DE1642637A1 - Milchgerinnungsenzym und Verfahren zu seiner Erzeugung - Google Patents
Milchgerinnungsenzym und Verfahren zu seiner ErzeugungInfo
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Description
κ 8ιι
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Ί\ /V1 i-e -ν
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan
Milohgerlnnungsenzym und Verfahren zu seiner
Erzeugung
Zusammenfassung:
Das Verfahren zur Erzeugung des Mi lchgerinnungs enzyrns «furch Fermentation besteht darin, dass ein Mikroorganismus der zu
der Gattung Irpex, Fomitopsis, Coriolus oder Lenzites gehört,
in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.
Das Enzym reichert sich in der Nährflüssigkeit an und kann
daraus gewonnen und so behandelt werden, dass ein festes Enzymprodukt erhalten wird, das zum Beispiel bei der Käseherstellung
benutzt werden kann.
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OHtGlNAL
Die Erfindung bezieht sich auf ein Milcngerl/Uiungsenzym. liu spezielleren
bezieht sie sich auf ein Milchgerlnnungsenzym und auf
ein Verfahren zu seiner Erzeugung durch Fermentation. Im noch spezielleren bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur
Erzeugung eines MiIchgerinnu.igsenzyms durch Fermentation mit
Basidiomyoetes.
Aus der Literatur ist es bekannt, dass Labferrnent, das aus dein
Labmagen des Kalbes gewonnen worden ist, sin gut bekanntem, bei
der Käseherstellung unentbehrliches MSchgerinriungsenzym ist.
Einige wenige MiIchgorinnungsenzyme, die durch Züchten von Mikroorganismen
erhalten werden, kommen als Ersatzenzyme für das Labferment
in Betracht. Ein Beispiel dafür ist das Verfahren zur Erzeugung eines Milchg^rinnungsenzyms durch Schimmelpilz, das
in der japanischen Patentveröffentlichung 18 8j5O/65 beschrieuen
wird. Es sind jedoch sehr wenige Verfahren, wenn überhaupt, zur
Erzeugung von MiIchgerinnungsenzymen entwickelt worden, die für
eine industrielle Produktion geeignet sind.
Als Ergebnis von Studien über hydro lysierentie Enzyme, die beim
Züchten von Basidiomycett-S erzeugt weraen, haben die Erfinder
vorliegender Erfindung ein Enzym gefunden, das eine verhältnismassig
schwache proteolytische Wirkung und ein starkes Milchgerinnungsvermögen
hat, nämlich ein bei der Herstellung von Käse äusserst urauchbares Milchgerinnungsenzym, das in einem industrieilen
Maßstao mit geringen Kosten erzeugt werden kann.
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üemjemäss ist eines der Ziele der vorliegenden Erfindung, ein
verbessertes Verfahren für axe Erzeugung von brauchbarem Milch-Cerinnungsenzym
zu schaffen, das die Nachteile und Unzulänglichkeiten der früher bekannten Methoden nicht besitzt.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein
Verfahren zur Erzeugung eines Milchgerinnungsenzyms durch Fermentation
zu schaffen, das in wirksamer und einfacher l.:eise aus-geführt
werden kann.
Ein weitere Ziel cer Erfindung besteht in der Schaffung eines
Verfahrens zur Erzeugung eines MiIchgerinnungsenzyms durch Fermentation,
das in vorteilhafter1 Weise in industriellem Maßstab mit geringen Kosten mit einer hohen Produktionsausbeite ausgeführt
werden kann.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines
Milchgerinnungsenzyms.
Diese unJ andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung
worden für den Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung und den Ansprüchen ersichtlich sein.
Nach der vorliegenden Erfindung ist gefunden worden, dass ein
Hilchgerinnungsenzym, das zum Beispiel bei der Herstellung von
Käse ^rauchbai· ist, beim Züchten von Basidiomycetes, die au den
Gatturfen Irpox, Fomitopsis, Coriolus und Lenzites gehören, er-
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zeugt wird. Als Nährmedium kann ein festes Medium zum Züchten dieser Mikroorganismen verwendet werden. Im allgemeinen ist es
bei industrieller Erzeugung vorteilhafter, ein flüssiges Medium zu benutzen. Es gibt viele Fälle, in denen besonders ausgezeichnete
Ergebnisse erhalten werden, wenn das Züchten unter Belüftung und Bewegung vorgenommen wird.
Es ist sowohl ein synthetisches Züchtungsmedium als auch ein natürliches
Nährsubstrat bei vorliegender Erfindung geeignet, vorausgesetzt, dass es die notwendigen Nährstoffe für das Wachstum
des verwendeten Stammes enthält. Zu solchen Nährstoffen gehören in angemessenen Mengen Substanzen, wie ein Kohlenstofflieferant, *
ein Stickstofflieferant, anorganische Verbindungen und dergl., die durch die angewendeten Mikroorganismen verbraucht werden könne».
So können als Kohlenstofflieferant zum Beispiel Kohlehydrate,
wie Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Milchzucker, Maltoae, Glukose, schwarz-ölige Melasse, Stx\|jkehydrolysate usw., oder andere geeignete
Kohlenstofflieferanten, wie Holzhydrolysat usw., erwähnt
werden. Diese Substanzen können für sich oder in Mischung von zwei oder mehreren benutzt werden. Als Stickstofflieferant können
zahlreiche anorganische oder organische Salze oder Verbindungen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat,
Ammondmmphosphat usw., oder natürliche stickstoffhaltige
Substanzen, wie flüssiger Maisauszug ( cornsteep liquor ), Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Kaseinhydrolysat, Sojabohnenmehl, Weizenkleie, Hefe, Fischauszüge, Extrakt
von Reiskleie usw., verwendet werden. Diese Substanzen können
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wiederum entweder für sich oder in Kombination von zwei oder mehreren
verwendet werden. Zu anorganischen Verbindungen, die zu dem ' Züchtungsmedium hinzugefügt werden können, gehören Salze, wie
Phosphate, Magnesiumsalze, Zinksalze, Kupfersalze, Eisensalze usw.,
zum Beispiel Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid,
Calciumchlorid, Natriumchlorid und dergl. Ferner können dem Me- ■
dium in geeigneter Je nach Wunsch Nährstoffe, wie Vitamine, wachstumsfördernde Substanzen, zum Beispiel Biotin, oder Aminosäuren,
wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, und dergl. zugesetzt werden.
Eine charakteristische bevorzugte Zusammensetzung des Züchtungsmediums bei einer Belüftungs-Bewegungs-Züchtung besteht zum Beispiel
in der Kombination von Ammoniumchlorid, Stärke und anorganischen Salzen. Andere charakteristische Nährzusammensetzungen werden
in den späteren Beispielen angegeben. ;
Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen bei einer Züchtungstemperatur
von vorzugsweise etwa 25° bis 35° C ausgeführt. Das
pH des Mediums während des Züchtens sollte in dem Bereich von 2 bis 7 gehalten werden. Im allgemeinen wird das Züchten 2-10
TageÄng vorgenommen.
Ein MiIchgerinnungsenzym wird durch Züchten, wie es eben beschrieben
wurde, erzeugt. Sobald das Enzym von der Kulturflüssigkeit abgetrennt worden -ist, kann das KulturfiItrat, das durch Abfil-
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trieren der Zellen der Mikroorganismen erhalten worden ist, nach
üblichen Methoden, wie einer Enzymreinigungsmethode und dergl., zum Beispiel durch Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel,
Aussalzen, Konzentrieren unter vermindertem Druck, Absorption und Desorption und dergl., konzentriert oder verfestigt werden.
Verfahren, bei denen anorganische Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumchlorid usw., oder organische Lösungsmittel, wie Methanol,
Aceton, Isopropy!alkohol usw., zu der Enzymlösung hinzugegeben
werden, sind am einfachsten anwendbar. Die Anteile der zuzugebenden
anorganischen Salze oder organischen Lösungsmittel wechseln mit dem benutzten speziellen Mittel. Zum Beispiel wird das Milchgerinnungsenzym
durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Sättigungsmenge von 60 - 70 Gew.-$ oder durch Zugabe der meisten Arten
von wasserlöslichen Lösungsmitteln in einem Anteil von 100 - 250
Vol.~?ä/Vol. ausgefällt. Mit diesen Konzentrationen können die in
jeder Lösung lösbaren Verunreinigungen niedergeschlagen werden.
Wie oben festgestellt worden ist, wird die vorliegende Erfindung durch Züchten von Mikroorganismen, die zu den Gattungen Irpex,
Fomitopsis, Coriolus, oder Lenzites gehören, in einem wässrigen
Nährmedium ausgeführt. Diese Mikroorganismen werden in "Genshoku Nippon Kinrui Zukan" ( Farbige Encyclopädie von japanischen Mikroorganismen
), Vol. 1, 1957 und Vol. 2, I965, veröffentlicht von Hoiku-sha, und in "Genera10f FolypJaceae of Nippon" ( Bulletin ,.
des Tokyo Kagaku Museums ) Nr. 6, 1-111 (192O) beschrieben. Qie
Verwendung dieser Mikroorganismen zur Erzeugung eines Milchgerin?·
nungsenzyms ist bisher noch nicht bekannt gewesen, und diese$
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- 7 - K 811
stellt eine der neuen Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung dar.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung und sollen nicht als Begrenzung aufgefasst werden. Wenn
es nicht anders angegeben wird, beziehen sich die Prozente in den Beispielen und in dem gesamten vorliegenden Text auf das Gewicht.
Es werden 20 1 eines Nährmediums, das 5 # Stärke, 0,3 % Ammoniumchlorid,
0,3 ',o Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, hergestellt
und sterilisiert. Das Nährmedium hat ein pH von 5*5· Anschliessend
werden Hyphen von einem Stamm, der zu der Gattung Irpex lacteus Fr. IFO5367 ( IFO: Institute for Fermentation, Osaka,
Japan ) gehört, in das Medium eingeimpft. Das Züchten wird dann bei 30° C und 400 Umdrehungen je Minute mit Belüftung mit einer Geschwindigkeit
von 15 l/Minute 90 Stunden lang vorgenommen.
Nach Beendigung des Züchtens beträgt die Milchgerinnungsstärke des Kult:Py,filtrats, das durch Abfiltrieren der Zellen des-Mikroorganismus
erhalten wurde, 600 Einheiten/ml. Eine Einheit für die
Milchgerinnungsstarke entspricht der Enzymmenge, die erforderlich
ist, die Koagulation von 3|ml handelsüblicher Milch mit 0,002 Mol *
Calciumchloridgehalt bei Einstellung des pH auf 5,8 bei 35° C in
40 Minuten in Gang zu bringen. Ansehllessend wird Ammoniumsulfat
zu dem Kulturfiltrat in einer Sättigungsmenge von 70 Gew.-^ hinzugefügt.
Der ausgefällte Niederschlag wird mittels Zentrifugen-
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abscheidung gesammelt, in einer geringen Menge destilliertem Wasser
gelöst und über Nacht bei fliessendem Wasser dialysiert. Die Innenlösung der Dialyse wird gefriergetrocknet. Das erhaltene
Enzym-Standardprodukt besitzt eine Milchgerinnungsstärke von Einheiten/mg.
40 ml Nährmedium, das 5 % Glukose, 0,3 % Ammoniumchlorid, 0,5 %
Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, werden in einen kgelförmigen
250 ml-Kolben gefüllt und sterilisiert. Das Nährmedium
hat ein Anfangs-pH von 4,5· Hyphen des gleichen Stammes, der in Beispiel 1 benutzt worden ist, werden in das Nährmedium eingeimpft.
Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30° C 144· ftunden lang vorgenommen.
Eine Enzymlösung wird durch Abfiltrieren der Zellen des Mikroorganismus
erhalten. Die Stärke des erhaltenen Filtrats beträgt 450 Einheiten/ml. Anschliessend wird ein Enzym-Standardprodukt
mit einer Stärke von 65Ό Einheiten/mg durch Zugabe einer doppelten
Menge ( Vol./Vol. ) Aceton zu dem Filtrat zum Ausfällen des aktiven Teils daraus erhalten.
20 1 eines Nährmediums, das 5 % Rohrzucker, 2 % flüssigen Maisauszug,
3 '}'-> Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, werden
auf ein pH von 5,0 eingestellt und sterilisiert. Hyphen eines zu der Gattung Fomitopsis Finicola ATCC 20036 gehörenden Stammes
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werden in das Nährmedium eingeimpft. Das Züchten wird dann bei
30° C 96 Stunden lang bei 400 Umdrehungen je Minute mit Belüftung
' mit einer Geschwindigkeit von 15 1 je Minute vorgenommen.
Nach Beendigung des Züchtens beträgt die Milchgerinnungsstärke der entstandenen Kulturflüssigkeit, die nach dem Abfiltrieren
der Zellen des Mikroorganismus erhalten worden ist, 500 Einheiten/rnl.
Von dem Kulturfiltrat wird das Enzym-Standardprodukt auf die gleiche Jeise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wird, isoliert.
Die Stärke des entstandenen Produktes beträgt 700 Einheiten/mg.
40 ml eines Kulturmediums, das 5 ιό Glukose, 2,5 ti flüssigen Maisauszug,
0,5 c/o Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, werden
in einen kegelförmigen 250 ml-Kolben gebracht, und das gleiche
Sterilisierungs- und Beimpfungsverfahren, das in Beispiel 2 beschrieben
wird, wird aisgeführt. Das Anfangs-pH des Kulturmediums beträgt 4,5? Der verwendete Mikroorganismus ist der gleiche, der
in Beispiel J5 beschrieben wird. Das Züchten'wird unter aerobem
Schütteln der Kultur bei 30° C 144 Stunden lang vorgenommen.
Eine Enzymlösung wird durch Abfiltrieren der Zellen des Mikroorganismus
erhalten. Die Stärke des Filtrats beträgt 400 Einheiten/ml. Anschliessend wird eine doppelte Menge ( Vol./Vol. )
Aceton zu dem Filtrat hinzugefügt, um die aktiven Anteile daraus
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auszufällen. Als Ergebnis wird ein Enzym-Standardprodukt mit einer
MiIchgerinnungsstärke von 600 Einheiten/ml erhalten.
Das Züchten wird unter den gleichen Bedingungen und in der gleichen
Weise, wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme jedoch ausgeführt, dass Lenzites saepiaria Pr. IF06267 ( IPO: Institute for Fermentation,
Osaka, Japan ) als Mikroorganismus angewendet und das Züchten 120 Stunden lang vorgenommen wird. Die MiIchgerinnungsstärke
des Kulturfiltrats, das nach Beendigung des Züchtens erhalten worden ist, beträgt 530 Einheiten/ml.
20 1 eines Kulturmediums, das 5 /j Rohrzucker, 2 >j flüssigen Maisauszug,
0,3 fo Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, werden
auf ein pH von 5,0 eingestellt und sterilisiert. Anschliessend wird das Kulturmedium mit einem zu Coriolus consorus ATCC 1157^·
gehörenden Stamm ueimpft. Das Züchten wird bei 28° C und 2K)O Umdrehungen
Je Minute mit Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 15 1 je Minute in 90 Stunden vorgenommen.
Nach Beendigung des Züchtens beträgt die Milchgerinnungsstärke des Kulturfiltrats, dasdurch Abfiltrieren der Zellen des Mikroorganismus
erhalten worden Ist, 800 EInheiten/rnl.
Anschliessend wird Ammoniumsulfat zu dem Kulturfiltrat In einer
Jäfctlgungsmenge von 80 Gew.- > lilnzugei'ügt. Der entstandene Nieder-
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- 11 - K 811
schlag wird durch Zentrifugalabscheidung gesammelt, in einer geringen
Menge destilliertem Wasser gelöst und über Nacht" bei fliessendem
V/asser dialysiert. Die Innenlösung der Dialyse wird gefriergetrocknet. Die Milchgerinnungsstärke des so erhaltenen
Enzym-Standardproduktes beträgt 900 Einheiten/mg.
40 ml eines Kulturmediums, das 5 % Glukose, 1 % flüssigen Maisaus zug, 0,2 % Ammoniumchlorid, 0,2 % Hefeextrakt und anorganische \
Salze enthält, werden in einen kegelförmigen 250 ml-Kolben gebracht.
Das gleiche Sterilisierungs- und Beimpfungsverfahren, wie es in Beispiel 2 beschrieben wird, wird ausgeführt. Das AnfangspH
des Kulturmediums beträgt 4,5· Der verwendete Mikroorganismus ist der gleiche, der in Beispiel 6 beschrieben wird,, Das Züchten
wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur bei 50° C in 150
Stunden vorgenommen·
Eine Enzymlösung wird durch Abfiltrieren der Zellen des Mikroorganismus
erhalten. Die Milchgerinnungsstärke des entstandenen
Piltrats beträgt 350 Einheiten/ml. Anschliessend wird die doppelte
Menge ( Vol./VoI,) von Aceton zu dem Filtrat hinzugefügt, um den
aktiven Teil daraus niederzuschlagen. Der Niederschlag wird im Vakuum getrocknet. Als Ergebnis wird ein Standard-Enzymprodukt , ·
mit einer Stärke von 500 Einheiten/mg erhalten.
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6AD OBtGtNAL
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Das Züchten wird in der gleichen Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben
wird, 90 Stunden lang mit Coriolus hirsutus ATCC 2O2J5J
als Mikroorganismus vorgenommen. Die Milchgerinnungsstärke des Kulturfiltrats, die nach Beendigung des Züchtens erhalten wird,
beträgt 620 Einheiten/ml.
Es ist offensichtlich, dass die so beschriebene Erfindung in mannigfaltiger Weise variiert werden kann. Solche Variationen
sind nicht so zu verstehen, dass sie ausserhalb des Gegenstandes und des Umfangs der Erfindung liegen, und alle solche Abwandlungen fallen unter die folgenden Ansprüche.
- Patentansprüche -
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Claims (1)
- K 811Patentansprüche :1. Verfahren aur Erzeugung eines MiIchgerinnungsenzyms durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, der zu einer aus der aus Irpex, Fomitopsis, Coriolus unc* kenzites bestehenden Gruppe ausgewählten Gattung gehört, in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, das Milchgerinnungsenzym in dem entstandenen Kulturmedium anreichert und das genannte Enzym daraus gewinnt.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Nährmedium ein wässriges flüssiges Medium ist.3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Züchten bei einer Temperatur von etwa 25 bis 35 C und be einem pH von .;twa 2 bis 7 vorgenommen wir: ,4. Verfahren nach Anspruch 1, daüur-cn gekennzeichnet; dasa der goruiruite wikrcOiganismus Irpa:: laoteus Fx-, IF0536? ist»2098ÜU/UJ7BAD1842637- 14 - K 811 -3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mikroorganismus Fomitopsis Pinicola ATCC 200Jo ist.6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mikroorganismus Lenzites saepiaria Fr. IFO6267 ist.7· Verfahren nach'Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mikroorganismus Coriolus consorus ATCC 11574 ist.o. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mikroorganismus Coriolus hirsutus ATCC 202^3 ist.9· Verfahren zur Erzeugung eines Milchgerinnungsenzyme, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, der zu einer aus der der aus Irpe::, ffornltopsls, Coriolus und Lenzites bestehenden Gruppe ausgewählten Gattung gehört, in einem Nährmedium tffcer aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 25° bis j55° C und einem pH von etwa 2 bis 7 züchtet, das Milchgerinnungsenzym in dem entstandenen Kulturmedium anreichert, das Enzjm aus dem genannten Kulturmedium gewinnt und dann das genannte Enzym zu einem fssten Enzymprodukt gefriertrocknen10* Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, dass :.:lr. Nahi-medium ein wUasri^s flüssiges Medium verwendet wird.11; ϊΤαοh dem Verfahren dos Anspruchs 1 ^raeugfcea Milchgerinnungs*· ©:'i;J/i.'jt209808/1437 ·BADOBIGINAl
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