DD157564A5 - Verfahren zur bildung des enzyms alpha-galactoxidase und zur hydrolyse von raffinose unter verwendung dieses enzyms - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung von alpha-Galactoxidase-Enzym durch Zuechtung von Hefen der Gattung Saccharomyces cerevisiae bei einer Temperatur von 20 bis 40Grad C. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Raffinose durch alpha-Galactoxidase von Saccharomyces cerivisiae.Eine solche Hydrolyse kann stattfinden in Gegenwart von Hefezellen oder auch in Gegenwart von Enzymextrakten als solchen oder angereichert. Ein wichtiger Vorteil des erfindungsgemaessen Verfahrens liegt in der hohen alpha-Galactoxidase-Aktivitaet der ausgewaehlten Mikroorganismen zusammen mit der Abwesenheit etwaiger Invertaseaktivitaet.
Description
Berlin, den 25. 5. 1981 G 12 P/ 227 378/1 58 727 18
Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Raffinose
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hydrolyse von Raffinose unter Verwendung des <X -Galactoxidase-Enzyms (E.C. 3.2.1.2.2·)·
Raffinose, ein Trisaccharid, das in deutlichen Mengen in Zuckerrüben vorkommt, hindert die Kristallisation von Saccharose. Dadurch werden die bei der Extraktion erzielten Ausbeuten gering. Diese Tatsache stellt ein ernstes wirtschaftliches Problem bei der Zuckerfabrikation dar, so daß die Hydrolyse von Raffinose zwingend notwendig wird, um sowohl die Qualität als auch die Y/irksamkeit des Verfahrens bei der Kristallisation des extrahierten Zuckers zu verbessern. ·
In vielen Veröffentlichungen sind enzymatisch^ Verfahren zur Hydrolysierung von Raffinose beschrieben, bei denen Enzyme angewandt werden, die extrahiert worden sind von einer Anzahl von Arten der Mikroorganismen der Gattungen Absidia, Aspergillus, Bacillus, Circinella, Escherichia, Microsoccus, Mortierella, Penicillium u.a.
Der bei der Züchtung vieler Mikroorganismen erhaltene Zellextrakt enthält jedoch nicht nur Ot-Galactoxidase, sondern
-2~ 25*5.1981
C 12 P/22? 378/1 (58 727 /18)
auch Invertase, so daß bei der Behandlung von Zuckerrüben«-» Melasse die Hydrolyse von Raffinose in ungünstiger Weise begleitet viird von der Hydrolyse der Saccharose*
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Bildung von ob -Galactoxidase-Enzym für die "Anwendung zur Hydrolyse von Raffinose und insbesondere zur Verbesserung der Qualität und Ausbeute des kristallisierten Zuckers*
Darlegung des Wesens dea? Erfindung .
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mikroorganismen aufzufinden, die eine hohe u> -Galactoxidase~Aktivitat, jedoch keine Invertase~Aktivität besitzen,.
Erf indungsgemäß Tsird das Verfahren zur Bildung von Oj ~Galac~ toxidase-Enzym verbessert durch Fermentation einer Hefe der Gattung Saccharomyces cerevisiae bei einem pH-Wert im Bereich von '4 bis 7 und einer Temperatur zwischen 20 und 40 0GV
Das erfindungsgemäß erhaltene $ ~Galactoxidase-»Enzym wird angewandt zur enzymatischen Hydrolyse von Eaffinoseö Insbe« sondere vsird erfindungsgemäß die Eeaktion in Gegenwart von Zellen, Snzymextrakten und/oder angereicherten Enzymextrakten von Hefen der Gattung Saccharomyces cerevisiae oder in Gegenwart von immobilisierten Enzymen oder Zellen durchge« führt« ·
737
-3- 25.5.1981
C 12 P/227 378/1 (58 727 / 18)
Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin·, daß die erfindungsgemäß ausgewählten Mikroorganismen,. die zu der Gattung Saccharomyces gehören, in günstiger V/eise den Vorteil einer verringerten Züchtungszeit, verglichen mit Schimmelpilzen, verbinden mit der Eigenschaft, daß sie eine hohe 4- -Galactoxidase-Aktivitäty jedoch keine Invertase-Aktivität besitzen.
-Diese Mikroorganismen, die aus dem Abwasser von Olivenölmühlen im bereich von Monterotondο (Rom, Italien) isoliert worden sind, wurden klassifiziert als Saccharomyces cerevisiae, var· oleaceous und Saccharomyces cerevisiae, var» oleaginosus und wurden beim Northern Regional Center of the US Department of Agriculture, Peoria, 111., hinterlegt, wo sie die Nummern NRRL Y 12056 und NRRL Y 12057 erhielten.
Ihre Kultuao, morphologischen und physiologischen Charakterist ika sind im folgenden angegeben:
A,' Kult ur°-Charakterist ika
1. Festes Medium (3 Tage): Malzagar Die Kolonien sind butterartig, cremefarben und glänzende
2» Flüssiges Medium (3 Tage): Malzextrakt Es bildet sich ein Sediment (bei S, cerevisiae, vare oleaginosus wird ein schwacher Ring beobachtet)»
25.5*1981
C 12 P/227 378/1
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Morphologische^Cbarakteristika
1„ Charakteristik der vegetativen Zellen:
Die Zellen sind ellipsoid, zylindrisch und manchmal länglich»
2e Bildung von Pseudomyzel oder echtem Myzel:
Unter anaeroben Bedingungen ist ein rudimentäres Pseudomyz«l vorhanden,,
Sexual-Gharakterist ika
Die vegetativen Zellen werden direkt in Asci umge- ' •wandelt, die 1 bis 4 spheroide Sporen enthalten.
Physiologische-Charakteristika .
1, Verwertung von Kohlenstoffquellen:
a) Fermentation:
Spcerev.isiae S«cerevisiae var^oleace.us var.oleaginosus
Glucose . + +
Galactose — +
Maltose . - +
Thraalose - -
Melibiose + +
Eaffinose — +
»7378
25,5.1981
C 12 Ρ/227 378/1
(58 727 / 18)
b) Assimilation:
S,cerevisiae var.oleaceus
SiCerevisiae varcOleaginosus
Glucose + +
Galactose + +
Maltose -· +
Threalose + +
Melibiose + +
Raffinose + +
D-Mannit +
D-Sorbit . +
Äthanol 4· +
Glycerin + +
DL-Milchsäure + -
Die anderen Kohlenstoffverbindungen werden nicht assimiliert. -
2« Assimilation von Stickstoffverbindungen: Kaliumnitrat: negativ
3. Wachstum bei.37 0C: positiv
Bei der Klassifizierung wurde dem Schema von J, Pe Van der Walt in "The Yeasts", 2. Auflage, herausgegeben von J* Lodder, gefolgt.
Die Kulturen der Stämme, die unter die Erfindung fallen, können nach irgendeinem bekannten Verfahren unter aeroben Bedingungen hergestellt werden, z, B, als Oberflächenkulturen oder vorzugsweise als Submers-Kulturen in einem Rührfermentor«
-6- 25*5.1981
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Bin Kulturmedium, das entweder fest oder flüssig sein kanns enthält eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Quelle für Stickstoff und Mineralsalze«
Als Kohlenstoffquellen können Glucose, Melibiose, Eaffinose sowie andere Zucker, Glycerin und Natriumacetat angewandt werdene
Als Stickstoffquellen können anorganische und organische Stickstoffverbindungen wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Tripton, Aminosäuren, Gaseinhydrolysate, So-jabohnenmehl und Ammoniumsalze angewandt werden»
Ein anderer bedeutender Vorteil, der durch die Anwendung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen erzielt "'werden kann, ist die Tatsache, daß das Enzym gebildet wird, wenn die Mikroorganismen auf Glucose gezüchtet werden (das Enzym ist konstitutiv)*
Ein geeignetes Kulturmedium besitzt ze B0 die folgende Zusammensetzung;
Hefeextrakt ' 5 bis 20 g/l
Glucose 10 g/l
Spuren von
24 4 4)2SO4 1 g/l
Der pH-Wert für die Kultur liegt bei 4 bis 7 und vorzugsweise bei 5,0 bis 5,5 und die Temperatur zwischen 20 0C und 4-0 0C, vorzugsweise zwischen 25 °0 und 28 0C9
2737
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Die Enzymproduktion kann erhöht werden durch Zusatz kleiner Mengen an Melibiose, die bekanntlich das Disaccharid ist, das durch teilweise Hydrolyse von Raffinose entsteht, Melibiose kann direkt zu dem Kulturmedium vor dem Inokulum zugesetzt werden oder nachdem die logarithmische Wachsturnsstufe vorüber ist. Die Induktionszeit kann von 16 Stunden bis zu 72 Stunden variieren und beträgt vorzugsweise zwischen 40 Stunden und 4-8 Stundene
Die während der Fermentation oder nach deren Abschluß gewonnenen Zellen können als solche oder in Form eines trockenen Pulvers verwendet werden» Wahlweise können auch rohe oder gereinigte Extrakte solcher Zellen angewandt
Hierzu werden die Zellen nach irgend einem bekannten Verfahren aufgebrochen und der enzymhalt ige rohe oder gereinigte Extrakt wird angewandt, ·
Letztlich kann eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung erreicht werden durch Immobilisierung der Enzyme, indem man sie mit makromolekularen Verbindungen zusammenbringt unter Ausbildung chemischer Bindungen mit' der Matrix oder durch, ionische ^indungen oder auch durch physikalische Immobilisierung des Enzyms oder der Zellen*
Die so erhaltenen Zellen werden als solche oder immobilisiert zu einem Reaktionsgemisch zugegeben, das Melasse enthält, bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 7 und bei einer Temperatur von 30 bis 60 0C* Die in der Melasse enthaltene Raffinose w.ird so zu Galactose'und Saccharose hydrolysiert, wodurch die Ausbeute an der zuletzt genannten Verbindung verbessert wird. . .
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Ausführungsbeisρi e1
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläuterte
Es wird eine Kulturbrühe der folgenden Zusammensetzung her~ 'gestellt?
| (NH4)2&04 | 5 | g/1 |
| MgSO4,, 7H2O | 5 | g/1 |
| Na0HPO,.12Ho0 | 4,6 | g/1 |
| 3 | g/1 | |
| NaCl | 0,1 | g/1 |
| CaCI2 | 0,05 | s/i |
| Hefe extrakt | 10 | g/1 |
| Melibiose | 10 | g/1 |
Diese Verbindungen werden in entionisiertem Wasser gelöst und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3»5 angesäuert»
Das so erhaltene Kulturmedium wurde in 250-ml-Weithals~Erlenmayer-Kolben verteilt (100 ml Kulturbrühe pro Kolben, 30 Minuten bei 116 0C sterilisiert)« Die Kolben wurden mit 1 ml einer Kultur des Stammes Saccharpmyces cerevisiae, var»olea~ ceus in 250 ml Kolben, enthaltend 50 ml der gleichen Kulturbrühe, beimpft und das Wachstum bei 25 0G 16 Stunden unter Rühren .(180!UpM) durchgeführte
Die Fermentationskolben wurden unter Rühren (180 UpM) bei 25 0C inkübiert« .
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Stunden nach der Beimpfung wurden die Zellen der in der Brühe gewachsenen Kulturen abzentrifugiert und mit Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) gewaschen« Aus 100 ml Kulturbrühe erhielt man 0,55 g getrocknete Zellen«,
Die aus 100 ml Kulturbrühe gewonnenen feuchten Zellen wurden erneut in 100 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) aufgeschlämmt und die Enzymaktivität bestimmt, Bin Gramm der getrockneten
Zellen enthielt ungefähr 1*10' Enzymeinheiten· Die Enzymaktivität wurde nach dem folgenden Verfahren gemessen:
Zu einem ml der gepufferten Zellaufschlämmung wurden 4 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) und wenige Tropfen Toluol zum Aufbrechen der Zellwände gegeben. Nach "H1? Minuten langer Inkubation unter Rühren bei 40 0C wurde die Aufschlämmung mit 10 ml einer 1%igen Lösung (Gew./Vol.) Melibiose in Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) ergänzt«
Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 40 0C unter Rühren im Wasserbad inkubiert und die Reaktion durch 15 Minuten langes Erhitzen abgebrochen und von dem Reaktionsgemisch wurden Proben entnommene
Die Konzentration an Glucose, wie sie durch Hydrolyse von Melibiose während der Reaktion entsteht, wurde nach der kalorimetrischen GOD-Perid-Methode von Boehringer Mannheim GmbH bestimmt.
Die optische Dichte der gefärbten Proben wurde bei Raumtemperatur in einem Perkin-Elmer Coleman 55 Spectrophotometer, optischer Weg in dem Schiffchen gleich 0,1 dm bei einer Wellenlänge von 436 nm gemessene
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Wenn man als eine Einheit die Enzymmenge definiert, die 1 ,Ug Glucose in 2 Stunden unter den oben angegebenen Untersuchungsbedingungen bildet, können die Enzymeinheiten pro Gramm trockener Zellen nach der folgenden Formel berechnet werden:
(ß
2h~B0h'
18,2 · 15
100
Gramm getrockneter Zellen
B2
E,
Oh -
Standard =
C s
^Standard * v optische Dichte der Probe nach 2 Stunden optische Dichte der Probe nach 0 Stunden optische Dichte einer Standard-Glucose-* lösung, enthaltend 18,2 ,ug Gluxose pro Millimeter
Gewicht der trockenen Zellen in 100 ml Kulturbrühe in Gramm
ispiel 2
Es wurde eine Kulturbrühe der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
12H2O
KH0PO,, NaCl
CaCl2 Hefeextrakt
Glucose
| 5 | g/l |
| 0,5 | g/l |
| 4,6 | g/l |
| 3 | g/l |
| 0,1 | g/l |
| 0,05 | g/l |
| 10 . | g/l |
| 10 | g/l |
Diese Verbindungen wurden in ent ionisiertem Wasser gelöst und
•-11- . . 25.5.1981
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der pH-Wert dann mit Salzsäure auf 5,3 eingestellt,
Kulturen des Stammes Saccharomyces cerevisiae, var»oleaceus, die entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden unter Rührei (Orbital, 180 UpM) in dieser Brühe bei 27 0C inkubierte ·
39 Stunden nach dem Beimpfen wurden die Zellen von der Kulturbrühe abzentrifugiert und mit Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) gewaschene
Aus 100 ml Kulturbrühe erhielt man 0,546 g trockene Zellen» Die aus 100 ml Brühe gewonnenen Zellen wurden erneut in 100 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) aufgeschlämmt und die Enzymaktivität bestimmt: 1 g trockene Zellen enthielt 9,4 · 10 Enzymeinheiten,
Es wurde ein Kulturmedium in der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
| (NH4)^O4 | 5,00 | g/l |
| MgS04»7H20 | 0,5 | g/l |
| Na2HPO4,12H2O . | 4,6 | g/i |
| KH2PO4 | 3,00 | g/i |
| NaCl | 0,1 | g/l |
| CaCl2 | 0,05 | g/l |
| Hefe extrakt | 10 . | g/l |
| Glucose | 10 | g/l |
| Melibiose | 1 | g/l |
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C 12 P/227 378/1
(58 727 / 18)
Die oben angegebenen Verbindungen wurden in ent ionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,3 eingestellte
Kulturen des Stammes Saccharomyces cerevisiae, vareoleaceus, die entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden unter Orbitalrühren (180 UpM) bei 27 0C inkubiert, 43 Stunden nach dem Beimpfen wurden die Zellen von der Kulturbrühe abzentrifugiert und mit Phosphatpuffer (0,1 ra, pH 5,6) gewascheno Aus 100 ml Kulturbrühe erhielt man 0,594 g trockene Zellen©
Die aus 100 ml Kulturbrühe gewonnenen Zellen wurden in 100.ral Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5,6) aufgeschlämmt und die Enzym-»
aktivität bestimmt: 1g trockene Zellen enthielt 1,6 · 10' Enzyme inheiten«,
| Es wurde ein Kulturmed | ium der folgenden Zusammensetzung her- |
| gestellt: | |
| (NH4)2SO4 | 5,00 g/l ' |
| 0,05-g/i | |
| HaHPO4*. 12H2O | 4,6 g/l |
| KH2PO4 | . 3,0 g/l |
| NaCl | 0,1 g/l |
| CaCl2 | 0,05 g/i |
| Hefe extrakt | 10,0 g/l |
| Glucose | 5,0 g/l |
| Melib lose | 5,0 g/l |
C 12 Ρ/227 378/1 (58 727 / 18)
Die oben angegebenen Verbindungen wurden in ent ionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit Salzsäure auf 5S3 eingestellt«
Kulturen von Saccharomyces cerevisiae, var,oleaceus, die wie in Beispiel 1 angegeben hergestellt worden waren, wurden in einer solchen Brühe unter Orbitalrühren (180 UpM) bei 29 0C inkubiert, 48 Stunden nach dem Beimpfen der Kulturbrühe wurden die Zellen abzentrifugiert und mit Phosphatpuffer (0,1 m, pH 5»6) gewaschen. Aus 100 ml Kulturbrühe erhielt man 0,365 g trockene Zellen.
6 ml der Kulturbrühe -wurden zu 50 ml, 35° Brix-Melasse, ent- " · haltend 1,6 Gew.~% Raffinose, bezogen auf die Gesamtfeststoffe, gegeben und das Gemisch mit HpSO^, auf einen pH-Wert von 5»2 eingestellt. Die Behandlung wurde 16 h unter Rühren bei 40 0C durchgeführt. Die Konzentration an Galactose, die während der Reaktion durch Hydrolyse von Eaffinose entsteht, wurde nach der Methode Laetöse/Galactose UV-Test von Boehringer Mannheim GmbH bestimmt. Unter den oben -angegebenen Bedingungen wurden 153 /Umol Galactose, entsprechend der Hydrolyse von 30 % der gesamten vorhandenen Raffinose, gebildet.
Claims (1)
- 25. 5. 1981G 12 P/ 227 378/158 727 18 - 14.-Verfahren zxr enzymatischen Hydrolyse von Raffino.se, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktion in Gegenwart von Zellen, Enzymextrakten und/oder angereicherten Enzymertrakten von Hefen der Gattung Saccharomyces cerevisiae oder in Gegenwart von immobilisierten Enzymen oder Zellen durchgeführt wird.
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