DD267999B5 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF 2-OXOGLUTARIC ACID BY YEAST - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-Oxoglutarsäure durch Hefen mit geeigneten Kohlenstoffquellen unter aeroben, submersen Bedingungen und ist somit in das Gebiet der technischen Mikrobiologie einzuordnen.The invention relates to a process for the preparation of 2-oxoglutaric acid by yeasts with suitable carbon sources under aerobic, submerged conditions and is thus classified in the field of technical microbiology.
2-Oxoglutarsäure findet zunehmend Interesse als Ausgangssubstanz für weiterführende chemische Synthesen.2-Oxoglutaric acid is finding increasing interest as a starting material for further chemical syntheses.
Sie kann chemisch nur in aufwendigen Mehrstufenverfahren hergestellt werden. Es ist bekannt, dassIt can be prepared chemically only in complex multi-step process. It is known that
2-Oxoglutarsäure sowohl durch Bakterien als auch durch Hefen im Kulturmedium akkumuliert werden kann. Als Kohlenstoffquelle werden sowohl Glucose als auch Paraffine eingesetzt.2-Oxoglutaric acid can be accumulated both by bacteria and by yeasts in the culture medium. The carbon source used is both glucose and paraffins.
Mit dem Bakterium Arthrobacter paraffineus Nr. 2411 (ATCC 15 591) z. B. werden maximal 60 g/l 2-Oxoglutarsäure mit einer Produktbildungsgeschwindigkeit von 0,8 g/lh und einer Ausbeute von 74%, bezogen auf das eingesetzte Paraffin erhalten (GB-A 1.102.905,1965, Firma Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Mit dem gleichen Stamm werden infolge Nebenproduktbildung von L-Glutaminsäure geringere Leistungen erzielt (US-A 3.450.599,1965, Fa. Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Es ist bekannt, dass thiaminauxotrope Hefen, besonders der Gattung Candida lipolytica unter Thiaminmangelbedingungen auf der Basis von η-Paraffinen bevorzugt 2-Oxoglutarsäure und auf der Basis von Glucose bevorzugt Brenztraubensäure ausscheiden (Ermakova, J. T. u. a.With the bacterium Arthrobacter paraffineus no. 2411 (ATCC 15 591) z. B. a maximum of 60 g / l 2-oxoglutaric acid with a product formation rate of 0.8 g / lh and a yield of 74%, based on the paraffin used obtained (GB-A 1,102,905, 1965, Kyowa Hakko Kogyo Co. , Ltd.). Lower performance is achieved with the same strain as a result of by-product formation of L-glutamic acid (US Pat. No. 3,450,599,1965, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). It is known that thiamine auxotrophic yeasts, especially of the genus Candida lipolytica, excrete preferably 2-oxoglutaric acid under thiamine deficiency conditions based on η-paraffins and preferably pyruvic acid on the basis of glucose (Ermakova, J. T. et al.
Prikladnaja Biochimija i Mikrobiologija 22 (1986) 3, 341-347). Die mit Hefen der Gattung Candida, z. B. Candida lipolytica, erzielten Säurekonzentrationen betragen maximal 48 g/l bei einer Produktbildungsgeschwindigkeit von 0,6 g/lh und einer Ausbeute von 60% (GB-A 1.187.006,1968, Fa. Ajinimoto Co., Inc.).Prikladnaja Biochimija i Mikrobiologija 22 (1986) 3, 341-347). The yeasts of the genus Candida, z. B. Candida lipolytica, achieved acid concentrations are a maximum of 48 g / l at a product formation rate of 0.6 g / lh and a yield of 60% (GB-A 1,187,006,1968, Fa. Ajinimoto Co., Inc.).
Mit dem Einsatz des diploiden Stammes von Candida lipolytica D 1805 (FR-A 2.207.989,1973, Inst. Francais du Petrole des Carburants et Lubrificants, Paris) konnten diese Leistungsparameter weit übertroffen werden, so dass eine 2-Oxoglutarsäurekonzentration von 185 g/l in 240 h (Produktivität 0,9 g/lh) mit einer Ausbeute von 80%, bezogen auf die eingesetzte Paraffinmenge, erzielt werden konnte.With the use of the diploid strain of Candida lipolytica D 1805 (FR-A 2,207,989, 1973, Inst. Francais du Petrole des Carburants et Lubrificants, Paris), these performance parameters could be far exceeded, so that a 2-Oxoglutarsäurekonzentration of 185 g / l in 240 h (productivity 0.9 g / lh) with a yield of 80%, based on the amount of paraffin used, could be achieved.
Die Nachteile der aufgeführten Verfahren sind die geringen Produktbildungsraten und geringen Endkonzentrationen sowie die Bildung von Nebenprodukten, wie z. B. L-Glutaminsäure (GB-A 1.187.006 und US-A 3.450.599). Von diploiden Leistungsstämmen ist bekannt, dass eine Revertierung in haploide Formen mit geringerer Leistung auftreten kann.The disadvantages of the listed methods are the low product formation rates and low final concentrations and the formation of by-products, such. As L-glutamic acid (GB-A 1,187,006 and US-A 3,450,599). Diploid performance strains are known to undergo reversion to lower performance haploid forms.
Ziel der Erfindung ist es, mit einer Hefe aus unterschiedlichen Kohlenstoffquellen mittels eines Fermentationsverfahrens 2-Oxoglutarsäure in hohen Endkonzentrationen und mit hoher Produktbildungsgeschwindigkeit herzustellen.The aim of the invention is to produce with a yeast from different carbon sources by means of a fermentation process 2-oxoglutaric acid in high final concentrations and with high product formation rate.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine speziell hergestellte Hefemutante auszuwählen und unter spezifischen Verfahrensbedingungen zu kultivieren.The object of the invention is to select a specially prepared yeast mutant and to cultivate it under specific process conditions.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass man den Hefestamm Yarrowia lipolytica H 222-27-11 (ZIMET 43 856 - Hinterlegungsnummer bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig: DSM 8068) in bekannten Nährmedien bei einem pH-Wert <6,0, vorzugsweise von 3,0 - 4,0, einer optimalen, stammspezifischen Thiaminkonzentration von 0,05 - 0,15 μ9/Ι Thiaminhydrochlorid, einer Temperatur von <37 0C, bevorzugt 28 - 32 "C und einer Gelöstsauerstoffkonzentration von 50 bis 90% kultiviert. Der Stamm zeichnet sich dadurch aus, dass er auf den unterschiedlichsten assimilierbaren Kohlenstoffquellen, wie z. B. η-Paraffinen, Glucose, glucosehaltigen Hydrolysaten, Invertzucker, Triglyceriden, Äthanol, Glycerin, Essigsäure bzw. Acetat in Gegenwart einer mineralischen Nährsalzlösung sowie genau dosierten Wuchsstoffen und Vitamin B1 wächst und 2-Oxoglutarsäure akkumuliert. Besonders auf der Basis von η-Paraffinen werden große Mengen an 2-Oxoglutarsäure mit hoher Produktionsbildungsgeschwindigkeit und hoher Ausbeute, die die bisher bekannten übertreffen, produziert. So beträgt die Produktionsbildungsgeschwindigkeit für 2-Oxoglutarsäure aus η-Paraffinen durchschnittlich 1,4 g/lh, d. h. die Produktionsbildungsleistung ist um etwa 50% höher als die beschriebene Bestleistung mit einem diploiden Stamm, die erzielte Ausbeute um etwa 10%. Eine weitere wesentliche Eigenschaft des Stammes ist darin begründet, dass er unterschiedliche C-Quellen, wie z. B. η-Paraffine und Glucose auch im Gemisch gleichzeitig verwerten kann oder aber, dass man unterschiedliche C-Quellen zu unterschiedlichen Zeiten verwendet, wie z. B. für die Wachstumsphase Paraffin und für die Produktbildungsphase Glucose oder umgekehrt.According to the invention, this object is achieved in that the yeast strain Yarrowia lipolytica H 222-27-11 (ZIMET 43 856 - deposit number in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig: DSM 8068) in known nutrient media at a pH <6, 0, preferably from 3.0 to 4.0, an optimal, strain-specific thiamine concentration of 0.05-0.15 μ9 / thiamine hydrochloride, a temperature of <37 0 C, preferably 28-32 "C and a dissolved oxygen concentration of 50 to The strain is characterized by its ability to be absorbed by a wide variety of assimilable carbon sources, such as η-paraffins, glucose, glucose-containing hydrolysates, invert sugars, triglycerides, ethanol, glycerol, acetic acid and acetate in the presence of a mineral nutrient solution as well as exactly dosed growth substances and vitamin B1 grows and 2-Oxoglutarsäure accumulates.Especially on the basis of η-Paraffinen become large quantities of 2-Oxoglutarsäur e with high production formation rate and high yield, which surpass the previously known produced. For example, the rate of production of 2-oxoglutaric acid from η-paraffins is 1.4 g / lh on average, that is to say that the production efficiency is about 50% higher than the described best with a diploid strain and the yield achieved is about 10%. Another essential feature of the strain is that it uses different C sources, such as. B. η-paraffins and glucose can also be used simultaneously in the mixture or that you use different C sources at different times, such. For the growth phase paraffin and for the product formation phase glucose or vice versa.
Der Stamm behält seine Eigenschaft, 2-Oxoglutarsäure in großen Mengen mit hoher Geschwindigkeit und hoher Ausbeute zu produzieren, unverändert über einen langen Test-Zeitraum von mehreren Jahren.The strain retains its ability to produce 2-oxoglutaric acid in large quantities at high speed and high yield, unchanged over a long test period of several years.
Nachfolgend wird der neue Stamm charakterisiert:The following is the characterization of the new strain:
Der Stamm H 222-27-11, ZIMET 43856 (DSM 8068) stellt eine methioninunabhängige Revertante der methioninbedürftigen, zitronensäureproduzierenden Mutante H 222-27 dar.The strain H 222-27-11, ZIMET 43856 (DSM 8068) represents a methionine-independent revertant of the methionine-requiring, citric acid-producing mutant H 222-27.
1. Morphologische Eigenschaften Kolonien nach 48 h auf YEP-G (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose, pH 5,5 bis 6,0): etwa 2 mm groß, rund, weißgrau, glatt (später faltig) mit glattem Rand. Zellen: deutlicher Dimorphismus, Hefezeilen oval, von unterschiedlicher Größe Hyphen bilden Pseudomyzel1. Morphological characteristics Colonies after 48 h on YEP-G (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose, pH 5.5 to 6.0): about 2 mm in size, round, white-gray, smooth (later wrinkled) with smooth edge. Cells: distinct dimorphism, yeast cells oval, of varying size hyphae forming pseudomyzel
2. Physiologische Eigenschaften Substratverwertung: Glucose + Fructose + Acetat + Äthanol + n-Alkane + Zitronensäure + L-Sorbose2. Physiological properties Substrate utilization: glucose + fructose + acetate + ethanol + n-alkanes + citric acid + L-sorbose
Glyzerin +Glycerine +
Galactosegalactose
Lactoselactose
Maltosemaltose
Saccharosesucrose
StärkeStrength
Maximale Wachstumstemperatur: 25 bis 32 °C Vitaminbedarf: thiaminbedürftigMaximum growth temperature: 25 to 32 ° C. Vitamin requirement: thiamin-requiring
3. Genetische Eigenschaften Kernstatus: haploid Paarungstyp: A3. Genetic characteristics Core status: haploid Mating type: A
Genotyp: A, metA, SUPA, SPO In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert:Genotype: A, metA, SUPA, SPO The following examples illustrate the invention in more detail:
Zu 31 Medium folgender Zusammensetzung NH4CI2%, KH2PO4 0,2%, MgSO4 7H2O 0,1%, FeSO4TH2O 10 mg/l, ZnSO4TH2O 44 mg/l, gelöst in destilliertem Wasser, werden 700 ml η-Paraffine der Kettenlänge Ci2-Ci8 zugesetzt.To 31 medium of the following composition NH 4 Cl 2%, KH 2 PO 4 0.2%, MgSO 4 7H 2 O 0.1%, FeSO 4 TH 2 O 10 mg / l, ZnSO 4 TH 2 O 44 mg / l, dissolved in distilled water, 700 ml η paraffins of chain length Ci 2 -Ci 8 are added.
Das Kulturmedium wird bei 120 0C 30 min sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden 0,3 μg Thiaminhydrochlorid (in 10 ml destilliertem Wasser) gelöst und durch Filtration gesondert sterilisiert sowie 300 ml einer 24 Stunden gewachsenen Kultur der Hefe Yarrowia lipoytica H 222-27-11, ZIMET 43856 (DSM 8068) als Inokulum zugesetzt.The culture medium is sterilized at 120 ° C. for 30 minutes. After cooling, 0.3 μg of thiamine hydrochloride (in 10 ml of distilled water) is dissolved and separately sterilized by filtration, and 300 ml of a 24-h culture culture of yeast Yarrowia lipoytica H 222-27-11, ZIMET 43856 (DSM 8068) is added as inoculum ,
Das Medium für das Inokulum hat folgende Zusammensetzung:The medium for the inoculum has the following composition:
NH4CI 0,3%, KH2PO4 0,07%, MgSO4TH2O 0,035%, Hefeextrakt 0,1%, η-Paraffine Ci2-Ci8 2%, Spurenelemente:NH 4 Cl 0.3%, KH 2 PO 4 0.07%, MgSO 4 TH 2 O 0.035%, yeast extract 0.1%, η-paraffins Ci 2 -Ci 8 2%, trace elements:
CuSO4 5H2O 1 mg/l, MnSO4 4H2O 15 mg/l, ZnCI2 10 mg/l, CoSo4TH2O 4 mg/l, H3BO3 40 mg/l, gelöst inCuSO 4 5H 2 O 1 mg / l, MnSO 4 4H 2 O 15 mg / l, ZnCl 2 10 mg / l, CoSo 4 TH 2 O 4 mg / l, H 3 BO 3 40 mg / l, dissolved in
destilliertem Wasser. Die Fermentation wird in einem 12-l-Rührfermentor durchgeführt.distilled water. The fermentation is carried out in a 12 l stirred fermentor.
Fermentationsbedingungen: sterile Fermentationsweise, Luftmenge 50 bis 250 l/h, 30 0C, Rührung 1500 bis 2000 U/min, pH-Wert der Wachstumsphase 4,0 bis 5,0, pH-Wert der Produktionsphase 3,5, pH-Regulation mit 40%iger NaOH.Fermentation conditions: sterile fermentation method, amount of air 50 to 250 l / h, 30 0 C, stirring 1500 to 2000 rev / min, pH of the growth phase 4.0 to 5.0, pH of the production phase 3.5, pH regulation with 40% NaOH.
Etwa 10 Stunden nach Wachstumsbeginn der Kultur beginnt die Akkumulation der 2-Oxoglutarsäure, zunächst langsam, später mit einer hohen Produktbildungsgeschwindigkeit von durchschnittlich 1,4 g/l h.About 10 hours after growth of the culture, the accumulation of 2-oxoglutaric acid begins, slowly at first, later with a high product formation rate of 1.4 g / l h on average.
Nach weiteren 90 Stunden wird die Fermentation abgebrochen. Die Konzentration an gebildeter 2-Oxoglutarsäure im Kulturmedium beträgt 125 g/l (unter Berücksichtigung der Verdünnung durch das zugeführte Laugevolumen).After another 90 hours, the fermentation is stopped. The concentration of 2-oxoglutaric acid formed in the culture medium is 125 g / l (taking into account the dilution by the liquor volume supplied).
Die erzielte Ausbeute, bezogen auf die eingesetzte Paraffinmenge, einschließlich des Paraffinverbrauches für die Biomassebildung, beträgt 90%.The yield obtained, based on the amount of paraffin used, including the paraffin consumption for biomass formation, is 90%.
Es wird verfahren, wie im Beispiel 1 beschrieben worden ist. 50 Stunden nach Beginn der Produktbildung werden weitere 350 ml η-Paraffine in steriler Arbeitsweise zugegeben. Die Fermentation wird 100 Stunden fortgesetzt. Nach insgesamt 150 Produktionsstunden beträgt die 2-Oxoglutarsäurekonzentration 195 g/l.The procedure is as described in Example 1. 50 hours after the start of product formation, a further 350 ml of η-paraffins are added in sterile mode. The fermentation is continued for 100 hours. After a total of 150 hours of production, the 2-oxoglutaric acid concentration is 195 g / l.
Es wird verfahren, wie im Beispiel 1 beschrieben worden ist, wobei jedoch anstelle von Paraffin zur Produktbildung 450 g/l Glucose eingesetzt werden. Die Thiaminkonzentration wird auf 0,3 μ9 Thiaminhydrochlorid erhöht. Nach insgesamt 120 Stunden wird die Fermentation abgebrochen. Im Kulturmedium werden 36 g/l 2-Oxoglutarsäure und 16 g/l Brenztraubensäure bestimmt.The procedure is as described in Example 1, except that instead of paraffin for product formation 450 g / l glucose are used. The thiamine concentration is increased to 0.3 μ9 thiamine hydrochloride. After a total of 120 hours, the fermentation is stopped. In the culture medium 36 g / l 2-oxoglutaric acid and 16 g / l pyruvic acid are determined.
Verfahren nach Beispiel 1, wobei anstelle von 700 ml Paraffin zu Beginn der Fermentation ein Gemisch aus Paraffin (300 ml) und Glucose (75 g/l) als Kohlenstoffquellen vorgegeben werden. Nach 90 Stunden wird die Fermentation abgebrochen. Die Konzentration der gebildeten 2-Oxoglutarsäure beträgt 60 g/l.The method of Example 1, wherein instead of 700 ml of paraffin at the beginning of the fermentation, a mixture of paraffin (300 ml) and glucose (75 g / l) are given as carbon sources. After 90 hours, the fermentation is stopped. The concentration of 2-oxoglutaric acid formed is 60 g / l.
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