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Beschreibung
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Ameisensäure
aus Methanol.
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Es ist gut bekannt, daß Formaldehyd unter Katalyse durch Alkohol-Oxidase
und Katalase von Methanol-assimilierenden Hefen aus Methanol gebildet wird (Biotechnol.
Bioeng. 20 (1978), 333 bis 348). Diese Rekation verläuft gemäß den folgenden Reaktionsgleichungen:
CH3OH + 2 = HCHO + H 202 (Reaktion durch Alkohol-Oxidase) H202 = H20 + 1/2 O2 (Reaktion
durch Katalase) CH3OH + 1/2 02 = HCHO + 20 (Gesamtreaktion) Wenn diese Reaktion
in technischem Maßstab durchgeführt wird, ergibt sich jedoch ein Problem dadurch,
daß die A1-kohol-Oxidase durch den gebildeten Formaldehyd deaktiviert wird. Der
als Zwischenprodukt gebildete Formaldehyd muß kontinuierlich aus dem Reaktionssystem
entfernt oder in eine andere geeignete Substanz umgewandelt werden, die die enzymatische
Reaktion nicht inhibiert.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein einstufiges
Verfahren zur Herstellung von Ameisensäure aus Methanol anzugeben, welches das Produkt
mit höherer Ausbeute ohne die Zugabe irgendeines Coenzyms liefert.
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Diese Aufgabe wird nun gelöst durch das Verfahren gemäß Hauptanspruch.
Die Unteransprüche betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes.
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Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Ameisensäure
aus Methanol, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Methanol durch Einwirkung
von Alkohol-Oxidase, Katalase und Formaldehyd-Dismutase in Gegenwart von Sauerstoff
in Ameisensäure umwandelt.
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Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Enzyme Alkohol-Oxidase
und Katalase werden im allgemeinen aus einer Methanol-assimilierenden Hefe, beispielsweise
Hansenula polymorpha CBS (Central Bureau voor Schimmelcultures) 4732, gewonnen.
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Die taxonomischen Eigenschaften von Hansenula polymorpha CBS 4732
sind in "The Yeasts" von J. Lodder, 2. Auflage (1970), Seiten 296 bis 299 beschrieben
worden.
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Typische Beispiele für andere erfügbare Hefen sind Kloeckera sp. und
Candida boidinii (welche beide in dem European Journal of Biochemistry 64 (1976),
341 bis 350 beschrieben worden sind).
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Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Formaldehyd-Dismutase
(Formaldehyd-dismutierendes Enzym) ist ein Enzym, welches die Oxidation und Reduktion
von Formaldehyden chne die Zugabe irgendeines Coenzyms katalysiert und beispielsweise
aus einem neuen Stamm gewonnen wird, nämlich Pseudomonas putida F61, der unter der
Nummer FIRM No. 7165 bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial
Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, hinterlegt
worden ist.
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Die taxonomischen Eigenschaften dieses Stammes Pseudomonas putida
F61 sind im folgenden angegeben.
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I. Primäre Primäre Morphologie und Physiologie nach dem Züchten des
Mikroorganismus in einem Oxoic3-CM3-Medium bei 30°C.
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Form: stäbchenförmig Gram-Reaktion: -Sporen: -Motilität: + Aussehen
der Kolonie: hellgelb, rund, undurchsichtig, kreisförmig, glänzend, leicht konkav,
Durchmesser nach 24 Stunden etwa 0,5 mm.
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Wachstumstemperatur: CC + 37°C + 41°C -45°C -Katalase: + Oxidase:
-O-F-Test: O Identifizierung: Gramnegative Reaktion Zucker-Zersetzung durch Oxidation
II. Sekundäre Identifiiierumq Pyocyanin: Fluoreszenz: + DL-Arginin: + Betaine: +
Glucose: + Lactat: + Acetat: + Penicillin G: Streptomycin: Chloramphenicol: Tetracyclin:
++
Novobiocin: Polymyxin B: ++ 0/129: Levan: Notwendiger Wachstumsfaktor:
-Gas aus Glucose: Säure aus Glucose: + ONPG: Arginin-Hydrogenase: + Lysin-Decarboxylase:
Ornithin-Decarboxylase: -Nitratreduktion zu Nitrit: -Nitratreduktion zu Stickstoff:
-Desoxyribonucleae: Gelatine-Stichkultur: -Gelatine-Plattenkultur: -Casein-Hydrolyse:
Stärke-Hydrolyse: Eigelb-Reaktion: Lipase: NH3: + Indol: Hydrolyse von "Tween 80":
-Aufgrund der oben beschriebenen Eigenschaften wurde dieser Stamm als Pseudomonas
putida identifiziert. Bezüglich seiner Identifizierung wurde auf (i) Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology, 8. Auflage (1974) und (ii) Cowan et al.'s Manual
for Identification of Medical Bacteria (1974) Bezug genommen.
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Die zur Züchtung dieses Mikroorganismus notwendigen Nährstoffe sind
nicht besonders beschränkt, so daß die für übliche Mikroorganismen eingesetzten
Nährstoffe verwendet werden können. Beispielsweise können Glucose, Saccharose, Fructose,
Glycerin, Sorbit, Melassen, Stärkehydrolysat-
Kohlenhydrate, organische
Säuren wie Essigsäure, Fumarsäure etc. als Kohlenstoffquellen verwendet werden.
Als Stickstoffquellen können Nitratsalze, Ammoniumsalze, Maisquellwasser, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Hefepulver, Sojabohnenhydrolysatflüssigkeit, Baumwollsamenpulver,
Polypepton, Pepton etc. verwendet werden. Als anorganische Salze sind Kaliumphosphat,
Natriumphosphat, Magnesiumsulfat und Natriumchlorid geeignet.
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Die Inkubationstemperatur liegt im Bereich von 20 bis 400C und vorzugsweise
im Bereich von 25 bis 37"C. Im allgemeinen werden die Mikroorganismen aerob während
16 bis 72 Stunden gezüchtet.
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Die gebildete Formaldehyd-Dismutase liegt in den Mikroorganismenzellen
vor. Die aus der Kulturbrühe gewonnenen Mikroorganismenzellen können als solche
verwendet werden.
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Natürlich kann man die Formaldehyd-Dismutase nach der üblichen Abtrennung
und Reinigung verwenden, beispielsweise durch Behandlung mit Ultraschallwellen,
Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration
etc.
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Hierzu werden die aus der Kulturbrühe durch Zentrifugieren geernteten
Mikroorganismenzellen mechanisch, beispielsweise durch Behandlung mit Ultraschallwellen,
Homogenisieren, Verreiben mit Glaskügelchen, etc. oder chemisch, beispielsweise
durch Auflösen der Zellwände mit Enzymen etc. aufgebrochen, wonach die überstehende
Flüssigkeit gewonnen wird. Die überstehende Flüssigkeit wird beispielsweise durch
eine Kombination aus Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Ionenaustauschchromatographie
mit "DEAE-Sephacell", durch Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Hydroxyappatit,
durch Gelchromatographie unter Verwendung von "Sephacryl", "Sephadex", etc. oder
durch Hydrophobiechromatographie über Phenylchlorsepharose etc. gereinigt.
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Die Eigenschaften des gereinigten Enzyms sind die folgenden: i) Molekulargewicht:
2,2 x 105 (Gelfiltration) (5,5 x 104 vier Untereinheiten) ii) Isoelektrischer Punkt:
pH 4,8 iii) Optimaler pH-Wert: 8,0 iv) Optimale Temperatur: 400C v) Das Wachstum
wird durch HgC12, p-lhlorquecksilberbenzoat, Iodessigsäure, Zn, Cu und Fe inhibiert.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Methanol in Gegenwart der
oben angesprochenen Enzyme Alkohol-Oxidase, Katalase und Formaldehyd-Dismutase umgesetzt.
Die Reakton wird bei einem pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 9,5, vorzugsweise im Bereich
von 7 bis 9, in einer üblicherweise verwendeten Pufferlösung, wie einer Kaliumphosphatlösung,
durchgeführt.
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Die oben erwähnten Enzyme können nicht nur in gereinigter Form, sondern
auch in Form von ruhenden oder wachsenden Mikrobenzellen, in immobilisiertem Zustand
und in Form eines zellfreien Extrakts etc. eingesetzt werden. Die Reaktionstemperatur
liegt im allgemeinen im Bereich von 10 bis 450C und vorzugsweise im Bereich von
30 bis 40"C.
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Die Reaktionszeit variiert mit der Menge der eingesetzten Formaldehyd-Dismutase
und der anderen Enzyme (wobei im allgemeinen 0,01 bis 10 Einheiten eingesetzt werden),
der Art und der Konzentration des verwendeten Substrats und der Reaktionstemperatur,
wenngleich im allgemeinen eine Reaktionszeit im Bereich von 10 Minuten bei 100 Stunden
und bevorzugter im Bereich von 30 Minuten bis 48 Stunden angewandt wird. Die Konzentration
des als Substrat verwendeten Methanols liegt im Bereich von 1 mMol
bis
mehreren Molen.
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Sauerstoff kann durch Einblasen von Luft oder Sauerstoff in das Reaktionssystem
zugeführt werden. Die Menge des Sauerstoffs ist im allgemeinen äquimolar zu der
Menge des verwendeten Methanols oder größer.
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Das in dieser Weise erhaltene Produkt kann in üblicher Weise gereinigt
werden, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz etc.
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Erfindungsgemäß kann man Ameisensäure in einer Stufe ohne die Zugabe
irgendeines Coenzyms und ohne Inhibierung durch den als Zwischenprodukt anfallenden
Formaldehyd aus Methanol bilden.
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Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
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In der nachfolgenden Beschreibung stehen FDM, AOD bzw.
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CAT für Formaldehyd-Dismutase, Alkohol-Oxidase bzw. Katalase.
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Beispiel. 1 Herstellung von Mikroorganismen Man züchtet Hansenula
polymorpha DL 1, eine Methanol-assimilierende Hefe in einer Schüttelkultur in dem
Medium A (siehe die nachfolgende Tabelle I) während 48 Stunden bei 30"C. Die Hefe
wird dann gesammelt, gewaschen und in gefrorenem Zustand (-150C) aufbewahrt.
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Man züchtet Pseudomonas putida, einen FDM-bildenden Mikroorganismus
in dem in der nachfolgenden Tabelle II angegebenen Medium B während 72 Stunden bei
30"C in einer
Schütteleinrichtung, gewinnt den Mikroorganismus
und bewahrt ihn in gefrorenem Zustand unter den gleichen Bedingungen wie die oben
angesprochene Hefe auf.
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TABELLE I Zusammensetzung des Mediums A (NH4) 2SO4 5,0 g NaCl 0,1
g MgS04.7H20 0,3 g Na2HP04 1,0 g KH2PO4 2,0 g Hefeextrakt 0,1 g Metallsalzlösung
10 ml Vitaminlösung 10 ml Entionisiertes Wasser 1000 ml pH-Wert 6,0 Methanol (vor
dem Animpfen zugesetzt) 10 ml Man überführt 1 Liter des obigen Mediums in eine 2
Liter-Sakaguchi-Flasche.
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Metallsalzlösung CaC12.2H20 5,5 g FeC13.H20 3,75 g MnS04.3H20 1,7
g ZnSO 2 7H2O 2,2 g CuS04.5H20 0,4 g CoCl2.2H2O 0,28 g Na2MO4. 2H2O 0,26 g H3BO
0,4 g KI 0,6 g Entionisiertes Wasser 1000 ml
Vitaminlösung Thiamin-HC
1 250 mg Biotin 25 mg Entionisiertes Wasser 1000 ml TABELLE II Zusammensetzung des
Mediums B Pepton 10 g Fleischextrakt 5g NaCl 5g K2HP04 lg Glucose 10 g Entionisiertes
Wasser 1000 ml pH-Wert 7,0 Man überführt 1 Liter des obigen Mediums in eine 2 Liter-Sakaguchi-Flasche.
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Reinigung der Enzyme i) AOD und CAT: Man behandelt Zellen von H. polymorpha
DL 1 mit Ultraschall und unterwirft den zellfreien Extrakt einer Ausfällung mit
Ammoniumsulfat (80 % Sättigung). Dann dialysiert man die erhaltene überstehende
Flüssigkeit und unterwirft sie einer Ionenaustauschchromatographie in einer mit
DEAE-Sephacell gefüllten Säule. Man eluiert CAT mit einer 0,1 M Phosphorsäurepufferlösung.
AOD wird mit einer 0,1 M Phosphorsäure + 0,2 M NaCl-Pufferlösung eluiert. Die jeweiligen
aktiven Fraktionen werden gesammelt und mit Ammoniumsulfat ausgefällt (80 % Sättigung),
dann dialysiert und im Kühlschrank aufbewahrt. Unter diesen
Bedingungen
ist AOD während etwa zwei Wochen stabil. Bei längerer Lagerung ist es erforderlich,
die Enzymlösung mit einer gleich großen Menge Glycerin zu vermischen und sie unterhalb
-15°C zu lagern.
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ii) FDM: Man unterwirft den zellfreien Extrakt von P. putida F61 einer
Protaminbehandlung und anschließend einer Acetonfraktionierung. Die Enzymlösung
wird durch Säulenchromatographie über DEAE-Sephacell gereinigt.
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Die Aktivitäten der verwendetcn Enzyme sind in der nachfolgenden Tabelle
III angegeben. Nachfolgend ist die Menge eines Enzyms, die 1 pMol des Substrats
in einer Minute umwandelt, als eine Einheit definiert.
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TABELLE III Spezifische Aktivität der gereinigten Enzyme Enzym Spezifische
Aktivität (>MolZmin-mg Protein) AOD 7,58 CAT 6000 FDM 90,9 Reaktionsbedingungen
Man verwendet 5,0 ml einer Reastionsmischung, die 0,05 M Phosphorsäurepuffer (mit
einem pH-Wert von 7,5), 0,1 bis 1 M Methanol, 5,7 Einheiten/ml AOD, 200 Einheiten/ml
CAT und 50 Einheiten/ml FDM enthält. Die Reaktion wird bei 300C durchgeführt und
der pH-Wert des Reaktionssystems wird mit einer 0,1 M NaOH-Lösung unter Verwendung
einer pH-Konstanthalteinrichtung bei 7,5 gehalten. Gleichzeitig
wird
Sauerstoff aus einer Druckflasche in die Reaktionsmischung eingeblasen.
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Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle
IV zusammengestellt.
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TABELLE IV
| Methanolmenge Reaktion Verbleiben- Gebildete Umwand- |
| mM g/l zeit, h des Methanol Ameisen- lung, % |
| mM säure |
| mM g/l |
| 100 3,6 2,5 0 94 4,3 94 |
| 100 6,4 2,5 0 175 8,0 87,5 |