FI70596B - Foerfarande foer enzymatisk hydrolysering av raffinos - Google Patents

Description

! 70596

Menetelmä raffinnosin entsymaattiseksi hydrolysoi- misfkr.i F ö r f a ra n d e för e n 7 y n a t i s k hy d r o J y a e r i n g av r a f f i n o s Tämä keksintö koskee menetelmää raffinnosin entsymäntti seksi h y d r o J y so imi seksi Saccharomyces cerevisia e v a r . oleaceus NR RL Y 12036 kokonaisten solujen tai rikotuista soluista saadun aLfa-qalaktosidaasia sisältävän uutteen 5 läsnäollessa.

Raffinoosia, joka on trisakkaridi, esiintyy huomattavia määriä sokerijuurikkaissa, ja se haittaa sakkaroosin kiteytymistä ja näin ollen heikentää uutesaantoa. Tämä seikka on vakava taloudellinen ongelma sokeritehtaissa, ja näin .10 ollen raffinoosi pitää hydrolysoida, jos halutaan parantaa sokerin laatua ja tehostaa uutetun sokerin kiteytymistä.

Lukuisissa julkaisuissa on kuvattu raffinoosin ent.sy-maattisia hydrolysoin timenetel m iä, joissa käytetään sellaisia entsyymejä, jotka on uutettu mikro-organismila-15 j e i s t a, jotka kuuluvat sukuihin A b s i d i a , Aspergillus ,

Bacillus , Circinella , Escher _ici_a, Micrococcus , Mortierella , Penicillium jne.

Kuitenkin useiden mikro-organismien viljelyn jälkeen saatu solu-uute sisältää alfa-qalaktosidaasin lisäksi myös 20 invertaasia niin, että sokerijuurikasmelassin hydrolyysin yhteydessä raffinoosin lisäksi hydrolysoituu myös sakkaroosi .

Nyt käsillä olevaan keksintöön liittyvät ne huomattavat edut, että keksinnöntekijöiden valitsemilla mikro-orga-25 nismeiila, jotka kuuluvat Saccharomyces-sukuun, on lyhyempi kasvatusaika kuin homeilla ja niillä on korkea alfa-galakto-sidaasiaktiivisuus ilman invertaasiaktiivisuutta.

Nämä mikro-organismit on eristetty aliiviöljytehtaan jätevedestä Monterotondosta (Rooma, Italia) ja ne on luoki-30 teltu kannoiksi Saccharomyces cerevisiae, var. oleaceus j a Saccharomyces cerevisiae, var. oleaqinosus ja ne on toimitettu säilytettäviksi Northern Regional Center of the US Depart- 2 70596 merit of Agriculture,Pe oria, 111., kokoelmiin, jossa niille on annettu numerot N R R t V 12 0 5 6 ja N R R1 Y 12057,

Niiden kasvulliset., morfologiset ja fysiologiset omi-5 naisuudet ovat seuraavat: A - kasvulliset ominaisuudet 1. Kiinteä kasvualusta (3 vuorokautta): Mallasagar Pesäkkeet ovat voimaisia, kermanvärisiä ja kiiltäviä.

10 2. Nestemäinen kasvualusta (3 vuorokautta): Mallasuute

Muodostui laskeuma (S.cerevisiae, var. oleaqinosus muodosti heikon renkaan).

B - Morfologiset ominaisuudet 1. Vegeta tiivisten solujen ominaisuudet: 13 Solut ovat. ellipsinmuotoisia, sylinterimäisiä ja joskus suippenevia.

2. Pseudomysee1 in tai todellisen myseelin muodostus: Anaerobisissa olosuhteissa havaitaan vähäinen pseudo myseeli.

2Π C - Suvulliset ominaisuudet

Vegetat. iiviset solut muuttuvat suoraan itiökot e loiksi, jotka sisältävät 1-4 pallomaista itiötä.

D - Fysyio 1 ogiset ominaisuudet: 1. Hii1i1 ähteiden käyttö: 25 a) F ermentaatio: 5. cerevisiae S.cerevisiae var. oleaceus var. oleaqinosus glukoosi + + galaktoosi - + ^ maltoosi - + trehaloosi melibioosi + + raffinoosi - + 11 3 70596 b) Assimilaatio: S.cerevisiae Scerevisiae var . oleaceus var. oleaqinosus glukoosi + + 5galaktoosi - + maltoosi - + trehaloosi - - melibioosi + + raffinoosi - - 10D-mannitoli - D-glusitoli - etanoli i - glyseroli - - DL-maitohappo - 13 Muut yhdisteet eivät assimiloidu.

1. Typpiyhdisteiden assimilaatio:

Ka 1iumnitraa11i : negatiivinen 3. Kasvu 37 °C:ssa: positiivinen

Luokituksessa on käytetty kaaviota, jonka J.P. der 20 Walt on esittänyt teoksessa "The Yeasts", 2nd Edition, toim.

J . L odde r.

Tämän keksinnön mukaisia kantoja voidaan viljellä aerobisissa olosuhteissa millä tahansa tunnetulla menetelmällä kuten pintakasvatuksina tai mielellään pinnanalaisvil-25 jelininä fermentoreissa sekoituksen alaisena.

Kasvatusalusta, joka voi olla joko kiinteä tai nestemäinen, sisältää assimiloituvan hiililähteen, typpi lähteen ja minera a 1isuo1 oja.

Hi 11i1 ähteinä voidaan käyttää glukoosia, melibioosia, 30 rafinoosia tai muita sokereita, glyserolia ja natriumasetaat-t i a .

Typpi1 ähteik si sopivat epäorgaaniset ja orgaaniset typpiyhdisteet kuten lihauute, hiivauute, peptoni, tryptöni, aminohapot, kaseiinihydrolysaattit, soijajauho ja ammonium-35 suolat.

4 70596

Vielä eräs nyt kyseessä oleviin mikro-orqanismeihin liittyvä huomattava etu on se, että entsyymiä syntyy, kun kasvatus tapahtuu glukoosissa (entsyymi on konstitutiivinen).

Sopiva kasvatusalusta on koostumukseltaan esim. seu- 5 r a a v a : hiivauute 5-20 g/1 glukoosi 10 g/1

NaH^PO^ (pieni määrä)

MgS04, (NH4)2S04 1 g/1 10 Kasvatuksen pH-alue on 4-7, mielellään 5,0-5,5, ja sopiva lämpötila on välillä 20-40 °C, mielellään välillä 25-28 °C.

Enltsyymin muodostumista voidaan tehostaa lisäämällä kasvualustaan pieni määrä melibioosia, joka tunnetusti on 15 raffinoosin osittaisessa hydro 1yysissä syntyvä disakkaridi. Melibioosi voidaan lisätä kasvualustaan ennen siirrostamis-ta tai sen jälkeen, kun logaritminen kasvuvaihe on ohitettu. Induktioaika voi olla 16-72 tuntia, mielellään 40-48 tuntia.

E erme ntoinnin aikana tai sen jälkeen ta 11eenotetut so-20 lut voidaan käyttää sellaisinaan tai kuivattuna jauheena.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää soluista valmistettua epäpuhdasta tai puhdistettua uutetta.

Tätä tarkoitusta varten solut rikotaan millä tahansa tunnetulla menetelmällä ja käyttöön otetaan epäpuhdas tai 25 puhdistettu uute.

Voidaan myös soveltaa teknillistä tai taloudellista parannusta siten, että entsyymi immobi1isoidaan liittämällä se makromolekulaariseen yhdisteeseen tai muodostamalla kemiallisia sidoksia kantaja-aineen kanssa tai muodostamalla 30 ionisidoksia tai immobi1isoima11a entsyymi tai solut fysikaalisesti .

Saadut solut lisätään sellaisinaan tai immobi1isoitui-na reaktioseokseen , joka sisältää melassia, ja jonka pH on välillä 4-7 ja lämpötila välillä 30-60 °C. Melassin sisal-35 tämä raffinoosi hydrolysoituu näin galaktoosiksi ja sakkaroosiksi ja samalla sakkaroosin saanto paranee.

Keksintöä valaistaan seuraavi1 la esimerkeillä.

Il 5 70596

Esimerkki 1

Kasvualustalla oli seuraava koostumus: (NH4)2S0^ 5 g/1

MgS04.7H20 5 g/1 5 Na2HP04.12H20 4,6 g/1 KH2P04 3 g/1

NaC1 0,1 g/1

CaC12 0,03 g/1 hiivauute 10 g/1 10 melibioosi 10 g/1 Nämä yhdisteet liuotettiin tislattuun veteen ja pH säädettiin suolahapolla arvoon 3,3.

Näin valmistettu kasvatusalusta laitettiin leveä-suisiin 300 ml:n Erlenmeyer-pu1loihin (100 ml pulloa kohti, 15 sterilointi 116 °C , 30 min). Pulloihin siirroste11iin 1 ml Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus -kasvustoa, deponoi ntitunnus NRRL-Y-12056 , joka oli kasvatettu 250 ml:n Er1 enmeyer-pu 11 oiss a, jotka sisälsivät 50 ml edellä mainittua kasvualustaa, ja kasvatus oli tapahtunut 25 °C:ssa 16 20 tunnin aikana sekoituksen alaisena (180 k/min).

Pulloja inkuboitiin 25 °C:ssa sekoituksen alaisina (1801/min).

40 tunnin kuluttua siirrostamisesta solut sentrifugoi-tiin talteen kasvualustasta ja pestiin fosfaattipuskurilla 25 (0,1 M, pH 5,6). 10 mlrsta kasvualustaa saatiin 0,55 g kui vattuja soluja.

100 ml:sta kasvualustaa kerätyt kosteat solut suspen-doitiin 100 ml:aan fosfaattipuskuria ja entsymaattinen aktiivisuus määritettiin. 1 g kuivattuja soluja sisälsi 1.10^ 30 entsyymiyksikköä . Entsyymiaktiivisuus mitattiin seuraavalla menetelmällä.

1 ml:aan puskuroitua solususpensiota lisättiin 4 ml fosfaattipuskuria (o,l M, pH 5,6) ja muutama tippa toluee-nia solujen rikkomiseksi. Kun seosta oli sekoitettu 15 mi-35 nuuttia 40 °C:ssa, siihen lisättiin 10 ml melibioosin 1¾ ( paino/tilav. ) fosfaa11ipuskuri1iuosta (o,l M, pH 5,6).

6 70596

Reaktioseosta s .koitettiin 2 tuntia 40 °C:ssa vesihauteella ja sen jälkeen reaktio katkaistiin keittämällä 15 minuuttia ja otettiin näytteet.

Melibioosin hydrolyysissä muodostuneen glukoosin 5 väkevyys määritettiin ko1 or imetrise11 a GOD-menete 1mä 11ä (Boehringer Mannheim GmbH).

Värillisten näytteiden optinen tiheys mitattiin huoneenlämpötilassa Perkin-Elmer Coleman 55 spektrofotomet-rillä, optinen 0,1 dm, aallonpituus 436 nm.

10 Jos yksikkö määritellään siksi määräksi entsyymiä, joka tuottaa 1 ^ug glukoosia 2 tunnissa edellä kuvatuissa määritysolosuhteissa, entsyyrniyksikkömäärä grammasta kuivattuja soluja voidaan laskea seuraavasta kaavasta: 15 U (E2h -W ' 1B'2 · 15 ' 100

E C

gramma kuivattuja soluja standardi jossa E2on 2 tunnin kuluttua otetun näytteen optinen tiheys, on 0 tunnin kuluttua otetun näytteen optinen tiheys.

20 ^"standardi on optinen tiheys glukoosin s t anda r d i 1 i uok s e 11 e , joka sisältää 18,2 mikrogrammaa glukoosia milli-litraa kohti.

C on solumäärä grammoina 100 ml:ssa kasvu 1iuonta.

Esimerkki 2 25 Kasvualustalla oli seuraava koostumus: (NH4)2S04 5 g/1

MgS04.7H20 0,5 g/1

Na2HP04. 12H20 4,6 g/1 KH2P04 3 g/1 30 NaC1 0,1 g/1

CaC12 0,05 g/1 hiivauute 10g/l glukoosi 10 g/1

Luetellut aineet liuotettiin tislattuun veteen ja pH 35 säädettiin suolahapolla arvoon 5,3.

7 70596

Saccharoroyces cerevisiae var. oleaceus -kantaa viljeltiin esimerkin 1 mukaisesti sekoituksen alaisena (orbi-taali, 180 1/min) 27 °C:ssa.

39 tunnin kuluttua siirrostamisesta solut sentrifugoi-5 tiin talteen k asvu 1 iuoksesta ja pestiin fosfaattipuskurilla (0,1 M, pH 5,6).

100 m1:sta kasvuliuosta saatiin 0,546 g kuivattuja soluja. 100 ml :sta kasvuliuosta saadut solut suspendoitiin 100 ml:aan puskuria (0,1 M, pH 5,6) ja määritettiin entsyy-10 miaktiivisuus: 1 g kuivattuja soluja sisälsi 9,4 . 10^ e n t - syymiyksikköä.

Esimerkki 3

Kasvatusalustalla oli seuraava koostumus: (NH4)2S04 5,00 g/1 15 MgS04.7H20 0,5 g/1

Na2HP04.12H20 4,6 g/1 KH2P04 3,00 g/1

NaC1 0,1 g/1

CaCl2 0,05 g/1 20 hiivauute 10 g/1 glukoosi 10 g/1 melibioosi 1 g/1

Luetellut aineet liuotettiin tislattuun veteen ja pH säädettiin suolahapolla arvoon 5,3.

25 Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus -kantaa kasvatettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla 27 °C:ssa käyttämällä orbitaa 1isekoitusta (180 1/min). 43 tunnin ku luttua siirrostamisesta solut sentrifugoitiin talteen kasvu-liuoksesta ja pestiin fosfaattipuskurilla (0,1 M, pH 5,6).

30 100 ml:sta kasvuliuosta saatiin 0,594 g kuivattuja soluja.

100ml:sta kasvuliuosta otettiin talteen solut ja sus-pendoitiin uudelleen 100 ml:aan fosfaattipuskuria (0,1 M, pH 5,6) ja entsyymiaktiivisuus määritettiin: 1 g kuivattuja soluja sisälsi 1,6 . 10^ entsyymiyksikköä.

35 Esimerkki 4

Kasvualustalla oli seuraava koostumus: 70596

O

(Nh4)2S04 3,00 g/1

MgS04.7H20 0,05 g/1

NaHP04.12H20 4,6 g/1 KH2P04 3,0 g/1 5 NaCl 0,1 g/1

CaC12 0,05 g/1 hi ivauute 10,0 g/1 glukoosi 5,0 g/1 melibioosi 5,0 g/1 10 Luetellut yhdisteet liuotettiin tislattuun veteen ja pH sää- detiin suolahapolla arvoon 5,3.

Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus -kantaa kasvatettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla 29 °C:ssa käyttämällä orbitaali-sekoitusta (180 1 / m i n ) . 48 tunnin kuluttua siirrostamisesta 15 solut sentrifugoitiin talteen kasvu 1 iuoksesta ja pestiin fosfaattipuskurilla (0,1 M, pH 5,6). 100 ml:sta kasvuliuosta saatiin 0,365 g kuivattuja soluja.

6 ml kasvuliuosta lisättiin 50 ml:aan melassia (35°Brix), joka sisälsi 1,6 paino-% raffinoosia kokonaiskuiva-aineesta lasket-20 tuna, ja pH säädettiin rikkihapolla arvoon 5,2. Käsittely suoritettiin sekoittamalla 40 °C:ssa 16 tuntia. Galaktoosiväkevyys, joka on reaktiossa syntyvä raffinoosin hy dro 1 y so i t omi s t uo t e , määritettiin o a 1 a k t o o s i / 1 a k t o o s i - U \l - kok ee 11 a (Boehringer Mannheim GmbH). Kuvatuissa olosuhteissa syntyi 153 mikromooli? 25 galaktoosia, joka vastaa läsnä olevan raffinoosin 30-prosent-tista hydrolysoitumista.

il