JPS62500422A - 熱安定性β−アミラ−ゼ - Google Patents
熱安定性β−アミラ−ゼInfo
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- JPS62500422A JPS62500422A JP60504245A JP50424585A JPS62500422A JP S62500422 A JPS62500422 A JP S62500422A JP 60504245 A JP60504245 A JP 60504245A JP 50424585 A JP50424585 A JP 50424585A JP S62500422 A JPS62500422 A JP S62500422A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
熱安定性β−アミラーゼ
技術分野
本発明は酵素に関する。より詳細には、本発明は熱安定性β−アミラーゼに関す
る。
背景技術
飲食品産業は澱粉をマルトース溶液へ転化するためにβ−アミラーゼ(E(1’
3.2.1.41)酵素を主に利用している。β−アミラーゼは澱粉型基質の非
還元性末端からα−1,47グルコシド結合をエキソ型で加水分解し、澱粉から
β−アノマー配置のマルトースとβ−限限界デスストリンの両物質を生産する。
多くの産業用途において使用されるβ−アミラーゼは植物白米のものである。
活性がより強く且つ熱安定性である細胞外酵素を微生物から得る試みがなされて
いるが、微生物白米の既知のβ−アミラーゼは植物由来のβ−アミラーゼの代替
物として使用するKは十分に活性でなくまた熱安定性でない。
それ故、植物β−アミラーゼは高価であり且つ比較的不安定であるにもかかわら
ず、マルトース生産のために使用され続けている。
最近産業界において興味のあるほんの少数の酵素が好熱嫌気性菌から単離され、
そして性状決定がなされた。
今日までに性状決定された好熱嫌気性菌由来の熱安定性活性酵素には、クロスト
リジウム サーモセラム(Clostridium thermocalllL
m)のエンドグルカナ−特表昭62−500422 (2)
(C,tharmohydrosulfurtCurn)のアルコールデヒドロ
axlfuroganga )のポリガラクツロネートヒドロリアーゼが含まれ
る。現在使用されているβ−アミラーゼよりも一層熱安定性のβ−アミラーゼを
提供することが明らかに望ましいであろう。
発明の開示
本発明の主な目的は、熱安定性β−アミラーゼならびに前記酵素の産生方法を提
供することである。
特異な熱安定性、熱活性β−アミラーゼを産生することを発見した。この酵素は
細胞外酵素であって、最適活性温度が75℃である。基質の不在下では70℃ま
で安定であり、また5%澱粉の存在下では80℃まで安定である。この酵素の最
適活性pHは約5,5〜約6.0である。
不発明のβ−アミラーゼは産業用途において使用するのに特に適していると思わ
れる。
本発明のβ−アミラーゼはC,サーモスルフロゲネスを必須ビタミン類、無機物
質および増殖因子を含む栄養培地中澱粉基質の存在下で嫌気的に実質的な酵素活
性が検出されるまで培養し、その後β−アミラーゼを単離することにより産生さ
れる。β−アミラーゼは細胞外に産生されるので細胞からの分離が簡単であり、
実質的に酵素活性を妨げるものを含まない精製された形で単離される。
物質および増殖因子を含む培地中澱粉基質の存在下で嫌気的に増殖させることに
より産生される。β−アミラーゼは実質的に酵素活性金妨げるものを含まない培
養上清から得られる。
β−アミラーゼ#素の調製pよび性状決定の詳細な説明は次の通りである。
微生物および培養:イエローストーン国立公園のオクトプス・スプリング(0c
top1Ls Spring)藻類−細菌マットからC,サーモスルフロゲネス
株+Ek単離し、トイチェ・ザムルツク・7オン・マイクロオーガニズメン(D
grbtscんg Sammlung van Mikroorganiarn
an) (DSM2229>およびアメリカン・タイプ・カルチャーaコlzク
ショ7 (Arn5rican T’tpg Cu1ture Collgct
i−on、メリーランド州ロックビル)(aTcC33743)の両方に寄託し
た。培地の調製および培養については緊縮(スl−リンジエント)嫌気的培養技
術を使用した。微生物は一般に0.5%グルコースまたは可溶性澱粉を含有する
TYE培地(24)lomjおよびN、−(1’0.(95:5)へッドス(−
スガスを収容した26117の嫌気耐圧試験管内において60℃で増殖させた。
好熱嫌気性菌の高度に耐熱性の胞子を確実に絶滅させるために、培地を45分間
加圧滅菌した。
ベトリ皿上で澱粉の加水分解反応を測足するために、嫌気チェンバー内で1.0
%可溶性澱粉および8.0%精製寒天を含有するTYEf@地の平板上に微生物
を塗り付けた。その平板を窒素下で無酸素塗料かんの中に置き、60℃で4日間
インキュベールた。平板を塗「畝ら取り出してヨウ葉液(1%!、および2%K
l含有水溶液)を注き゛、そして加水分解帯域を肉眼で観察した。
酵素のU4製:洗浄細胞およびアミラーゼ源としての培養上滑は、0.5%可溶
性澱粉を含有するTYE培地50mgを収容した血清バイアル内で上記菌株を培
養することにより調製した。その後定常期培養物を10分間12000xgで遠
心分離した。細胞懸濁物は20 mM酢酸ナト+Jウム緩衝液(pH6,0)で
2回洗い、次に緩衝液中に細胞を懸濁することにより調製した。濃縮細胞外アミ
ラーゼを!ll製するための大規模増殖は、ut−co、(95:5)下11.
0%マルトースおよび0,02%酵母エキスを含有するLPBB培地10JTh
収容した141の発酵槽において実施した。培養上清は後期指数期まで60℃で
増殖させた培養物から連続フロー遠心分離機を使って収集した。この上清(IO
J)は最初に2倍容量の冷エタノール(2(1)t−用いてタンパク質を沈殿さ
せ、次に活性炭粉末に通してp過して沈殿物を採取することにより濃縮し、その
後この沈殿物をZ OmM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6,0)300プに懸濁
し、硫酸アンモニウムな70%まで加えた。沈殿したタンパク質を15000x
、@で遠心分離し、その後上記緩@液100tjK懸濁した。
この懸濁液を再度遠心分離して不溶性物質を除き、次いで2倍容量の冷アセトン
全用いて沈殿させた。この最後の沈殿物全回じ緩衝filoOMに懸濁し、その
後この酵素溶液100m1を蒸留水(2回蒸留)4Jに対して24時間透析した
。
濃縮された上溝アミラーゼ静液の比活性は60単位/η(タンパク質)であった
。
上記方法と同じ方法を使って細胞抽出物を調製するために、細胞を大量培養して
収穫した。ただし、0.5%可溶性澱粉を補足したTYE培地を使用した。湿っ
た細胞イースト3gを20 mM酢酸ナトリウム緩衝ILXCpH6,0)12
.51Ltに懸濁することにより好気的に細胞抽出物をIIIJした。この懸濁
gtニワトリ卵白からのリゾチーム5■で37℃において1時間処理し、140
1?/i(200001b/in” )でフレンチ加圧容器に通すことにより破
壊した。4℃、30000Xgで30分遠心分離することにより上溝を回収し、
タンパク質濃度を測澱粉との反応によって放出される還元a!ヲ定量することに
より検定した。反応混合物(1a)は10%可溶性澱粉、0.5M酢酸ナトリウ
ム緩衝液(pH6,0) 1m、および適当に水で希釈した酵素浴g3Q−含ん
でい友。この反応は60℃で30分インキュベートした汲水で冷やすことにより
停止させた。
還元力はジニトロサリチル酸法を使って測定した。プルラナーゼ活性を検定する
ための反応混合物は0.2 M酢酸ナトリ9ム緩衝液(pH6,0)中2%プル
ラン0.51117および酵素溶液0.51から成っていた。60℃で30分イ
ンキュベートした後、水で冷却し且っ3,5−ジニトロサリチル酸4dを加える
ことにより反応を停止させた。
1単位のアミラーゼ、β−アミラーゼまたはプルラナーゼは上記条件下でグルコ
ース標準として1分あたり1aモルの還元糖を産生ずる酵素の量と定義される。
グルコアミラーゼ活性は1%可溶性澱粉、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(FH
4,8)および適当に希釈した酵素溶液を含有する反応混合物11Ltを60℃
で30分インキュベートすることにより検定した。この反応は氷で冷却し、次に
10分間蒸気浴中で沸騰させることによりすぐに停止させた。これらの反応混合
物を遠心して不溶性沈殿物を除き、その後放出され九グルコースをヘキソキナー
ゼ2よびグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ法により分析した。1単位の
グルコアミラーゼは上記検定条件下で1分あたり1aモルのグルコース標準生ず
る酵素の量と定義される。
位)を1%町浴性澱粉含有0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液(pHa)20m中
に加え、65℃でインキュベートした。、tit、科を時々取り出し、上記のよ
うにして還元糖およびグルコースの含有量を分析した。
澱粉加水分解物中のマルトースは高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によ
り同定した。分離装置はデータステーション、屈折率検出器および微小監視用予
備カラム(40x4.6n)を有するオリゴ糖分析カラム(300X7.8順)
を備えた液体クロマトグラフから構成されていた。澱粉加水分解物の試料は50
00 Xgで遠心して上記カラムに装填した(5M)。
混合物は酵素および0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH6,0)中0.25%
アミロース溶液を含み、この混合物を65℃でインキュベートした。試料(0,
5tj)を5分おきに取り出し、そして實価測定のために0.IMEC12ml
f含む試験管に加えた。混合後、Q、5Rtの試料を採取してヨウ葉液(1jあ
たりヨウ素Q、05g2よびヨウ化カリウム0.5g含有)5aに加えた。その
後、水−ヨウ素に対する吸光度を消去した分光光度計を使って620nmVCお
いて吸光度を測定した。青価は消化物の吸光度を基質−ヨウ素ブランクの吸光度
で割り% 100を掛けることにより計算した。反応混合物の別の0.5d試料
を還元価の測定のために採取した。還元力はネルソン比色冗量銅法により分析し
た。全炭水化物量はフェノール−硫酸法により検定した。
6.0)中1%澱粉溶液および酵素から成る反応混合物(5rlLt)を10c
fnのセルに加え九。旋光度はす) IJウム巌を用いる旋光計により室温で測
定した。旋光度が九′いたい一定値になったとき、約20qの固体炭酸ナトリウ
ムを加えてこの混合物の変旋元を測定した。
は先に述べた標準検定条件下で行った。安定性の実験は前記条件下において0.
1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH6,0)中の酵素俗g(約40単位/コ)を使
用した。
アミラーゼ活性の分布および型:予備実験において、ヨウB液で染色した澱粉寒
天平板上のコロニーのまわりに宵色の背景に対して赤っぽい色の大きな帯域が検
出された。この結果はC,サーモスルフロゲネスが澱粉を完全に加水分解し得な
いアミラーゼを産生ずることを示唆している。
旦、サーモスルフロゲネスのそれぞれ異なるアミラーゼ活性の細胞分布および型
を示す実験結果t−表1に要約する。この微生物は増殖期間中に細胞外アミラー
ゼ(この活性はβ−アミラーゼとして以下で分類されるだろう)全産生ずるが、
細胞外プルラナーゼまたはグルコアミラーゼを産生じなかった。さらに、細胞冗
漫グルコアミラーゼおよびアミラーゼが検出されたが%細胞定着プルラナーゼ活
性は検出されなかった。アミラーゼ2よびグルコアミラーゼのいずれの活性も好
気的検定条件によって阻害されなかった。
表1.C,サーモスルフ0ゲネス“における澱粉加水分解酵素の活性および細胞
分布
分布−一活性
アミラーゼ 好気的 5.5 0.07 0.26嫌気的 5.5 0.0?
0.26
プルラナーゼ 好気的 o、oo o、oo o、o。
嫌気的 o、oo o、oo o、o。
グルコアミラーゼ 好気的 0.00 0.02 0.0?嫌気的 0.0G
0.02 0.0?αC6t−モスルフロゲネスは炭素源として0.5%の可溶
性澱粉を含むTYII培地上で後期指数期まで増殖させた。
嫌気的検足条件は、#素溶液および全ての反応剤の+iua物中にジチオトレイ
トール(2mJ/)’i添加し且つN、ガスを供給することによりr4豆した。
細胞外アミラーゼによって生成された澱粉加水分解物のHPLC分析は、高分子
量オリゴ糖(すなわち限界デキストリン)の他にマルトースのみが検出可能な生
成物として産生されたことを示した。長期インキュベーションにもかかわらず、
澱粉加水分解物の足置分析によってグルコース以外の遺元糖のみが検出された。
マルトトリオースおよびマルトテトラオースの酵素的加水分解も研究された。0
.1Af6酸ナトジナトリウム緩衝液中1トテトラオースを1?単位の酵素と共
に65℃で3時間インキュベートした結果、マルトース(8In9/gV)のみ
が生成した。これらと同じ条件下でのマルトトリオース(1%)のfl!素的加
水分解はグルz−ス(Q、4rJv?/d )とマルトースの両方を生成した。
この酵素のアミロースに対する作用による還元力の放あることはこの酵素がエキ
ソ作用型アミラーゼであること金示している。変旋光の実験(対照としてα−ア
ミラーゼヲ使用)から%C,サーモスルフロゲネスi[Eによりて生成された澱
粉加水分解物に塩基を添加した際の旋光度の上方移行はこの加水分解産物がβ−
アノマー配置を有することを示している。上記データはC,サーモスルフロゲネ
スから単離された細胞外アミラーゼ活性がβ−アミラーゼであるという証拠を提
供した。
性に対する@腿の影響が測定された。この酵素活性のための最適温度は75℃で
あり、最大活性の85%が80 ℃において測定された。温度の逆数に対する比
活性のアレニウスプロット(Arrhenius proOを測定した場合(デ
ータは未表示)、β−アミラーゼに対するQ、。−僅は1.7と算出され九。
基質の不在下でのβ−アギラーゼの安定性に対する温度の影響についても測定さ
れた。この酵素は70cまで完全に安定であり、75℃で1時間処理した後にも
との活性の83%が依然として残っていた。この酵素は澱粉の不在下において8
0℃で2o分以内にほとんど完全に破壊されたが、酵素溶液に澱粉を添加すると
澱粉濃度に比例して熱安定性が非常に高められた。酵素は5%の澱粉の存在下に
おいて80℃で完全く安定であった。
β−アミラーゼの活性および安定性に対するpHの影響が測定された。最適活性
はpH5,5〜6.0で観察され、これよりもアルカリ側または酸側のpH値で
は活性が次第に低下した。最大活性の43%以上はpH2,5〜9.0の範囲で
検出された。この酵素は7)H8,5〜6.5の範囲で安定であったが、pH8
,0以下およびpH7,5以上で不安定であった。
スルフヒドリル試薬、金属イオンおよびシャルディンガーデキストリン(αおよ
びβ−シクロデキストリン)のβ−アミラーゼ活性に対する影響が試験された。
β−アミラーゼ活性はC,十+、 H,+十およびp−クロロメルクリ安息香酸
(PCMB)によって強く阻害されたが、過酸化水素、5.5’−ジチオビス−
2−二トロ安息香酸。
N−エチルマレイミド(NEM)、ヨード酢酸およびZn+十によって弱く阻害
された。これらの阻害はジチオトレイトール(10mM)の添加によって妨げら
れ且っもと通りになった。シャルディンガーデキストリンは予期に反して酵素活
性を阻害せず、且つβ−アミラーゼによって加水分解されなかった。使用した検
定粂件のもとで、#素活性は1〜30 mMのカルシクムイオンの添加によって
影響を受けなかった。
表2. β−アミラーゼ活性に対するスルフヒドリル試薬、金属イオンおよびシ
ャルディンガーデキストリンの影響
過酸化水素−198
N−エチルマレイミド(NEW)−193ヨード酢酸(7A)−1100
p−りooメルクリ安息香lff−0,020,2(PCMB) 0.1 0.
0
CuC1t 1 1.8
HfCl* 1 0.0
ZnCl*−193
CaC11−5100
α−シクロデキストリン−10100
β−シクロデキストリン−10100
a 100%活性は標準検定条件下で24.4単位/In?(タンパク質)に相
当する。
酵素活性および安定性に対するエタノールの影響についても試験され、β−アミ
ラーゼ活性は3%(容量/谷t)エタノールの存在下で顕著に影響されな力)つ
たが、3%(容量/容ff1)以上ではエタノールの濃度に比例して徐々に低下
した。10%(容1に/容りエタノールの存在下において最大活性の65%が観
察された。この結果はエタノールによる#扮基質の沈殿が原因であると考えられ
る。なぜならβ−アミラーゼはI#素活性の分析以前では10%(容量/容量)
エタノールの存在下において65℃で1時間完全に安定であつ次からである。
スに関するβ−アンラーゼの見掛の反応速#L足数(kinsバCconsta
nt )が虫取物形成速度対時間の曲線を測定することによって決定ざnた。酵
素による加水分解速度の基質濃度への依存はミカエリス−メンテンの反応速度論
に従うことが立証され 3/、対/〔5〕の直llI!!関係が得られた。
澱粉対アミロースに関するβ−アミラーゼの見掛のCff)。、YおよびVつ、
は、二重逆数から測定した場合。
それぞれ1〜/ゴ2よび60U/Ingcタンパク質)対1、671ng/mj
Dヨび30 U/ 1n9(17ハク’It ) テアツft:、。
一般に、前記のデータはC,サーモスルフ0ゲネスが細胞冗漫グルコアミラーゼ
活性と細胞外β−アミラーゼ活性を生ずることtX証している。β−アミラーゼ
は澱粉■人間62−500422(5)
上での増殖期間中に一次代謝産物として高収量で産生される。このβ−アミラー
ゼは高熱安定性を有してh−リ、それ故醸造2よび澱粉加工において産業上利用
するのに適している。
この細胞外アミラーゼは確かな基準に基づいてβ−アミラーゼとして分類された
。この酵素の澱粉に対する作用は高分子量の限界デキストリンのほかに検出可能
な産物としてマルトースのみを生成し、グルコースやその他のマルトサツカライ
ド類は生成しなかった。マルトテトラオースの加水分解はマルトースのみを生じ
、マルトトリオースの加水分解はグルコースとマルトースを生じた。
このexはプルラン、庶糖、セロビオース、トレノ10−ス、シャルデインガー
デキストリンおよびマルトースに対して不活性であった。アミロースの加水分解
の際のヨウ素染色能の低下が比較的小さいのに対して還元力の放出が大きいこと
、ならびにアルカリを添加した際の澱粉消化物の旋光度が上方に移行することは
、この酵素がエキン型で作用してβ−アノマー配置のマルトースを生成生物由来
のβ−アミラーゼの作用パターンと類似していた。
本発明のβ−アミラーゼは、その新規な性質ゆえに、澱粉から種々の糖溶液また
はアルコール類を生産する際の産業上の用途を有している。この酵素は細胞外の
一次代謝産物であり、高温において活性かつ安定である。この酵素は酵素活性の
ための最高温度が高く(75℃)、基質の存在下では80’Cまで安定である。
β−アミラーゼはまた広いpH@囲において活性かつ安定である。それは酸性範
囲に最適活性(pH5,5〜6.0)および安定性(pHa、5〜6.5)を有
し、このことは最適活性をよび安定性が中性pH付近である他の大部分のβ−ア
ミラーゼと相違している。このβ−アミラーゼはほとんど同じpH2よび温度範
囲において活性であるプルラナーゼと共に使用して、マルトースシロップを生産
するという新規な用途を有するかも知れ々い。
高等植物および微生物に由来するβ−アミラーゼはスルフヒドリル酵素であり、
スルフヒドリル試薬または醒王白米ノβ−アミラーゼもまたスルフヒドリル試薬
(すなわちPCMB、NICK)によって失活することを示している。しかしな
がら、この阻害は還元剤(ジチオトレイトール)の添加によって妨げられ且つち
と通りに回復できた。また、金属イオン(例えばC1L++、 H,−+→およ
びp 、士士)もこのβ−アミラーゼを阻害した。しかし、他のβ−アミラーゼ
(5,6)の拮抗阻害剤であることが知られているシャルデインガーデキストリ
/はC,V 二モスルフロゲネス由来のβ−アミラーゼ乞阻害しなかった。
本発明β−アミラーゼの活性および安定性は、この菌種の増殖がエタノールに対
して非常に感じやすかった(すなわち、2%のエタノールの存在下で増殖できな
かった)にもかかわらず、エタノールによってほとんど影響を受けなかった。
当分野で習熟した者は、β−アミラーゼの生産性が微生物の突然変異を通して、
または遺伝子組換え技術によれるものと類似の熱安定性β−アミラーゼを産生し
つる微生物はどれも使用可能であるので、不発明の範囲は上記の微生物の特定菌
株に限定されるべきでない。
前述のことを考照して、本発明は上記の特定の6様のいずれかによって限定され
るべきでなく、次の請求の範囲にまってのみ限定されると理解すべきである。
国際調査報告
Claims (7)
- (1)サツカリダーゼ酵素活性を妨害するものを実質的に含まない、微生物クロ ストリジウムサーモスルフロゲネス(Clostridium thermos ulfurogenes)から得られる熱安定性のβ−アミラーゼ。
- (2)熱安定性β−アミラーゼの産生のためのクロストリジウムサーモスルフロ ゲネスの使用。
- (3)澱粉からマルトースを生産するための請求の範囲第1項記載のβ−アミラ ーゼの使用。
- (4)澱粉からアルコールを生産するための請求の範囲第1項記載のβ−アミラ ーゼの使用。
- (5)最適活性温度が約75℃であり、基質の不在下において70℃まで安定で あり且つ基質の存在下において80℃まで安定であり、最適活性pHが約5.5 〜約6.0であり、そして約8.5〜約6.5のpH範囲において安定である熱 安定性β−アミラーゼ。
- (6)栄養培地でβ−アミラーゼ産生性クロストリジウムサーモスルフロゲネス を、実質的な酵素活性が検出できるまで嫌気的に培養し、その後熱安定性β−ア ミラーゼを単離することから成る熱安定性β−アミラーゼの産生方法。
- (7)次の物理化学的性質: (イ)反応性:澱粉を加水分解する場合にマルトースと限界デキストリンのみを 生成する; (ロ)基質特異性:澱粉またはマルトテトラオースからマルトースのみを生成し 、そしてマルトトリオースからグルコースとマルトースを生成する; (ハ)最適pH値:約5.5〜約6.0;(ニ)pH安定性:約3.5〜約6. 5のpHで安定;(ホ)最適温度:75℃、80℃で最大活性の85%;(ハ) 温度安定性:基質の不在下で70℃まで安定であり且つ5%澱粉の存在下で80 ℃まで安定である;(ト)阻害剤の影響:β−アミラーゼ活性は金属イオン(C u++およびHg++)およびp−クロロメルクリ安息香酸によつて阻害される が、カルシウムイオン、シヤルディンガーデキストリンまたはエタノールによつ て阻害されない; を有する熱安足性β−アミラーゼ。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/652,585 US4647538A (en) | 1984-09-18 | 1984-09-18 | Thermostable beta-amylase |
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