PL127026B1 - Method of obtaining alpha-galoctosidase enzyme - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia enzymu alfa-galaktozydazy (E.C.3.2.1.2.2) przez hodowanie drobnoustrojów rodzaju Saccharomyces, uzytecznej do hydrolizy rafinozy.Rafinoza, trójsacharyd wystepujacy w znacznych ilosciach ,w. burakach cukrowych, utrudnia kry¬ stalizacje sacharozy, powodujac tym samym ob¬ nizenie wydajnosci ekstrakcji. Zjawisko to stano¬ wi powazny problem ekonomiczny przemyslu cu¬ krowniczego, wiec hydroliza rafinozy staje sie ko¬ niecznoscia, gdyz umozliwia poprawienie zarówno pod wzgledem ilosci jak i wydajnosci procesu kry¬ stalizacji ekstrahowanego cukru.W wielu artykulach opisano procesy enzymatycz¬ nej [hydrolizy rafinozy, w których stosowano en¬ zymy ekstrahowane z wielu szczepów drobnoutro- jów z rodzaju Absidia, Aspergillus, Bacillus, Circinella, Escherichia, Micrococcus, Mortierella, Penicillium i innych.Jednak podczas hodowania wielu drobnoustro¬ jów zauwazono, ze wyciag komórkowy zawiera nie tylko alfa-galaktozydaze ale równiez inwertaze a na. skutek tego podczas traktowania melas bu¬ raków cukrowych hydrolizie rafinozy towarzyszy niepozadana hydroliza sacharozy...Najwazniejsza zaleta sposobu wedlug wynalazku jest to, ze drobnoustroje stosowane do hodowli, -nalezace do rodzaju Saccharomyces szczesliwym trafem lacza korzystny czas hodowli, zdecydowa¬ nie obnizony w stosunku do wlasciwego dla tej plesni, z wysoka aktywnoscia alfa-galaktozydaso- wa przy braku aktywnosci inwertazowej.Drobnoustroje te, które wyizolowano ze scieków wytwórni oliwy na terenie Monterotondo (Rzym, Wlochy), zostaly sklasyfikowane jako Saccharomy¬ ces cerevisiae, var. oleaceous i Saccharomyces cerevisiae, var. oleaginosus i odpowiednio zdepono¬ wane w Nerthern Regional Center Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych Ameryki, Peoria, Illinois, gdzie nadano im odpowiednio ' numery NRRLY 12056 i NRRLY 12057.Ponizej zestawiono charakterystyki hodowlane, morfologiczne i fizjologiczne tych drobnoustro¬ jów.A. Charakterystyki hodowlane: 1. Pozywka stala (3 dni):agar slodowy; iolonie sa . maslane, zabarwione kremowo i lsniace. 2. Pozywka ciekla (3 dni): ekstrakt slodowy; tworzy sie osad (w S. cerevisiae, var. oleagino¬ sus wystepuje niewyrazny pierscien).B, Charakterystyki morfologiczne: 1. Charakterystyki komórek Wegetatywnych: ko¬ mórki sa elipsoidalne, cylindryczne i czasami 25 wydluzone. 2. Tworzenie grzybni pozornej lub grzybni rzeczy¬ wistej: szczatkowa grzybnia pozorna wystepuje w warunkach beztlenowych.C Charakterystyki plciowe: w Komórki wegetatywne sa bezposrednio przeksztal- 10 15 20 127 02612T 026 cone w grzybnie, które zawieraja od jednego do czterech kulistych zarodników.D. Charakterystyki fizjologiczne: 1. Wykorzystanie zródel wegla: a) Fermentacja Glikoza Galaktoza Maltoza Trealoza Melibioza Rafinoza b) Przyswaj; Glikoza Galaktoza Maltoza Trealoza Melibioza Rafino*za D-mannit D-glucit Etanol Glicerol Kwas DL- S. 4 var, anie S. i var mlekowy cerevisiae . oleaceus + — — — .+ cerevisiae , oleaceus + ± — ± + ± ± '"' ± ± ± ± S. var.S. var. cerevisiae oleaginosus + + + — + ¦ + cerevisiae oleaginosus + + + ± + ± — - — + ± — 19 15 20 Inne zwiazki wegla nie sa przyswajane. 2. Przyswajanie zwiazków azotu: Azotan potasu: negatywnie 3. Wzrost w temperaturze 37°C: pozytywny W celu klasyfikacji przydatny jest schemat z opisem opracowany przez J. P. Van der Walta w „The Yeasts", wydanie 2, wydawnictwo J. Lod- der.Hodowle szczepów stosowanych w sposobie wed¬ lug wynalazku moga byc otrzymywane w warun¬ kach beztlenowych dowolna znana metoda, na przyklad w hodowli powierzchniowej lub korzys¬ tnie w hodowlach podpowierzchniowyeh w ka¬ dziach fementacyjnych z mieszaniem.Pozywka hodowlana,, która moze byc stala lub ciekla, zawiera zródlo przyswajalnego wegla, zró¬ dlo azotu i sole mineralne.Jako zródlo wegla moga byc stosowane glikoza, melibioza, rafinoza, jak równiez inne cukry, gli¬ cerol i octan sodu.Jako zródla azotu moga byc stosowane nieorga¬ niczne i organiczne zwiazki azotu, takie jak wy¬ ciag miesny, wyciag drozdzowy, pepton, tripton, aminokwasy hydrolizatów kazeiny, maka sojowa i sole amonowe.Inna wybitna zaleta sposobu wedlug wynalazku wynikajaca ze stosowania drobnoustrojów opisa¬ nych powyzej jest to, ze enzym otrzymuje sie podczas hodowania na glukozie (enzym jest ele¬ mentem konstytuujacym).Odpowiednia pozywka hodowlana ma przykla¬ dowo nastepujacy sklad: Wyciag drozdzowy — 5—20 g/l glikoza — 10 g/l Siady NaHjP04 — MgSOf (NHi)aSOi ~ 1 g/l 35 40 45 50 55 60 Zakres wartosci pH dla hodowli wynosi 4—7, a korzystnie 5,0—5,5, natomiast temperatura za¬ warta jest miedzy 20°C i 40GC, korzystnie miedzy 25°C i 28°C.Produkcja enzymu moze byc zwiekszona prze& dodanie malych ilosci melibiozy, która jak wiado¬ mo jest dwusacharydem pochodzacym z czesciowej hydrolizy rafinozy. Melibioze mozna dodac bezpo¬ srednio do pozywki hodowlanej przed zaszczepie¬ niem lub po zakonczeniu stadium wzrostu logaryt¬ micznego. Czas indukcji moze zmieniac sie w za* kresie 16—72 godzin, korzystnie w zakresie 40—48 godzin.Komórki zebrane podczas fermentacji albo po jej zakonczeniu mozna stosowac jako takie w po¬ staci suchego proszku.Alternatywnie mozna stosowac surowe lub oczyszczone wyciagi tych komórek. W tym celu komórki rozdrabnia sie dowolnym znanym sposo¬ bem i stosuje sie surowy lub oczyszczony wyciag zawierajacy enzym.Wreszcie dalsze ulepszenie techniczne i ekono¬ miczne procesu mozna uzyskac przez unierucho¬ mienie enzymu' na drodze polaczenia go ze zwiaz¬ kami wieloczasteczkowymi przez utworzenie wia¬ zan chemicznych z podlozem lub przez wiazanie jonowe albo takze przez fizyczne unieruchomienie enzymu lub zawierajacych go komórek.Komórki otrzymane w opisany sposób dodaje sie jako takie lub po unieruchomieniu do mieszaniny reakcyjnej, która zawiera melasy, przy wartosci pH w zakresie od 4 do 7 i w temperaturze od 30°C do 60°C. Rafinoza zawarta w melasach ule¬ ga dzieki temu hydrolizie do galaktozy i sacharozy, przy czym wydajnosc sacharozy jest wyzsza.Nastepujace przyklady ilustruja inne drogi po¬ stepowania zgodnie ze sposobem wedlug wyna^ lazku.Przyklad I. Przygotowano pozywke hodowla¬ na o nstepujacym skladzie: (NH4)2S04 MgS04-7H20 Na2HP04-12H20 KH2P04 — 5 g/l — 5 g/l — 4,6 g/l — 3 g/l — 0,1 g/l — 0,05 g/l — 10 g/l — 10 g/l NaCl CaCl2 wyciag drozdzowy Melibioza Wymienione zwiazki rozpuszczono w odjonizo¬ wanej wodzi©, i zakwaszono do wartosci pH 3,5 kwasem solnym. Otrzymana w ten sposób pozywke hodowlana rozlano do kolb Erlenmayera o poje¬ mnosci 500 ml z szerokimi szyjami (100 ml pozyw¬ ki na kolbe, wyjalowienie trwa 30 minut w tem¬ peraturze 116°C). Kolby szczepiono 1 ml kultury szczepu Sacharomyces cerevisiae, var. oleaceus w 250 ml kolbach zawierajacych 50 ml tej samej pozywki i wzrost hodowli promotowano w tem¬ peraturze 25°G w ciagu 16 godzin podczas miesza¬ nia (180 obrotów na minute).Kolby fermentacyjne inkubowano mieszajac (180 obrotów na minute) w temperaturze 2i5°C.Po 40 godzinach liczac od zaszczepienia, komórki kultur hodowlanych oddzielono przez odwirowa¬ nie i przemyto buforem fosforanowym (0,1 M,127 026 pH—5,6). Ze 100 ml pozywki hodowlanej otrzy¬ mano 0,55 g suchych komórek.Wilgotne komórki oddzielone ze 100 ml pozywki zawieszono ponownie w 100 ml buforu fosforano¬ wego {0,1 M, pH=5,6) i okreslono aktywnosc enzy¬ matyczna. Wig suchych komórek zawarte bylo okolo 1-107 jed Mostek enzymatycznych. Aktywnosc enzymatyczna mierzono wedlug nastepujacej pro¬ cedury.Do 1 ml buforowej zawiesiny komórek dodano 4 ml buforu fosforanowego (0,1 M, pH=5,6) i kilka kropli toluenu w celu przerwania scian komórek. Po 15 minutach inkubacji z mieszaniem w temperaturze 40°C zawiesine uzupelniono 10 ml 1% (wagowo/objetosciowo) roztworem melibiozy w buforze fosforanowym (0,1 M, pH=5,6).Reakcje inkubowano w temperaturze 40°C w ciagu 2 godzin w mieszanej lazni wodnej a na¬ stepnie^ przerwano przez trwajace 15 minut goto¬ wanie i pobierano próbki mieszaniny reakcyjnej.Stezenie glikozy otrzymanej przez hydrolize melibiozy podczas reakcji oznaczono kolorymetry¬ cznie metoda GOD-Perid, Boehringer Mannheim GmbH.Gestosc optyczna barwnych próbek mierzono w temperaturze pokojowej w spektrofotometrze 55 Perkin-Elmer Coleman. Droga optyczna lódeczki jest równa 0,1 dm przy dlugosci fali 436.Jezeli okresla sie jedna jednostke ilosciowa en¬ zymu, która wytwarza 1-10-6 g glikozy w ciagu 2 godzin w podanych powyzej warunkach badaw¬ czych, mozna obliczyc z nastepujacego wzoru jednostki enzymu na gram suszonych komórek: U gramy suszonych komórek E2h^EohM8,2-15-100 E *C standard ^ w którym E2h jest gestoscia optyczna próbki pobranej po 2 godzinach; Eon jest gestoscia opty¬ czna próbki pobranej w godzinie 0; Egtandard jest gestoscia optyczna standardowego roztworu gli¬ kozy, który zawiera 18,2* 10-6 g glikozy w mili- litrze; C jest iloscia gramów suszonych komórek w 100 ml pozywki hodowlanej.Przyklad II. Przygotowana pozywke hodo¬ wlana o nastepujacych skladzie: (NH4)2S04 - 5 g/1 MgS04-7H20 — 4,6 g/l Na2HP04-12H20 — 4,6 g/l KH2P04 — 3 g/1 NaCl — 0,1 g/l CaCl2 — 0,05 g/l wyciag drozdzowy — 10 g/l glikoza — 10 g/l Wymienione zwiazki rozpuszczono w odjonizowa¬ nej wodzie a nastepnie wartosc pH doprowadzo¬ no kwasem solnym do 5,3.Kultury w takich pozywkach szczepu Saccharo- myces cerevisiae, var. oleaceus otrzymane w sposób opisany w przykladzie I inkubowano mieszajac (orbital, 180 obrotów na minute) w tem¬ peraturze 27°C. Po uplywie 39 godzin od zaszcze¬ pienia komórki pozywki hodowlanej oddzielono 35 przez wirowanie i -przemyto buforem fosforano¬ wym (0,1 M, pH=5,6). ; Ze 100 ml pozywki hodowlanej otrzymano 0,-546 g suszonych komórek. Komórki oddzielone ze 100 5 ml pozywki zawieszono po lownie w 100 ml buforu fosforanowego (0,1 M, pH =5,6) i badano na akty¬ wnosc enzymatyczna; 1 g suszonych komórek za¬ wieral 9,4* 106 jednostek enzymatycznych.Przyklad III. Przygotowano srodowisko ho- 10 dowlane o nastepujacym skladzie: (NH4)2S04 — 5,00 g/1 MgS04-7H20 — 0,5 g/l Na2HPO4-12H20 — 4,6 g/l KH2P04 — 3,00 g/1 15 NaCl — 0,1 g/l CaCl2 — 0,05 g/l wyciag drozdzowy — 10 g/l glikoza — 10 g/l Melibioza — 1 g/l 20 Wymienione zwiazki rozpuszczono w odjonizo- wanej wodzie a nastepnie wartosc pH doprowa¬ dzono kwasem solnym do 5,3.Kultury szczepu Saccharomyces cerevisiae, var. oleaceus otrzymane w sposób opisany w przykla- 25 dzie I inkubowano podczas mieszania orbitalnego (180 obrotów na minute) w temperaturze 27°C.Po uplywie 43 godzin od zaszczepienia komórki pozywki hodowlanej oddzielano przez wirowanie i przemywano buforeim fosforanowym (0,1 M, 20 pH=5,6). Ze 100 ml pozywki hodowlanej otrzy¬ mano 0,594 g suszonych komórek.Komórki oddzielone ze 100 ml pozywki hodowla¬ nej zawieszano ponownie w 100 ml buforu fosfo¬ ranowego (0,1 M, pH=5,6) i badano na aktywnosc enzymatyczna; 1 g suszonych komórek zawieral 1,6-107 jednostek enzymatycznych.Przyklad IV. Przygotowano pozywke hodo¬ wlana o nastepujacym skladzie: 40 (NH4)2S04 — 5,00 g/1 MgS04-7H20 — 0,05 g/l Na2HP04-121^0 — 4,6 g/l KH2P04 — 3,0 g/1 NaCl — 0,1 g/l 45 CaCl2 — 0,05 g/l Wyoiag drozodzowy — 10,0 g/l glikoza — 5,0 g/l Melibioza — 5,0 g/l Wymienione zwiazki rozpuszczono w odjonizo- 50 wanej wodzie a nastepnie wartosc pH doprowa¬ dzono kwasem solnym do 5,3.Kultury Saccharomyces cerevisiae, var. oleaceus w takiej pozywce otrzymane w sposób opisany w przykladzie I inkubowano podczas mieszania 55 orbitalnego (180 obrotów na minute) w tempera¬ turze 29°C. Po uplywie 48 godzin od zaszczepienia komórki pozywki hodowlanej oddzielono przez wirowanie i przemywano buforem fosforanowym (0,1 M, pH=5,6). Ze 100 ml pozywki hodowla- 60 nej otrzymano 0,36-5 g suszonych komórek.Do 50 ml melas o 3i5° Brix zawierajacych 1,6% wagowych rafinozy w stosunku do calkowitej ilosci suchej masy dodano 6 ml pozywki hodowla¬ nej i wartosc pH doprowadzono do 5,2 stosujac « HgSC4. Obróbke prowadzono w temperaturze 40°C127 026 1 8 podczas mieszania w ciagu 16 godzin. Stezenie Zastrzezenie patentowe galaktozy, produktu hydrolizy rafinozy podczas Sposób wytwarzania enzymu alfa-galaktozydazy, reakcji, okreslano metoda Lactose (galastose UV- znamienny tym, ze prowadzi sie fermentacje, dro¬ zdzy rodzaju Saccharomyces cerevisiae, var. olea- Test Boehringer Mannheim GmbH. W podanych § cgqus NRRLy 12Q56 ,/lub SacchaMmyces cerevi_ warunkach otrzymano 153 mikromole galaktozy, co siae, Var. oleaceous NRRLY 12057 w zakresie jest równowazne hydrolizie 30% calkowitej ilosci ph 4—7 i w temperaturze zawartej pomiedzy 20°C obecnej w roztworzerafinozy. i40°C.LZGraf. Z-d Nr 2 — 388/85 80-h20 egz. A4 Cena 100 zl PL PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe galaktozy, produktu hydrolizy rafinozy podczas Sposób wytwarzania enzymu alfa-galaktozydazy, reakcji, okreslano metoda Lactose (galastose UV- znamienny tym, ze prowadzi sie fermentacje, dro¬ zdzy rodzaju Saccharomyces cerevisiae, var. olea- Test Boehringer Mannheim GmbH. W podanych § cgqus NRRLy 12Q56 ,/lub SacchaMmyces cerevi_ warunkach otrzymano 153 mikromole galaktozy, co siae, Var. oleaceous NRRLY 12057 w zakresie jest równowazne hydrolizie 30% calkowitej ilosci ph 4—7 i w temperaturze zawartej pomiedzy 20°C obecnej w roztworzerafinozy. i40°C. LZGraf. Z-d Nr 2 — 388/85 80-h20 egz. A4 Cena 100 zl PL PL PL PL PL