DE3049308A1 - Verfahren zur bildung des enzyms (alpha)-galactoxidase und zur hydrolyse von raffinose unter verwendung dieses enzyms - Google Patents
Verfahren zur bildung des enzyms (alpha)-galactoxidase und zur hydrolyse von raffinose unter verwendung dieses enzymsInfo
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Description
E.N.I.
Verfahren zur Bildung des Enzyms (X-Galactoxidase und zur
Hydrolyse von Raffinose unter Verwendung dieses'Enzyms
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung des #-Galactoxidase-Enzyms
(E.C. 3.2.1.2.2) durch Züchtung γοη Mikroorganismen
der Gattung Saccharomyces sowie die Hydrolyse von Raffinose unter Anwendung eines solchen Enzyms.
Raffinose, ein Trisaccharid, das in deutlichen Mengen in Zuckerrüben
vorkommt, hindert die Kristallisation von Saccharose und dadurch werden die bei der Extraktion erzielten Ausbeuten gering.
Diese Tatsache stellt ein ernstes wirtschaftliches Problem bei der Zuckerfabrikation dar, so daß die Hydrolyse von Raffinose
zwingend notwenig wird,um sowohl die Qualität als auch die Wirksamkeit
des Verfahrens bei der Kristallisation des extrahierten Zuckers zu verbessern.
In vielen Veröffentlichungen sind enzymatische Verfahren zur Hydrolysierung von Raffinose beschrieben, bei denen Enzyme angewandt
werden, die extrahiert worden sind von einer Anzahl von Arten der Mikroorganismen der Gattungen Absidia, Aspergillus,
Bacillus, Circinella, Escherichia, Micrococcus, Mortierella, Penicillium u.a..
Der bei der Züchtung vieler Mikroorganismen erhaltene Zellextrakt enthält jedoch nicht nur&-Galactoxidase sondern auch Invertase,
so daß bei der Behandlung von Zuckerrüben-Melasse die Hydrolyse von Raffinose ungünstiger Weise begleitet wird von der Hydrolyse
der Saccharose.
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Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß die erfindungsgemäß ausgewählten Mikroorganismen,
die zu der Gattung Saccharomyces gehören, günstiger Weise den Vorteil einer verringerten Züchtungszeitverglichen mit Schimmelpilze^
verbinden mit der Eigenschaft, daß sie eine hohe 06 -Galacotixdase-Aktivität Jedoch keine Invertase-Aktivtät
besitzen·
Diese Mikroorganismen, die aus dem Abwasser von Olivenölmühlen im Bereich von Monterotondo (Rom, Italien) isoliert worden
sind, wurden klassifiziert als Saccharomyces cerevisiae, var. oleaceous und Saccharomyces cerevisiae, var. oleaginosus und
wurden beim Northern Regional Center of the US Department of Agriculture, Peoria, 111., hinterlegt, wo sie die Nummern
NRRL Y 12056 und NRRL Y 12057 erhielten.
Ihre Kultur-, morphologischen und physiologischen Charakteristika sind in folgenden angegeben.
A. Kultur-Charakteristika
1. Festes Medium (3 Tage): Malzagar
Die Kolonien sind butterartig, cremefarben und glänzend.
2. Flüssiges Medium (3 Tage) : Malzextrakt
Es bildet sich ein Sediment (bei S.cerevisiae, var. oleaginosus wird ein schwacher Ring beobachtet).
B. Morphologische-Charakteristika
1. Charakteristika der vegetativen Zellen:
Die Zellen sind ellipsoid, zylindrisch und manchmal länglich.
2. Bildung von Pseudomyzel oder echtem Myzel:
Unter anaeroben Bedingungen ist ein rudimentäres Pseudomyzel vorhanden.
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C. Sexual-Charakteristika
Die vegetativen Zellen werden direkt in Asci umgewandelt die 1 bis 4 spheroide Sporen enthalten.
D. Physlologische-Charakteristika
1. Verwertung von Kohlenstoffquellen:
a) Fermentation:
S.cerevisiae S.cerevisiae var.oleaceus var.oleaginosus
Glucose + +
Galactose - +
Maltose - +
Threalose
Melibiose + +
Raffinose - +
b) Assimilation:
var.oleaceus var.oleaginosus
Glucose + +
Galactose + +
Maltose - +
Threalose + +
Melibiose + +
Raffinose + +
D-Mannit +
D-Sorbit +
Äthanol + +
Glycerin + +
DL-Milchsäure +
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30A9308
Die anderen Kohlenstoffverbindungen werden nicht assimiliert.
2. Assimilation von Stickstoffverbindungen: Kaliumnitrat: negativ
3. Wachstum bei 370C: positiv
Bei der Klassifizierung wurde dem Schema von J.P. Van der
Walt in "The Yeasts", 2«, Auflage, herausgegeben von J. Lodder,
gefolgt.
Die Kulturen der Stämme, die unter die Erfindung fallen, können
nach irgendeinem bekannten Verfahren unter aeroben Bedingungen hergestellt werden z.B. als Oberflächenkulturen oder vorzugsweise
als Submers-Kulturen in einem Rührfermentor.
Ein Kulturmedium, das entweder fest oder flüssig sein kann, enthält eine Quelle für assimilii
für Stickstoff und Mineralsalze.
für Stickstoff und Mineralsalze.
enthält eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff eine Quelle
Als Kohlenstoffquellen können Glucose, Melibiose, Raffinose
sowie andere Zucker, Glycerin und Natriumacetat angewandt werden.
Als Stickstoffquellen können anorganische und organische Stickstoffverbindungen
wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Tripton, Aminosäuren, Caseinhydrolysate, Sojabohnenmehl und Ammoniumsalze
angewandt werden.
Ein anderer bedeutender Vorteil der durch die Anwendung der erfindungsgemäß
verwendeten Mikroorganismen erzielt werden kann, ist die Tatsache, daß das Enzym gebildet wird wenn die Mikroorganismen
auf Glucose gezüchtet werden (das Enzym ist konstitutiv).
Ein geeignetes Kulturmedium besitzt z.B. die folgende Zusammensetzung:
130039/1011
-X-
Glucose 10 g/l
Spuren von NaH2PO4,
MgSO4, (NH4)2S04 1 g/1
Der pH-Wert für die Kultur liegt bei 4 bis 7 und vorzugsweise bei 5,0 bis 5,5 und die Temperatur zwischen 20°C und 40°C vorzugsweise
zwischen 25°C und ZQ0C.
Die Enzymproduktion kann erhöht werden durch Zusatz kleiner
Mengen an Melibiose, die bekanntlich das Disaccharid ist, das durch teilweise Hydrolyse von Raffinose entsteht. Melibiose
kann direkt zu dem Kulturmedium vor dem Inokulum zugesetzt
werden oder nach/üem die logarithmische Wachstumsstufe vorüber ist. Die Induktionszeit kann von 16 Stunden bis zu 72 Stunden variieren und beträgt vorzugsweise zwischen 40 Stunden und
48 Stunden.
Mengen an Melibiose, die bekanntlich das Disaccharid ist, das durch teilweise Hydrolyse von Raffinose entsteht. Melibiose
kann direkt zu dem Kulturmedium vor dem Inokulum zugesetzt
werden oder nach/üem die logarithmische Wachstumsstufe vorüber ist. Die Induktionszeit kann von 16 Stunden bis zu 72 Stunden variieren und beträgt vorzugsweise zwischen 40 Stunden und
48 Stunden.
Die während der Fermentation oder nach deren Absiiluß gewonnenen
Zellen können als solche oder in Form eines trockenen Pulvers verwendet werden. Wahlweise können auch rohe oder gereinigte
Extrakte solcher Zellen angewandt werden.
Extrakte solcher Zellen angewandt werden.
Hierzu werden die Zellen nach irgend einem bekannten Verfahren aufgebrochen und der enzymhaltige rohe oder gereinigte
Extrakt wird angewandt.
Letztlich kann eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung
erreicht werden durch Immobilisierung der Enzyme indem man sie mit makromolekularen Verbindungen zusammenbringt
unter Ausbildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder durch ionische Bindungen oder auch durch physikalische Immobilisierung
des Enzyms oder der Zellen.
Die so erhaltenen Zellen werden als solche oder immobilisiert zu einem Reaktionsgemisch zugegeben, das Melasses enthält^ bei
einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 7 und bei einer Temperatur von 30 bis 60°C. Die in der Melasse enthaltene Raffinose wird so zu Galactose und Saccharose hydrolysiert wodurch die Ausbeute an der zuletzt genannten Verbindung verbessert wird.
einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 7 und bei einer Temperatur von 30 bis 60°C. Die in der Melasse enthaltene Raffinose wird so zu Galactose und Saccharose hydrolysiert wodurch die Ausbeute an der zuletzt genannten Verbindung verbessert wird.
130039/1011
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Es wird eine Kulturbrühe der folgenden Zusammensetzung hergesteRt:
^24 5 g/l
MgSO4.7H2O 5 g/l
Na2HPO4^I2H2O 4,6 g/l
KH2PO4 3 g/l
NaCl 0,1 g/l
CaCl2 0,05 g/l
Hefeextrakt 10 g/l
Melibiose 10 g/l
Diese Verbindungen werden in entionisiertem Wasser gelöst und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert.
Das so erhaltene Kulturmedium wurde in 250-ml« Weithals-Erlenmayer-Kolben
verteilt ( 100 ml Kulturbrühe pro Kolben, 30 Minuten bei 116°C sterilisiert). Die Kolben wurden mit 1 ml einer
Kultur des Stammes Saccharomyces cerevisiae, var.oleaceus in 250 ml Kolben ,
und das Wachstum,
und das Wachstum,
y ,
,enthaltend 50 ml der gleichen Kulturbrühe, beimpf t
tum, bei 25°C 16 Stunden unter Rühren'durchgeführt,
Die Fermentationskolben wurden unter Rühren (180 UpM) bei 25 C inkubiert.
hO Stunden nach der Beimpfung wurden die Zellen der in der
Brühe gewachsenen Kulturen abzentrifugiert und mit Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) gewaschen. Aus 100 ml Kulturbrühe erhielt
man 0,55 g getrocknete Zellen.
Die aus 100 ml Kulturbrühe gewonnenen feuchten Zellen wurden
erneut in 100 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) auf ge schlämmt
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und die Enzymaktivität bestimmt. Ein Gramm der getrockneten
•7
Zellen enthielt ungefähr 1.10' Enzymeinheiten. Die Enzymaktivität
wurde nach dem folgenden Verfahren gemessen.
Zu einem ml der gepufferten Zellaufschlämmung wurden 4 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) und wenige Tropfen Toluol zum
Aufbrechen der Zellwände gegeben. Nach 15 Minutenlanger Inkubation
unter Rühren bei 40°C wurde die-Aufschlämmung mit 10 ml
einer 1-#igen Lösung (Gew./Vol.) Melibbse in Phosphatpuffer
(0,1 m,pH 5,6) ergänzt.
Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 40°C unter Rühren im Wasserbad inkubiert und die Reaktion durch 15 Minutenlanges
Erhitzen abgebrochen und von dem Reaktionsgemisch wurden.Probe
entnommen.
Die Konzentration an Glucose, wie sie durch Hydrolyse von MeIibiose
während der Reaktion entsteht, wurde nach der kolorimetrischen GOD-Perid-Methode von Boehringer Mannheim GmbH bestimmt,
Die optische Dichte der gefärbten Proben wurde bei Raumtaperatur
in einem Perkin-Elmer Coleman 55 Spectrophotometer optischer
Weg in dem Schiffchen gleich 0,1 dm bei einer Wellenlänge von 436 nm gemessen.
Wenn man als eine Einheit die Enzymmenge definiert, die 1 ,ug
Glucose in 2 Stunden unter den oben angegebenen Untersuchungsbedingungen
bildet, können die Enzymeiheiten pro Gramm trockener
Zellen nach der folgenden Formel berechnet werden:
U (E2h~E0h)# 18'2
Gramm getrockneter Zellen Estandard * C
E2J1 = optische Dichte der Probe nach 2 Stunden
EQn = optische Dichte der Probe nach 0 Stunden
= optische Dichte einer Standard-Glucoselößungf
enthaltend 18,2/Ug Glucose pro Millimeter
'
Gewicht der trockenen Zellen in 100 ml KuI-
| 5 | g/l | g/i |
| 0,5 | g/l | g/l |
| 4,6 | g/l | |
| 3 | g/l | |
| 0,1 | g/l | |
| 0,05g/l | ||
| 10 | ||
| 10 |
Beispiel 2
Es wurde eine Kulturbrühe der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
(NH4)2S04
MgSO4·7Η20 Na2HPO4.12H2O KH2PO4
NaCl
MgSO4·7Η20 Na2HPO4.12H2O KH2PO4
NaCl
CaCl2
Hefeextrakt
Glucose
Diese Verbindungen wurden in entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert dann mit Salzsäure auf 5,3 eingestellt.
Kulturen des ßtammes Saccharomyces cerevisiae, var.oleaceus,
die entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden unter Rühren (Orbital, 180 UpM) in dieser Brühe bei 270C
inkubiert.
39 Stunden nach dem Beimpfen wurden die Zellen wn der Kulturbrühe
abzentrifugiert und mit Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) gewaschen.
Aus 100 ml Kulturbrühe erhielt man 0,546 g trockene Zellen. Die aus 100 ml Brühe gewonnenen Zellen wurden erneut in 100 ml
Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) aufgeschlämmt und die Enzymaktivität
bestimmt: 1g trockene Zellen enthielt 9,4 · 10 Enzymeinheiten.
Es wurde ein Kulturmedium in der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
130039/101 1
(NH4)2S04 5,00 g/1
MgSO4*7H2O 0,5 g/l
Na2HPO4·12H2O 4,6 g/l
KH2PO4 3,00 g/l
NaCl 0,1 g/l
CaCl2 0,05 g/l
Hefeextrakt 10 g/l
Glucose 10 g/l
Melibiose 1 g/l
Die oben angegebenen Verbindungen wurden in entionisiertem
Wasser gelöst und der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,3 eingestellt.
Kulturen des Stammes Saccharomyces cerevisiae, var.oleaceus,
die entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden unter Orbitalrühren (180 UpM) bei 270C inkubiert. 43 Stunden
nach dem Beimpfen wurden die Zellen von der Kulturbrühe abzentrifugiert
und mit Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) gewaschen. Aus 100 ml Kulturbrühe erhielt man 0,594gtrockene Zellen.
Die aus 100 ml Kulturbrühe gewonnenen Zellen wurden in 100 ml
Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) aufgeschlämmt und die Enzymaktivität
bestimmt: 1 g trockene Zellen enthielt 1,6 · 10' Enzymeinheiten.
Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
(NH4J2SO4 5,00 g/l
MgSO4*7H2O 0,05 g/l
NaHPO4·12H2O 4,6 g/l
KH2PO4 3,0 g/l
NaCl 0,1 g/l
130039/101 1
CaCl2 0,05 g/l
Hefeextrakt 10,0 g/l
. Glucose 5,0 g/l
Melibiose 5,0 g/l
Die oben angegebenen Verbindungen wurden in entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,3 eingestellt.
Kulturen von Saccharomyces cerevisiae, var.oleaceus, die wie
in Beispiel 1 angegeben hergestellt worden waren, wurden in einer solchen Brühe unter Orbitalrühren (180 UpM') bei 29°C
inkubiert. 48 Stunden nach dem Beimpfen der Kulturbrühe wurden die Zellen abzentrifugiert und mit Phosphatpuffer (0,1 m,
pH 5,6) gewaschen. Aus 100 ml Kulturbrühe erhielt man 0,365 g trockene Zellen.
6 ml der Kulturbrühe wurden zu 50 ml, 35° Brix-Melasse,enthaltend
1,6 Gew.-96 Raffinose bezogen auf die Gesamtfeststoffe,
gegeben und das Gemisch mit H2SO^ auf einen pH-Wert von 5,2
eingestellt. Die Behandlung wurde 16 h unter Rühren bei 40°C durchgeführt. Die Konzentration an Galactose, die während
der Reaktion durch Hydrolyse von Raffincse entsteht, wurde
nach der Methode Lactose/Galactose UV-Test von Boehringer Mannheim GmbH bestimmt. Unter den oben angegebenen Bedingungen
wurden 153/umol Galactose^entsprechend der Hydrolyse von 30 %
der gesamten vorhandenen Raffinose gebildet.
130039/101 1
Claims (2)
1. Verfahren zur Bildung von OC-Galactoxidase-Enzym durch
Fermentation einer Hefe der Gattung Saccharomyces cerevisiae bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 7 und einer Temperatur
zwischen 20 und 4O0C.
2. Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Raffinose,
dadurch gekennzeichnet , daß die Reaktion in Gegenwart von Zellen, Enzymextrakten und/oder angereicherten
Enzymextrakten von Hefen der Gattung Saccharomyces cerevisiae oder in Gegenwart von immobilisierten Enzymen oder Zellen
durchgeführt wird.
6226
130039/1011
ORIGINAL /NSPECTEO
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3049308A1 true DE3049308A1 (de) | 1981-09-24 |
| DE3049308C2 DE3049308C2 (de) | 1982-11-11 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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-
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