DE102009029651A1 - Process for the preparation of free carboxylic acids - Google Patents
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Abstract
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren, umfassend die Verfahrensschritte A) das Inkontaktbringen einer Hefezelle, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Yarrowia lipolytica, Candida ultilis und Saccharomyces cerevisiae, mit einem Nährmedium, in welchem die Zelle sich vermehren lässt; B) das Inkontaktbringen der Zellen aus Verfahrensschritt A) mit einem Medium, enthaltend eine Kohlenstoffquelle, unter Bedingungen, bei denen die Zellen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) bei einem pH-Wert-Bereich des Mediums von 3,0 bis 1,0, bevorzugt von 2,5 bis 1,2, insbesondere von 2,0 bis 1,5, durchgeführt wird, gefolgt von mindestens einer Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B), bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur erstgenannten Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) erhöht ist.The present invention relates to a process for the production of free carboxylic acids, comprising process steps A) bringing a yeast cell, preferably selected from the group comprising Yarrowia lipolytica, Candida ultilis and Saccharomyces cerevisiae, into contact with a nutrient medium in which the cell can reproduce; B) bringing the cells from process step A) into contact with a medium containing a carbon source, under conditions under which the cells are able to form the carboxylic acid from the carbon source as a substrate, characterized in that at least one part-time period a) of process step B) in a pH range of the medium from 3.0 to 1.0, preferably from 2.5 to 1.2, in particular from 2.0 to 1.5, is carried out, followed by at least a part-time period b) of process step B ), in which the pH value of the medium is increased compared to the first-mentioned part-time period a) of process step B).
Description
Gebiet der ErfindungField of the invention
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren mit Hilfe von Hefezellen.The invention relates to a process for the preparation of free carboxylic acids with the aid of yeast cells.
Stand der TechnikState of the art
Die biochemische Herstellung von Carbonsäuren ist aufgrund von z. B. der Milch- oder Zitronensäureproduktion gut bekannt. Da die meisten Fermentationsprozesse bei einem pH-Wert des Mediums durchgeführt werden, der oberhalb des pKS-Wertes der herzustellenden Carbonsäure liegen, fallen die Carbonsäuren zum Grossteil als Salze und nicht als freie Säuren an. Diese Carboxylate werden meist durch Zugabe von Säuren in ihre freien Säuren überführt.The biochemical production of carboxylic acids is due to z. As the production of milk or citric acid well known. Since most fermentation processes are carried out at a pH value of the medium, which are above the pK a value of the produced carboxylic acid, the carboxylic acids are incurred for the most part as salts rather than free acids. These carboxylates are usually converted by the addition of acids in their free acids.
Die Produktion freier Säuren ist entscheidend für eine Vereinfachung der Produktaufreinigung. Bei beispielsweise einem Extraktionsverfahren geht oft nur die freie Säure von der Fermentationsbrühe ins Extraktionsmittel über. In der Kulturbrühe sollte demzufolge idealerweise die freie Säureform zur Verfügung gestellt werden. Solange der Bioprozess bei pH Werten oberhalb des pKs Wertes der jeweiligen Säure durchgeführt wird, wird hauptsächlich die Salzform der Säure gebildet.The production of free acids is crucial for simplifying product purification. For example, in an extraction process, only the free acid often passes from the fermentation broth to the extractant. Consequently, ideally, the free acid form should be made available in the culture broth. As long as the bioprocess is carried out at pH values above the pKa value of the particular acid, the salt form of the acid is mainly formed.
Die
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Den Verfahren des Standes der Technik ist gemein, dass generell eine Herstellung von freien Carbonsäuren in Hefezellen bei niedrigem pH-Wert gelingt, jedoch die Ausbeuten an gesamter Carbonsäure, d. h. freie Säure und deren Salzform, gering sind.Common to the prior art processes is that general production of free carboxylic acids in yeast cells is possible at low pH, but the yields of total carboxylic acid, ie. H. free acid and its salt form, are low.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren bereitzustellen, welches effektiv und produktiv freie Carbonsäuren, insbesondere Hydroxycarbonsäuren, bereitstellt.The object of the invention was therefore to provide a process which provides effective and productive free carboxylic acids, in particular hydroxycarboxylic acids.
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Überraschenderweise wurde gefunden, dass das in Anspruch 1 beschriebene Verfahren die gestellte Aufgabe löst.Surprisingly, it has been found that the method described in
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren umfassend die Verfahrensschritte A) das in Kontakt Bringen einer Hefezelle, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, Yarrowia lipolytica, Candida ultilis und Saccharomyces cerevisiae, mit einem Nährmedium, in welchem die Zelle sich vermehren lässt; B) das in Kontakt Bringen der Zellen aus Verfahrensschritt A) mit einem Medium enthaltend eine Kohlenstoffquelle, unter Bedingungen, bei denen die Zellen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) bei einem pH-Wert-Bereich des Mediums von 3,0 bis 1,0, bevorzugt von 2,5 bis 1,2, insbesondere von 2,0 bis 1,5 durchgeführt wird, gefolgt von mindestens einer Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B), bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) erhöht ist.The present invention therefore relates to a process for the preparation of free carboxylic acids comprising the process steps A) comprising contacting a yeast cell, preferably selected from the group consisting in particular of Yarrowia lipolytica, Candida ultilis and Saccharomyces cerevisiae, with a nutrient medium in which the cell can be multiplied; B) bringing the cells from step A) into contact with a medium containing a carbon source, under conditions in which the cells are capable of forming the carboxylic acid from the carbon source as a substrate, characterized in that at least one part-time period a) of process step B) at a pH range of the medium of 3.0 to 1.0, preferably from 2.5 to 1.2, in particular from 2.0 to 1.5 followed by at least one part-time period b) of process step B), in which the pH of the medium is increased in comparison to the part-time period a) of process step B).
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht in der Tatsache, dass eine Kontamination bei dem erfindungswesentliche, niedrigen pH-Wert unwahrscheinlicher ist als bei hohem pH-Wert. Dadurch erniedrigt sich insgesamt der Aufwand für Steriltechnik, wie z. B. in Form der notwendigen Erzeugung von Dampf und der Notwendigkeit von druckstabilen Behältnissen und Leitungen. Dadurch kann auch ein Prozess mit geringeren Produktivitäten wirtschaftlich sein, was den Einsatz von Minimalmedien ohne die teuren komplexen Bestandteile in der Fermentation ermöglicht. Ein weiterer Vorteil von Minimalmedien gegenüber komplexen Medien besteht in der Tatsache, dass zur Selektion des Produktionsstammes Komplementationsmarker wie z. B. Aminosäureauxotrophien eingesetzt werden können. Diese Art der Selektion ist nicht nur preisgünstiger im Vergleich zur Selektion z. B. mit Antibiotika, wie in komplexen Medien üblich, sondern kann auch im Bereich der Nahrungsmittelherstellung problemlos eingesetzt werden.Another advantage of the invention resides in the fact that contamination is less likely at the low pH essential to the invention than at high pH. As a result, the total costs for sterile technology, such. B. in the form of the necessary generation of steam and the need for pressure-resistant containers and pipes. As a result, even a process with lower productivities can be economical, which allows the use of minimal media without the expensive complex components in the fermentation. Another advantage of minimal media over complex media is the fact that for selection of the production strain complementation markers such. B. Aminosäureauxotrophien can be used. This type of selection is not only cheaper compared to the selection z. As with antibiotics, as is common in complex media, but can also be used easily in the field of food production.
Unter „Hefen” im Sinne der vorliegenden Erfindung werden einzellige Pilze, insbesondere Schlauchpilze, die sich durch Sprossung oder Teilung vermehren, verstanden."Yeasts" in the context of the present invention are unicellular fungi, in particular ascomycetes, which multiply by budding or division.
Der Begriff „Carbonsäure” im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhaltet sowohl die freie Carbonsäure (-COOH) als auch das korrespondierende Salz (-COO–).The term "carboxylic acid" within the meaning of the present invention includes both the free carboxylic acid (-COOH) and the corresponding salt (-COO - ).
Der Begriff „Hydroxycarbonsäure” im Sinne der vorliegenden Erfindung beschreibt Carbonsäuren mit mindestens einer Hydroxyl- und einer Carbonsäuregruppe und beinhaltet sowohl die freie Carbonsäure (-COOH) als auch das korrespondierende Salz (-COO–). Die Formulierung „Die Zellen vermögen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden” im Sinne der vorliegenden Erfindung beschreibt, dass die Zelle aus der ihr zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle mindestens ein Kohlenstoffatom nutzt, um damit die Carbonsäure zu synthetisieren. Dies kann etwa durch eine Isotopenmarkierung der Kohlenstoffquelle nachgewiesen werden, so dass sich das Isotop in der gebildeten Carbonsäure nachweisen lässt.The term "hydroxycarboxylic acid" in the context of the present invention describes carboxylic acids having at least one hydroxyl and one carboxylic acid group and includes both the free carboxylic acid (-COOH) and the corresponding salt (-COO - ). The phrase "the cells are able to form the carboxylic acid from the carbon source as a substrate" in the sense of the present invention describes that the cell uses at least one carbon atom from its available carbon source in order to synthesize the carboxylic acid. This can be detected, for example, by an isotopic labeling of the carbon source, so that the isotope can be detected in the carboxylic acid formed.
Der Begriff „Eigenansäuerung” im Sinne der vorliegenden Erfindung beschreibt das Phänomen der pH-Wert-Erniedrigung des eine Hefezelle umgebenden Mediums hervorgerufen durch Substanzen, die von der Hefezelle abgegeben werden.The term "self-acidification" in the sense of the present invention describes the phenomenon of pH lowering of the medium surrounding a yeast cell caused by substances released from the yeast cell.
Alle angegebenen Prozent (%) sind wenn nicht anders angegeben Massenprozent.All percentages (%) are percentages by weight unless otherwise specified.
Alle im Zusammenhang mit dem Verfahren angegebenen pH-Werte und insbesondere auch die in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit dem Verfahrensschritt B) angegebenen pH-Werte sind „unter den Kultivierungsbedingungen” zu messen. Wenn also beispielsweise die Mikroorganismen im Verfahrensschritt A) oder im Verfahrensschritt B) bei 30°C kultiviert werden, ist auch der pH-Wert bei 30°C zu bestimmen.All pH values indicated in connection with the method and in particular also the pH values specified in the following statements in connection with method step B) are to be measured "under the cultivation conditions". If, for example, the microorganisms are cultured in process step A) or in process step B) at 30 ° C., the pH at 30 ° C. is also to be determined.
In Verfahrensschritt A) werden die Zellen vorzugsweise bis zum Erreichen einer Konzentration an Biotrockenmasse von mindestens 30 g/l bezogen auf das Nährmedium vermehrt.In method step A), the cells are preferably multiplied until a concentration of dry biomass of at least 30 g / l, based on the nutrient medium, is reached.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die freie Carbonsäure eine freie Ketocarbonsäure oder eine freie Hydroxycarbonsäure ist. Als Ketocarbonsäuren kommen insbesondere alpha-Ketocarbonsäuren in Frage, insbesondere alpha-Keto-Glutarsäure; in diesem Zusammenhang sind Hydroxycarbonsäuren bevorzugt, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, 2-Hydroxyisobuttersäure, 3-Hydroxyisobuttersäure, wobei 3-Hydroxyisobuttersäure besonders bevorzugt ist.It is preferred according to the invention that the free carboxylic acid is a free ketocarboxylic acid or a free hydroxycarboxylic acid. Particularly suitable ketocarboxylic acids are alpha-ketocarboxylic acids, in particular alpha-keto-glutaric acid; In this context, hydroxycarboxylic acids are preferred, in particular selected from the group comprising, in particular from the group consisting of, 2-hydroxyisobutyric acid, 3-hydroxyisobutyric acid, with 3-hydroxyisobutyric acid being particularly preferred.
Als vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar haben sich insbesondere die Zelle ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, Yarrowia lipolytica H222, H222-27 und H222-27-11 herausgestellt.In particular, the cell selected from the group comprising, in particular from the group consisting of, Yarrowia lipolytica H222, H222-27 and H222-27-11 have proven to be useful in the method according to the invention.
H222 wird beschrieben in
H222-27, auch bekannt als ZIMET 43728 und H422, wird in der
H222-27-11, auch bekannt als ZIMET 43856, H355 und DSM 8068, wird in der
H222-27, also known as ZIMET 43728 and H422, is used in the
H222-27-11, also known as ZIMET 43856, H355 and DSM 8068, is incorporated in the
Es ist dem Fachmann hinlänglich bekannt, dass mit Hilfe rekombinanter Gentechnik Produktausbeuten in biologischen Systemen verbessert werden können. Bevorzugt handelt es sich bei der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Hefezelle somit um eine gentechnisch veränderte Zelle. It is well known to the person skilled in the art that product yields in biological systems can be improved by means of recombinant genetic engineering. The yeast cell used in the method according to the invention is thus preferably a genetically modified cell.
Daher ist es erfindungsgemäß weiterhin bevorzugt, dass die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zelle gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäure zu bilden vermag. Die Formulierung „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäure zu bilden vermag” betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine Carbonsäure, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindung, zu bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Komponente gebildet werden können.Therefore, it is further preferred according to the invention that the cell used in the method according to the invention has been genetically engineered with respect to its wild type such that it is able to form more carboxylic acid compared to its wild-type. The phrase "that it is capable of producing more carboxylic acid compared to its wild-type" also refers to the case where the wild-type of the genetically engineered cell is unable to form any carboxylic acid, or at least no detectable amount of this compound, and becomes detectable only after the genetic modification Quantities of this component can be formed.
Unter einem „Wildtyp” einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp” fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.A "wild type" of a cell is preferably referred to as a cell whose genome is in a state as naturally evolved. The term is used for both the entire cell and for individual genes. The term "wild-type" therefore does not include, in particular, those cells or genes whose gene sequences have been altered at least in part by humans by means of recombinant methods.
Die Art und Weise, wie die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte, gentechnisch veränderte Hefezelle derart gentechnisch verändert werden kann, dass sie mehr Carbonsäure als ihr Wildtyp zu bilden vermag, ist für den Fall der 3-Hydroxyisobuttersäure insbesondere in der
Für den Fall der 2-Hydroxyisobuttersäure werden im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt gentechnisch veränderte Hefezellen eingesetzt, die wie insbesondere in der
Weiterhin ist es in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, dass Verfahrensschritt A) bei einem pH-Wert des Mediums von größer 4,5, vorzugsweise von größer 4,9, erfolgt. Insbesondere ist in diesem Zusammenhang ein pH-Wert-Bereich des Mediums von größer 4,5 bis kleiner gleich 7,9, insbesondere ein pH-Wert-Bereich des Mediums von grösser 4,9 bis kleiner gleich 7,0, bevorzugt.Furthermore, it is preferred in the process according to the invention that process step A) takes place at a pH of the medium of greater than 4.5, preferably greater than 4.9. In particular, in this context, a pH range of the medium of greater than 4.5 to less than or equal to 7.9, in particular a pH range of the medium of greater 4.9 to less than or equal to 7.0, is preferred.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass der pH-Wert des Mediums in Verfahrensschritt A) einen pH-Wert von 7,9 nicht übersteigt. Zwischen Verfahrensschritt A) und Verfahrensschritt B) wird das Nährmedium durch ein Medium enthaltend eine Kohlenstoffquelle, aus der die Zellen die Carbonsäure als Substrat zu bilden vermögen, ersetzt.It is inventively preferred that the pH of the medium in process step A) does not exceed a pH of 7.9. Between process step A) and process step B), the nutrient medium is replaced by a medium containing a carbon source from which the cells are able to form the carboxylic acid as substrate.
Dies kann derart erfolgen, dass das Nährmedium durch das Medium enthaltend die Kohlenstoffquelle ersetzt wird, aber auch derart vorgenommen werden, dass das Nährmedium durch Zusatz von Substanzen wie beispielsweise der Kohlestoffquelle und/oder durch Wegnahme oder nicht weitere Zufuhr von Substanzen, wie beispielsweise Stoppen etwaiger Gas-Einleitungen, Ausfällen von Nährmediumkomponenten, in das Medium enthaltend die Kohlenstoffquelle überführt wird, wobei ein Ersetzen des Nährmediums durch beispielsweise Abziehen über Tangentialfiltration und Neuzufuhr des Mediums enthaltend die Kohlenstoffquelle oder durch Abzentrifugieren der Zellen und anschließendes Resuspendieren der Zellen in dem Medium enthaltend die Kohlenstoffquelle bevorzugt ist.This can be done so that the nutrient medium is replaced by the medium containing the carbon source, but also be made such that the nutrient medium by addition of substances such as the carbon source and / or by removal or no further supply of substances, such as stopping any Gas inlets, nutrient medium component precipitates being transferred to the medium containing the carbon source, wherein replacing the nutrient medium by, for example, stripping via tangential filtration and refilling the medium containing the carbon source or by centrifuging the cells and then resuspending the cells in the medium containing the carbon source is preferred.
Die Kohlenstoffquelle kann in dem Verfahrensschritt B) des erfindungsgemäßen Verfahrens jegliche Kohlenstoffquelle sein, aus denen die Hefezelle in der Lage ist, die Carbonsäure zu bilden; dies sind beispielsweise Alkane, Aminosäuren, Alkohole, Fette, Öle und Zucker. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden insbesondere Kohlenstoffquellen ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, Methanol, Glycerin, Saccharose, Glukose, Isobuttersäure, Valin, Leucin und Ketoisovaleriansäure eingesetzt.The carbon source in process step B) of the process of the invention may be any carbon source from which the yeast cell is capable of forming the carboxylic acid; these are, for example, alkanes, amino acids, alcohols, fats, oils and sugars. In the process according to the invention, in particular carbon sources selected from the group comprising, in particular from the group consisting of, methanol, glycerol, sucrose, glucose, isobutyric acid, valine, leucine and ketoisovaleric acid are used.
Es kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft sein, wenn die erfindungswesentliche Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) direkt zu Beginn des Verfahrensschrittes B) eingeleitet wird. Dies kann etwa dadurch erfolgen, dass die Hefezellen von dem Nährmedium des Verfahrensschritts A) abgetrennt werden und direkt in einem Medium mit einem entsprechend niedrigen pH-Wert überführt werden, oder aber das Nährmedium des Verfahrensschrittes A) mit Hilfe einer Säure, insbesondere einer anorganischen Säure, auf den gewünschten pH-Wert eingestellt wird.In the method according to the invention, it may be advantageous if the part-time period a) of method step B) essential to the invention is initiated directly at the beginning of method step B). This can take place, for example, in that the yeast cells are separated from the nutrient medium of process step A) and are transferred directly in a medium having a correspondingly low pH, or else the nutrient medium of process step A) with the aid of an acid, in particular an inorganic acid, adjusted to the desired pH.
Es ist in diesem Zusammenhang bevorzugt, dass die pH-Wert-Einstellung in der Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) durch Eigenansäuerung erfolgt.It is preferred in this context that the pH adjustment in the part-time period a) of process step B) takes place by self-acidification.
Die Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) wird gefolgt von mindestens einer weiteren Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B), bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur Teilzeitperiode a) erhöht ist. Der pH-Wert des Mediums der Teilzeitperiode b) ist in diesem Zusammenhang bevorzugt um mindestens 0,2, insbesondere um mindestens 0,5 und ganz besonders um mindestens 0,8 pH-Einheiten erhöht, bezogen auf den tiefsten pH-Wert der Teilzeitperiode a). Bevorzugte pH-Wert-Bereiche des Mediums der Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B) sind somit 2,0 bis 5,5, bevorzugt 2,5 bis 4,0 und insbesondere 2,7 bis 3,8.The part-time period a) of process step B) is followed by at least one further part-time period b) of process step B), in which the pH of the medium is increased compared to the part-time period a). The pH of the medium of the part-time period b) in this context is preferably increased by at least 0.2, in particular by at least 0.5 and more particularly by at least 0.8 pH units, based on the lowest pH of the part-time period a ). Preferred pH ranges of the medium of the part-time period b) of process step B) are thus 2.0 to 5.5, preferably 2.5 to 4.0 and in particular 2.7 to 3.8.
Es ist des Weiteren möglich, in Verfahrenschritt B) die vorbeschriebenen Teilzeitperioden mit unterschiedlichen pH-Werten mehrfach hintereinander durchzuführen, so dass sich über den zeitlichen Verlauf des Verfahrensschritte B) ein wellenförmiges pH-Profil ergibt.It is furthermore possible to carry out the above-described part-time periods with different pH values several times in succession in method step B), such that a wave-shaped pH profile results over the time profile of method steps B).
Die Temperatur, bei der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann liegt sowohl für Verfahrensschritt A) als auch für Verfahrensschritt B) in einem Bereich von kurz oberhalb des Gefrierpunktes der die Zellen umgebenden Flüssigkeiten bis 50°C. Bevorzugte Temperaturen, insbesondere für Verfahrensschritt B) liegen in einem Bereich von 25°C bis 37°C.The temperature at which the process according to the invention can be carried out lies, both for process step A) and for process step B), in a range from just above the freezing point of the liquids surrounding the cells to 50 ° C. Preferred temperatures, in particular for process step B), are in a range from 25.degree. C. to 37.degree.
Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) bei einer Temperatur in einem Bereich von 25°C bis 37°C durchgeführt wird.Therefore, the method according to the invention is preferably characterized in that method step B) is carried out at a temperature in a range of 25 ° C to 37 ° C.
In Verfahrensschritt B) kann es vorteilhaft sein, die Biomasse streng zu kontrollieren, um eine optimale Produktausbeute zu erhalten. Daher ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Konzentration an Biotrockenmasse in Verfahrensschritt B) in einem Bereich von 30 g/l bis 100 g/l bezogen auf die Kulturbrühe liegt.In process step B) it may be advantageous to strictly control the biomass in order to obtain an optimum product yield. Therefore, it is preferred according to the invention if the concentration of dry biomass in process step B) is in a range from 30 g / l to 100 g / l based on the culture broth.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin eine oder mehrere Schritte zur Reinigung und Isolierung der Carbonsäuren enthalten. Es kann daher erfindungsgemäß vorteilhaft sein, wenn das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt C) Aufreinigung der Carbonsäure aus den Zellen und/oder dem Medium aus Verfahrensschritt B) beinhaltet.The process of the invention may further comprise one or more steps for purifying and isolating the carboxylic acids. It may therefore be advantageous according to the invention if the method additionally includes process step C) purification of the carboxylic acid from the cells and / or the medium from process step B).
Verfahrensschritt C) kann auch schon im Laufe von Verfahrensschritt B) erfolgen, um eine mögliche Produktinhibierung zu umgehen und/oder um die Anzahl der Aufreinigungsschritte insgesamt zu verringern.Process step C) can also take place during process step B) in order to avoid possible product inhibition and / or to reduce the total number of purification steps.
Verfahren zu Aufreinigung von Carbonsäuren sind dem Fachmann bekannt, solche werden beispielsweise in
Geeignete Verfahrensschritte sind unter anderen Konzentrierung, Kristallisation, Ionenaustauschchromatographie, Umsalzung an festen oder flüssigen Ionenaustauschern mit nachfolgender thermischer Spaltung, Elektrodialyse, Extraktion mit organischen Lösemitteln und/oder flüssigen Reaktanden, mit reaktiven Lösungsmitteln und die Reinigung durch Veresterung der Carbonsäure mit geeigneten Alkoholen, nachfolgender Destillation des erhaltenen Esters und anschließender Hydrolyse des Esters zur freien Säure sowie Kombinationen dieser Schritte.Suitable process steps include concentration, crystallization, ion exchange chromatography, salification on solid or liquid ion exchangers with subsequent thermal cleavage, electrodialysis, extraction with organic solvents and / or liquid reactants, with reactive solvents and purification by esterification of the carboxylic acid with suitable alcohols, followed by distillation of the resulting ester and subsequent hydrolysis of the ester to the free acid and combinations of these steps.
Eine Abtrennung der Zellen durch z. B. Filtration oder Zentrifugation vor Anwendung der oben genannten Verfahrensschritte ist in dem Falle vorteilhaft, dass die Carbonsäure aus dem Medium aufgereinigt wird, jedoch nicht zwingend erforderlich.A separation of the cells by z. As filtration or centrifugation before application of the above process steps is advantageous in the event that the carboxylic acid is purified from the medium, but not mandatory.
Die in Verfahrensschritt C) erhaltene aufgereinigte Carbonsäure kann vorteilhaft zu Folgeprodukten umgesetzt werden.The purified carboxylic acid obtained in process step C) can advantageously be converted into secondary products.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung der freien Carbonsäure erhalten durch erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Carbonsäuren, Carbonsäureestern oder Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation. Insbesondere die Verwendung, bei der die freie Carbonsäuren ausgewählt ist aus 2- oder 3-Hydroxyisobuttersäure zur Herstellung von Methacrylsäure, Methacrylsäureestern oder Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation, ist erfindungsgemäß bevorzugt.An object of the invention is thus the use of the free carboxylic acid obtained by inventive method for the preparation of unsaturated carboxylic acids, carboxylic acid esters or polymers the same by dehydration and optionally esterification and optionally polymerization. In particular, the use in which the free carboxylic acids is selected from 2- or 3-hydroxyisobutyric acid for the preparation of methacrylic acid, methacrylic acid esters or polymers thereof by dehydration and optionally esterification and optionally polymerization, is inventively preferred.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung ist beispielsweise die Dehydratisierung von Hydroxycarbonsäuren zu ungesättigten Carbonsäuren.Preferred in the context of the invention is, for example, the dehydration of hydroxycarboxylic acids to unsaturated carboxylic acids.
Eine Reihe von Verfahren zur Dehydratisierung von Hydroxycarbonsäuren ist dem Fachmann bekannt, solche werden beispielsweise in der
In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.In the examples given below, the present invention is described by way of example, without the invention, the scope of application of which is apparent from the entire description and the claims, to be limited to the embodiments mentioned in the examples.
Folgende Figuren sind Bestandteil der Offenbarung:The following figures are part of the disclosure:
Beispiele:Examples:
Beispiel 1 (erfindungsgemäß): Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure in Yarrowia lipolytica mit Ketoisovalerat als Substrat mit Shift auf pH 2Example 1 (according to the invention): Preparation of 3-hydroxyisobutyric acid in Yarrowia lipolytica with ketoisovalerate as substrate with shift to
Als Produktionsstamm wurde die Hefe Yarrowia lipolytica gewählt. Im beschriebenen Beispiel wurde der pH-Wert während der Kultivierung durch Eigenansäuerung auf pH 2,0 abgesenkt. In einem Zeitraum von 2,5 h wurde bei pH 2,0 in einem Volumen von 1 L Kulturbrühe 0,498 g/L 3HIB als freie Säure gebildet. Das Zielprodukt 3-Hydroxyisobuttersäure wurde durch Biotransformation aus Ketoisovalerat synthetisiert.The Yarrowia lipolytica yeast was chosen as the production strain. In the example described, the pH during cultivation was lowered by self-acidification to pH 2.0. In a period of 2.5 h at pH 2.0 in a volume of 1 L culture broth, 0.498 g / L of 3HIB was formed as the free acid. The target product 3-hydroxyisobutyric acid was synthesized by biotransformation from ketoisovalerate.
Die Kultivierungsbedingungen im Detail: Die Animpfschiene für die Fermentation im 2 L Maßstab bestand aus drei Stufen: einer ersten Vorkultur auf Agarplatten, einer zweiten Vorkultur im Schüttelkolben und einem Seed-Fermenter.
Erste Vorkultur – Ausstrich aus Cryokultur von Y. lipolytica H222-27-11 auf YPD-Agar (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 20 g/l Dextrose), Kultivierung für 24 h bei 30°CThe cultivation conditions in detail: The inoculation rail for the fermentation in the 2 L scale consisted of three stages: a first preculture on agar plates, a second preculture in a shake flask and a seed fermenter.
First preculture smear of cryoculture of Y. lipolytica H222-27-11 on YPD agar (10 g / l yeast extract, 20 g / l peptone, 20 g / l dextrose), culturing for 24 h at 30 ° C
Zweite Vorkultur – Die zweite Vorkultur von Y. lipolytica H222-27-11 erfolgte als sterile Schüttelkultur in 1 L-Erlenmeyerkolben (mit Schikane, Weithalsausführung) mit je 100 ml Mineralsalzmedium. Als Inokulum wurden je 2–3 Impfösen der ersten Vorkultur verwendet. Die Kulturen wurden bei 30°C für 48 h auf einem Schüttler mit Inkubationshaube inkubiert. Die Schüttelfrequenz betrug 170 rpm. Zur Regulierung des pH-Wertes im Bereich pH 4,5 bis 5,5 wurde nach 24 h mit 20%iger NaOH nachgestellt. Als Kohlenstoffquelle wurde 80 g/l Glycerol eingesetzt. Nach spätestens 48 h wurde die Kultivierung wegen verstärkter Säurebildung beendet. Nach Abschluss der Kultivierung lag ein Restglycerolgehalt von 12–20 g/l vor.Second preculture - The second preculture of Y. lipolytica H222-27-11 was carried out as a sterile shake culture in 1 L Erlenmeyer flask (with baffle, wide-necked) with 100 ml mineral salt medium. As inoculum, 2-3 inoculations of the first preculture were used. The cultures were incubated at 30 ° C for 48 h on a shaker with incubation hood. The shaking frequency was 170 rpm. To regulate the pH in the range of pH 4.5 to 5.5 was readjusted after 24 h with 20% NaOH. The carbon source used was 80 g / l glycerol. After 48 h at the latest, cultivation was stopped due to increased acid formation. After completion of the cultivation, a residual glycerol content of 12-20 g / l was present.
Seed-Fermenter – Die Seed-Fermentation wurde in einem 2 L-Bioreaktor (Sartorius) durchgeführt. Dazu wurde 1 L Mineralsalzmedium 10%ig aus der 2. Vorkultur angeimpft und 24 h kultiviert. Folgende Fermentationsparameter wurden eingestellt: Rührerdrehzahl beim Start: 400 rpm; pO2: 20%; Temperatur: 30°C; pH während des Wachstums: 5,5.Seed Fermenter - Seed fermentation was performed in a 2 L bioreactor (Sartorius). For this purpose, 1 L of mineral salt medium 10% was inoculated from the 2nd preculture and cultured for 24 h. The following fermentation parameters were set: stirrer speed at start: 400 rpm; pO 2 : 20%; Temperature: 30 ° C; pH during growth: 5.5.
Produktionsfermenter – Die Produktionsfermentation wurde in einem 2 L-Bioreaktor (Sartorius) durchgeführt. Dazu wurde 1 L Minimalmedium 10%ig aus dem Seed-Fermenter angeimpft und 70 h kultiviert. Als Kohlenstoffquelle diente Rohglycerol (80%). Als Substrat für die Biotransformation zu 3HIB wurde eine Lösung aus Ketoisovalerat und Valin zudosiert. Es wurde sichergestellt, dass keine Limitierung von Ketoisovaleriansäure eintrat.Production fermenter - The production fermentation was performed in a 2 L bioreactor (Sartorius). For this purpose, 1 L minimal medium 10% was inoculated from the seed fermenter and cultured for 70 h. The source of carbon was crude glycerol (80%). As a substrate for the biotransformation to 3HIB, a solution of ketoisovalerate and valine was added. It was ensured that no limitation of ketoisovaleric acid occurred.
Folgende Fermentationsparameter wurden eingestellt:
Rührerdrehzahl beim Start: 400 rpm; pO2: 20%; Temperatur: 30°C; pH während des Wachstums: 5,5 und mit Beginn der Produktbildung nach 16 h pH-Shift auf pH 2 durch Eigenansäuerung; pH-Regulierung mit 25%igem NH4OH. The following fermentation parameters were set:
Stirrer speed at start: 400 rpm; pO2: 20%; Temperature: 30 ° C; pH during growth: 5.5 and with commencement of product formation after 16 h pH shift to
Die Kultivierung erfolgte in Mineralsalzmedium mit folgender Zusammensetzung: 6,17 g/l (NH4)2SO4; 2 g/l KH2PO4; 1 g/l MgSO4 × 7H2O; 44 mg/l ZnSO4 × 7H2O; 10 mg/l FeSO4 × 7H2O; 50 μg/l Thiamin × HCl; 60 mg/l CaCl2 × 6H2O; 100–140 g/l Glycerin; Spurenelemente (1000fach) 1 ml/l. Die Spurenelemente hatten folgende Zusammensetzung: 50 mg/100 ml H3BO3; 4 mg/100 ml CuSO4 × 5H2O; 10 mg/100 ml KI; 20 mg/100 ml MnSO4 × 4H2O; 40 mg/100 ml Na2MoO4 × 2H2O; 40 mg/100 ml ZnSO4 × 7H2O.The cultivation was carried out in mineral salt medium having the following composition: 6.17 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 ; 2 g / l KH 2 PO 4 ; 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O; 44 mg / l ZnSO 4 .7H 2 O; 10 mg / l FeSO 4 × 7H 2 O; 50 μg / l thiamine × HCl; 60 mg / l CaCl 2 × 6H 2 O; 100-140 g / l glycerol; Trace elements (1000 times) 1 ml / l. The trace elements had the following composition: 50 mg / 100 ml H 3 BO 3 ; 4 mg / 100 ml CuSO 4 × 5H 2 O; 10 mg / 100 ml KI; 20 mg / 100 ml MnSO 4 × 4H 2 O; 40 mg / 100 ml Na 2 MoO 4 × 2H 2 O; 40 mg / 100 ml ZnSO 4 .7H 2 O.
Nach 2,5 h Fermentation bei pH 2 waren 0,500 g/L 3 HIB synthetisiert worden, davon lagen 0,498 g/L als freie Säure vor. Von 20 h bis 40 h Fermentationszeit steigerten wir den pH-Wert langsam auf pH 3,8 durch Zugabe von Ammoniumwasser. In diesem Zeitraum wurden zusätzlich 2,7 g/L gebildet. Insgesamt lagen nach 40 h also 3,2 g/L 3 HIB – davon 2,8 g/L als freie Säure – vor. Von 40 h bis 70 h Fermentationszeit ließen wir den pH-Wert durch Eigenansäuerung auf pH 3 absinken. In diesem Zeitraum wurden zusätzlich 3,2 g/L 3-HIB synthetisiert. Von den nach 70 h vorliegenden 6,4 g/L 3HIB lagen 6,2 g/L als freie Säure vor, bei einem pH-Wert von pH 3. Bei einem für die meisten Fermentation üblichen neutralen pH-Wert von pH 7 hätte zu diesem Zeitpunkt der Anteil freier Säure 0,035 g/L betragen (s.
Beispiel 2 (nicht erfindungsgemäß): Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure in Yarrowia lipolytica mit Ketoisovalerat als Substrat ohne pH-Shift auf pH 2Example 2 (not according to the invention): Preparation of 3-hydroxyisobutyric acid in Yarrowia lipolytica with ketoisovalerate as substrate without pH shift to
Als Produktionsstamm wurde die Hefe Yarrowia lipolytica gewählt. Im beschriebenen Beispiel wurde der pH-Wert während der Kultivierung durch Eigenansäuerung auf pH 3,8 abgesenkt. In einem Zeitraum von 47,3 h wurde bei pH 3,8–pH 4 in einem Volumen von 1 L Kulturbrühe 1,04 g/L 3HIB als freie Säure gebildet. Das Zielprodukt 3-Hydroxyisobuttersäure wurde durch Biotransformation aus Ketoisovalerat synthetisiert.The Yarrowia lipolytica yeast was chosen as the production strain. In the example described, the pH was lowered during cultivation by self-acidification to pH 3.8. In a period of 47.3 hours at pH 3.8-
Die Kultivierungsbedingungen im Detail: Die Animpfschiene für die Fermentation im 2 L Maßstab bestand aus drei Stufen: zwei Vorkulturen auf Agarplatten und einer Vorkultur im Schüttelkolben.
Erste Vorkultur – Ausstrich aus Cryokultur von Y. lipolytica H222-27-11 auf Reader-Agar (3 g/l (NH4)2SO4;
0,7 g/l MgSO4 × 7H2O; 1 g/l KH2PO4; 0,16 g/l K2HPO4; 0,5 g/l NaCl; 0,4 g/l Ca(NO3)2 × 4H2O; 30 g/l Agar) und Kultivierung für 24 h bei 30°C
Zweite Vorkultur – Ausstrich von 2–3 Impfösen von Y. lipolytica H222-27-11 aus erster Vorkultur auf Mineralsalzmedium-Agar, Kultivierung für 24 h bei 30°C.The cultivation conditions in detail: The inoculation rail for the fermentation in the 2 L scale consisted of three stages: two precultures on agar plates and one preculture in the shake flask.
First preculture smear of cryoculture of Y. lipolytica H222-27-11 on reader agar (3 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 ;
0.7 g / l MgSO 4 .7H 2 O; 1 g / l KH 2 PO 4 ; 0.16 g / l K 2 HPO 4 ; 0.5 g / l NaCl; 0.4 g / l Ca (NO 3 ) 2 x 4H 2 O; 30 g / l agar) and culturing for 24 h at 30 ° C
Second preculture smear of 2-3 inoculants of Y. lipolytica H222-27-11 from first preculture on mineral salt medium agar, culturing for 24 h at 30 ° C.
Dritte Vorkultur – Die dritte Vorkultur von Y. lipolytica H222-27-11 erfolgte als sterile Schüttelkultur in 1 L-Erlenmeyerkolben (mit Schikane, Weithalsausführung) mit je 100 ml Mineralsalzmedium. Als Inokulum wurden je 2–3 Impfösen der ersten Vorkultur verwendet. Die Kulturen wurden bei 30°C für 48 h auf einem Schüttler mit Inkubationshaube inkubiert. Die Schüttelfrequenz betrug 170 rpm. Zur Regulierung des pH-Wertes im Bereich pH 4,5 bis 5,5 wurde nach 24 h mit 20%iger NaOH nachgestellt. Als Kohlenstoffquelle wurde 80 g/l Glycerol eingesetzt. Nach spätestens 48 h wurde die Kultivierung wegen verstärkter Säurebildung beendet. Nach Abschluss der Kultivierung lag ein Restglycerolgehalt von 12–20 g/l vor.Third preculture - The third preculture of Y. lipolytica H222-27-11 was carried out as a sterile shake culture in 1 L Erlenmeyer flask (with baffle, wide-necked) with 100 ml mineral salt medium. As inoculum, 2-3 inoculations of the first preculture were used. The cultures were incubated at 30 ° C for 48 h on a shaker with incubation hood. The shaking frequency was 170 rpm. To regulate the pH in the range of pH 4.5 to 5.5 was readjusted after 24 h with 20% NaOH. The carbon source used was 80 g / l glycerol. After 48 h at the latest, cultivation was stopped due to increased acid formation. After completion of the cultivation, a residual glycerol content of 12-20 g / l was present.
Produktionsfermenter – Die Produktionsfermentation wurde in einem 2 L-Bioreaktor (Sartorius) durchgeführt. Dazu wurde 1 L Minimalmedium 10%ig aus der dritten Vorkultur angeimpft und 70 h kultiviert. Als Kohlenstoffquelle diente Rohglycerol (80%). Als Substrat für die Biotransformation zu 3HIB wurde eine Lösung aus Ketoisovalerat und Valin zudosiert. Es wurde sichergestellt, dass keine Limitierung von Ketoisovaleriansäure eintrat. Folgende Fermentationsparameter wurden eingestellt:
Rührerdrehzahl beim Start: 400 rpm; pO2: 20%; Temperatur: 30°C; pH während des Wachstums: 5,5 und mit Beginn der Produktbildung nach 16 h pH-Shift auf pH 3,5 durch Eigenansäuerung; pH-Regulierung mit 25%igem NH4OH.Production fermenter - The production fermentation was performed in a 2 L bioreactor (Sartorius). For this purpose, 1 L minimal medium 10% was inoculated from the third preculture and cultured for 70 h. When Carbon source served crude glycerol (80%). As a substrate for the biotransformation to 3HIB, a solution of ketoisovalerate and valine was added. It was ensured that no limitation of ketoisovaleric acid occurred. The following fermentation parameters were set:
Stirrer speed at start: 400 rpm; pO2: 20%; Temperature: 30 ° C; pH during growth: 5.5 and with the onset of product formation after 16 h pH shift to pH 3.5 by self-acidification; pH regulation with 25% NH 4 OH.
Die Kultivierung erfolgte in Mineralsalzmedium mit folgender Zusammensetzung: 6,17 g/l (NH4)2SO4; 2 g/l KH2PO4; 1 g/l MgSO4 × 7H2O; 44 mg/l ZnSO4 × 7H2O; 10 mg/l FeSO4 × 7H2O; 50 μg/l Thiamin × HCl; 60 mg/l CaCl2 × 6H2O; 100–140 g/l Glycerin;
Spurenelemente (1000fach) 1 ml/l. Die Spurenelemente hatten folgende Zusammensetzung: 50 mg/100 ml H3BO3; 4 mg/100 ml CuSO4 × 5H2O; 10 mg/100 ml KI; 20 mg/100 ml MnSO4 × 4H2O; 40 mg/100 ml Na2MoO4 × 2H2O; 40 mg/100 ml ZnSO4 × 7H2O.The cultivation was carried out in mineral salt medium having the following composition: 6.17 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 ; 2 g / l KH 2 PO 4 ; 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O; 44 mg / l ZnSO 4 .7H 2 O; 10 mg / l FeSO 4 × 7H 2 O; 50 μg / l thiamine × HCl; 60 mg / l CaCl 2 × 6H 2 O; 100-140 g / l glycerol;
Trace elements (1000 times) 1 ml / l. The trace elements had the following composition: 50 mg / 100 ml H 3 BO 3 ; 4 mg / 100 ml CuSO 4 × 5H 2 O; 10 mg / 100 ml KI; 20 mg / 100 ml MnSO 4 × 4H 2 O; 40 mg / 100 ml Na 2 MoO 4 × 2H 2 O; 40 mg / 100 ml ZnSO 4 .7H 2 O.
Nach 47,3 h Fermentation bei pH 4 waren 1,28 g/L 3 HIB synthetisiert worden, davon lagen 1,04 g/L als freie Säure vor (s.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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