Malzextrakt) enthält, bei 28-32 °C und 220-260 U.p.M. kultiviert. Die Impfzellen werden in einem 5 l Fermenter zur Produktion von Erythritol in einer Hauptkultur kultiviert. Die Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 30 °C und pH 5,5 während der Fermentation durchgeführt. Die Belüftungsrate lag im Bereich von 0,5-2,0 vvm. Die Rührgeschwindigkeit wurde zur Aufrechterhaltung des Niveaus an gelöstem Sauerstoff bei über 20% stufenweise von 300-1200 U.p.M. erhöht. Eine Fed-Batch-Kultur wurde mit einem anfänglichen Medium von 1,8 l und einem Endvolumen von 3 l durch kontinuierliche Zugabe von 1,2 l Nährmedium durchgeführt. Die 1,8 l anfängliches Medium bestanden aus 180 g Glucose und 60 g Hefeextrakt, 15 g KH₂PO₄ und 0,6 g MgSO₄·7H₂O. Die 1,2 l Nährmedium enthielten 1020 g Glucose, und 60 g NaCl wurde nach 20 h hinzugegeben. Die Konzentration der Glucose während der Fermentation konnte im Bereich von 11,0-13,0% durch Anpassen der Pumpgeschwindigkeit des Nährmediums gesteuert werden.
Nach 72 h Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 40% Glucose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 212 g/l, die Volumenproduktivität beträgt 2,94 g/l·h.

Claims

Fermentationsverfahren für die Herstellung maximaler Mengen an Erythritol unter Verwendung einer Mutante von Pichia sp., die beim Korean Culture Center of Microorganism unter der Hinterlegungsnummer KCCM-10129 hinterlegt wurde, welches die folgenden Stufen umfaßt: i) Fermentieren von Glucosemedium mit mutanten Zellen, wobei a) das Medium für die Herstellung maximaler Mengen an Erythritol sich aus 10-50 (w/v)% Glucose, 0,5-4,0 (w/v)% Hefeextrakt, 0,2-1,0 (w/v)% KH₂PO₄, 0,01-0,04 (w/v)% MgSO₄·7H₂O, 0-5 (w/v)% NaCl und 0-5 (w/v)% KCl zusammensetzt, b) der pH-Wert des Kulturmediums 4,5-5,5 beträgt, c) die Kultivierungstemperatur 27-33°C beträgt, d) die Belüftungsrate des Mediums 0,5-2,0 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute beträgt und e) die Rührgeschwindigkeit des Mediums 300-1200 U.p.M. beträgt, ii) Entfernen der Mutantenzellen und anderer Rückstände aus dem Fermentationsmedium und iii) Abtrennen und Gewinnen von Erythritol aus dem Fermentationsmedium von Stufe (ii).
Fermentationsverfahren nach Anspruch 1, wobei die für die Fermentation verwendeten Mutantenzellen durch Kultivieren von Pichia sp. KCCM-10129 in YM-Medium, welches 0,8-1,2 (w/v)% Glucose, 0,4-0,6 (w/v)% Pepton, 0,2-0,4 (w/v)% Hefeextrakt und 0,2-0,4 (w/v)% Malzextrakt enthält, für 20-28 h bei 27-33°C hergestellt werden.
Fermentationsverfahren nach Anspruch 1, wobei der osmotische Druck folgendermaßen gesteuert wird: i) der osmotische Druck wird auf 0,2-0,7 Osm/kg während der Wachstumsphase und 0,8-1,2 Osm/kg während der Phase der Erythritolherstellung eingestellt und ii) eine Nährlösung, die Glucose, NaCl oder KCl enthält, die kontinuierlich oder unterbrochen der Kulturbrühe während der Phase der Erythritolherstellung zugeführt wird, so daß diese 10-20% Glucose, 0-5% NaCl bzw. 0-5% KCl enthält, für die effiziente Herstellung von Erythritol.
Neuartige mutante Zellen von Pichia sp. (KCCM-10129).
Verfahren zum Isolieren von Pichia sp.-Mutanten, welches die folgenden Stufen umfaßt: i) Auftragen und Kultivieren von Wildtyp-Pichia sp. auf Hefe-Malz- (YM-) Medium, welches 0,01 % NTG (N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitroguanidin) enthält, ii) mindestens dreimaliges Isolieren der erzeugten Kolonien auf YM-Medium, iii) Auftragen und Kultivieren der Kolonien aus Stufe (ii) auf YM-Medium unter UV-Lichtbestrahlung bei 250-270 nm und iv) Isolieren der wachsenden Kolonien.