DE1545585C3

DE1545585C3 - Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure

Info

Publication number: DE1545585C3
Application number: DE19651545585
Authority: DE
Inventors: Hideo Toyokawa; Miyano Tetsuji Nagoya; Iwatsuki Ikuo Hekkai; takeda (Japan)
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 1964-04-30
Filing date: 1965-04-20
Publication date: 1976-01-29

Description

Die Wichtigkeit der 6-Aminopenicillansäure als wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung verschiedener Penicilline ist bekannt. Sie wurde verwendet, um zahlreiche neue Penicilline durch Um-Setzung mit Acylierungsmitteln wie Säurechloriden und Säureanhydriden herzustellen. Viele dieser neuen Penicilline haben eine starke antibakterielle Wirksamkeit gezeigt, und manche besitzen überdies überraschende Eigenschaften wie eine verstärkte Wirksamkeit gegen resistente Organismen sowie eine Widerstandsfähigkeit gegenüber der Zerstörung durch Säure oder Penicillinase. Einige dieser neuen Penicilline, die oft als »synthetische Penicilline« bezeichnet werden, sind auch im Handel erhältlich.

Kürzlich ist bekanntgeworden, daß 6-Aminopenicillansäure durch Fermentation eines Penicillin erzeugenden Schimmelpilzes in einem geeigneten Nährmedium erhältlich ist, wobei jedoch sehr geringe Ausbeuten erzielt werden. In jüngster Zeitist 6-Aminopenicillansäure durch enzymatische Hydrolyse von Penicillinen erhalten worden, z. B. nach den in der DT-AS 11 11 778 und der US-PS 31 16 218 beschriebenen Verfahren, jedoch sind diese Verfahren, bei denen aus Pilzen und Bakterien gewonnene Enzyme verwendet werden, sehr aufwendig und führen zu wenig befriedigenden Ergebnissen.

Wegen der Wichtigkeit der 6-Aminopenicillansäure jedoch zur Herstellung neuer Penicilline und besonders auf Grund der Verwendung bei der technischen Herstellung der »synthetischen Penicilline« haben die Fachleute die Suche nach neuen Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure fortgesetzt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein neues Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch Spaltung von Benzylpenicillin mittels eines Enzyms, das durch Züchtung eines Stammes von Arthrobacter unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Phenylessigsäure erhalten wurde.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man Arthrobacter viscosus A.T.C.C. 15 294 verwendet und die enzymatische Hydrolyse in der vom Mycel befreiten Fermentationsbrühe bei einer Temperatur von etwa 30 bis 4O⁰C und einem pH-Wert von etwa 8,0 bis 9,0 durchführt.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß Benzylpenicillin (Penicillin G) mittels eines Enzyms oder einer Gruppe von Enzymen zu 6-Aminopenicillansäure umgesetzt werden kann, das oder die von einem neuen Stamm der Gattung Arthrobacter der Bezeichnung Arhtrobacter viscosus sp. nov. A.T.C.C. 15 294 erzeugt werden. Der hier verwendete Ausdruck »Benzylpenicillin« bezieht sich auf 6-(Phenylacetamido)-penicillansäure und deren Salze einschließlich der Metallsalze, der Ammoniumsalze und der substituierten Ammoniumsalze, z. B. mit Trimethylamin oder Procain. Der Ausdruck »Enzym« bezeichnet die Enzyme oder Enzymgruppen,, die durch Züchtung von Arthrobacter viscosus sp. nov. A.T.C.C. 15 294 erzeugt werden.

Im allgemeinen sind die durch Züchtung von Mikroorganismen wie Escherichia coli erzeugten und die in den USA.-Patentschriften 30 88 880, 3109 779, 3116 218 und 3121667 beschriebenen penicillinspaltenden Enzyme zellgebunden. Daher war es ziemlich überraschend, als nach der Züchtung von Arthrobacter viscosus A.T.C.C. 15 294 gefunden wurde, daß ein großer Teil der enzymatischen Wirksamkeit im Medium vorliegt.

Der das Enzym erzeugende Mikroorganismus, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, wurde aus einer bei Anjo City, Aichi Prefecture, Japan, genommenen Bodenprobe isoliert. Der Mikroorganismus ist ein neuer Stamm der Gattung Arthrobacter und wurde als Arthrobacter viscosus, sp. nov. bezeichnet. Eine Kultur der lebenden Organismen mit der Laboratoriumsbezeichnung A-9722 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md., hinterlegt und der dortigen Sammlung von Mikroorganismen als A.T.C.C. 15 294 einverleibt.

Die morphologischen und Kultureigenschaften des Arthrobacter viscosus, A.T.C.C. 15 294, werden nachstehend beschrieben.

Morphologie: Stäbchen in Ketten, besonders in jungen Kulturbrühen, Stäbchen in Größe und Gestalt veränderlich, überwiegend 0,8 bis 1,0 · 2,0 bis 7,0 μ in einer 24-Stunden-KuItur. V-förmige Paare sind sehr häufig, die eine schnittartige Unterteilung zeigen, während die Zellen gekrümmt, gerade oder gewölbt sein können. Zwiebelartige Zellen werden häufig in älteren Kulturen gebildet, insbesondere in festen Medien. Eine Aufspaltung der Stäbchen in kleinere Stäbchen und kugelförmige Körper tritt innerhalb von 72 Stunden ein. Die Kokken haben eine Größe von 5,0 bis 1,0 μ. Gram-variabel, sind die Stäbchen und Kokken überwiegend grampositiv; schwach beweglich.
Gelatinestich:

Langsame, schichtenförmige Verflüssigung bei 22 bis 24° C, weißes Sediment, Flüssigkeit trüb. Gelatine-Agar-Abstrich :

Breite Hydrolysezone.

PankreatischesCaseinverdauungsprodukt-Soja-Agar-Kolonien:

Kreisförmig, 1 bis 2 mm bei 24 Stunden, 3 bis 5 mm bei 48 Stunden, ungeteilt, konvex bis kissenförmig, glänzend, klebrig, feinkörnig, cremefarbig. Kultur erzeugt eine feste, rauhe Form mit einem gelappten Rand und rauher Oberfläche.
Pankreatisches Caseinverdauungsprodukt-Soja-Agar-Schrägkultur:

Reichliches Wachstum, fadenförmig, Kante leicht gefaltet, glänzend, klebrig, cremefarben.
Nährbodenextrakt-Agar-Schrägkultur:

Wachstum ähnlich wie bei pankreatisches Caseinverdauungsprodukt-Soja-Agar-Schrägkultur.
Glucose-Asparagin-Agar-Schrägkultur:

Mäßiges Wachstum, fadenförmig mit abgeknickten Kanten, Wachstum nach 24 Stunden bei 35°C gering.

Glucose-Nährbrühe:

Mäßiges Wachstum, einheitliche Trübung, feines Sediment, pH-Wert 7,5 nach 7 Tagen (grobe

Variante pH 6,9).
4°/₀igeNaCI-Nährbrühe:

Mäßiges Wachstum, einheitliche Trübung, kein

Wachstum in 7%iger NaCl-Brühe.
Pankreatisches Caseinverdauungsprodukt-Sojabrühe:

Mäßiges Wachstum, einheitliche Trübung, feines Sediment, kein Oberflächenwachstum (leichter

Ring nach 7 Tagen).
Kartoffel:

Kein Wachstum bei 28 oder 35⁰C (grobe Variante erzeugt mäßiges bis reichliches glänzendes braunes

Wachstum bei 28 und auch bei 35°C).
Purpurmilch (purple milk):

Variabel, keine Veränderung bis leichte Peptonisierung nach 7 Tagen, Reaktion unverändert bis

schwach alkalisch.
Methylrotprüfung:

Negativ.

In Fleischproteinpepton-Nitrat-Medium (Standardmedium zur Kulturidentifizierung) werden aus Nitraten keine Nitrite erzeugt.
Indol:

Wird nicht erzeugt.
Acetylmethylcarbinol:

Wird nicht erzeugt.

Aus Thiosulfat wird kein Schwefelwasserstoff erzeugt.
Stärke-Agar-Strichkultur:

Stärke wird nach 7 Tagen nicht hydrolysiert.
Casein-Agar-Strichkultur:

Langsame Hydrolyse vom Casein.
Hämolyse von Blut:

Negativ.

Aus Glucose oder Lactose wird in Proteose-Peptonbrühe keine Säure gebildet.

Ureasebildung veränderlich, glatter Stamm gewöhnlich negativ, rauher Stamm stark positiv.

Verwertet Ammoniumsalze als Stickstoff quelle; Citrate werden als alleinige Quelle für Kohlenstoff verwertet (Wachstum auf abgeändertem Koser-Citrat-Medium, aber kein Wachstum auf Simmons-Citrat-Agar).
Katalyse:
Positiv.

Günstigste Temperatur zwischen 28 und 35⁰C, gutes Wachstum bei 10 und 40°C, kein Wachstum bei 45°C.

ίο Arthrobacter viscosus sp. nov. A.T.C.C. 15 294 ähnelt am meisten dem Arthrobacter simplex, aufgeführt in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage. Die Tatsache, daß diese Kultur Nitrate oder Ammoniumsalze als einzige Stickstoffquelle, Citrate als alleiniges organisches Nährmittel verwertet, nicht chromogen ist, Stärke nicht hydrolysiert und bei 37⁰C gut gedeiht, stellt sie in die Nähe von Arthrobacter simplex nach Bergeys Arteneinteilung.

2.0 Arthrobacter viscosus sp. nov. A.T.C.C. 15 294 unterscheidet sich von Arthrobacter simplex durch die Bildung viel größerer Zellen, der Fähigkeit, Urease zu bilden, der Unfähigkeit, in einem Thiosulfatmedium Schwefelwasserstoff zu erzeugen, der Fähigkeit, bei 10⁰C zu gedeihen und der Unfähigkeit, Nitrite aus Nitraten zu bilden.

Arthrobacter viscosus sp. nov. A.T.C.C. 15 294 kann von dem in der USA.-Patentschrift 31 16 218 beschriebenen Arthrobacter sp. NRRL-2743 dadurch unterschieden werden, daß die Zellen der Arthrobacter viscosus-Kulturen überwiegend grampositiv sind, während die des Arthrobacter sp. NRRL-2743 überwiegend gramnegativ sind. Die Zellen des Arthrobacter sp. NRRL-2743 sind kleiner als die des Arthrobacter viscosus, besonders in halbfesten Medien. Arthrobacter sp. NRRL-2743 gedeiht nicht in einer ammoniumsalzhaltigen, synthetischen Salzlösung als einziger Stickstoffquelle und in Citrat als alleinigen organischen Nährstoff, während Arthrobacter viscosus gut in diesem Medium gedeiht. Andere Unterschiede zwischen diesen beiden Kulturen sind in der Tabelle zusammengefaßt.

Arthrobacter viscosus
A. T. C. C. 15 294

Arthrobacter sp.
NRRL-B-2743

Kolonien auf pankreatischem Caseinverdauungsprodukt-Soja-Agar (24 Stunden bei 28° C)

Pankreatisches Caseinverdauungsprodukt-Soja-Agar-Schrägkultur (24 Stunden bei 28° C)

Gelatine-Agar-Strich (Gelatinehydrolyse)

12%iger Gelatine-Abstich (7 Tage bei 22 bis 24° C)
Urease-Aktivität (BBl-Urease-Prüfmedium)
Casein-Agar-Strichplatte (7 Tage bei 28° C)

Reduktion von Nitrat zu Nitrit
Temperaturbeziehungen
Wachstum bei 1O⁰C (nach 10 Tagen)
Wachstum bei 22 bis 24⁰C (nach 2 Tagen)
Wachstum bei 28° C (nach 24 Stunden)
Wachstum bei 37⁰C (nach 2 Tagen)
Wachstum bei 40° C (nach 2 Tagen)

1,0 bis 1,5 mm Durchmesser,	punktförmige Kolo
rund, konvex bis kissen-	nien, nicht klebrig
förmig, klebrig
Wachstum, fadenförmig,	Wachstum faden
cremefarben, klebrig	förmig, cremefarben,
	nicht klebrig
Hydrolyse von Gelatine	Hydrolyse von Gela
positiv nach 3 Tagen	tine negativ nach
	7 Tagen
Schichtenförmige	keine Verflüssigung
Verflüssigung
positiv nach 3 Tagen	negativ nach 3 und
	7 Tagen
positive Hydrolyse von	negative Hydrolyse
Casein	von Casein
negativ nach 7 Tagen	positiv nach 24 Stunden
gut	keines bis sehr gering
mäßig	mäßig
reichlich	reichlich
reichlich	keines bis sehr gering
gut	keines

Das penicillinspaltende Enzym oder die Enzymmischung wird durch Impfen von Zellen des Arthrobacter viscosus in einem geeigneten wäßrigen Nährmedium und anschließender Züchtung, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, erzeugt. Die Züchtung auf einem festen Medium ist möglich, für eine praktische Herstellung im großen Maßstab ist jedoch die Züchtung in einem flüssigen Medium vorteilhafter. Die Temperatur bei der Züchtung kann innerhalb weiter Grenzen schwanken, z. B. zwischen etwa 10 bis etwa 40⁰C, d. h. dem Temperaturbereich, in dem der Organismus gedeihen kann, wobei jedoch eine Temperatur von etwa 28 bis etwa 35⁰C im allgemeinen bevorzugt angewendet wird. Die Züchtung erfolgt im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 32⁰C. Der pH-Wert des wäßrigen Nährmediums wird vorzugsweise mindestens auf etwa 7,0 und vorzugsweise auf etwa 7,0 bis 9,5 vor Beginn der Züchtung eingestellt. Es wurde gefunden, daß der pH-Wert während der Züchtung ansteigt.

Bei der Züchtung des Organismus zur Herstellung des Enzyms oder der Mischung von Enzymen zur Spaltung von Benzylpenicillin kann das Medium als Quelle für den Kohlenstoff ein im Handel erhältliches Glyceridöl oder ein Kohlehydrat wie Stärke, Glukose, Glycerin, Maltose, Dextrin, Sucrose oder Lactose in reiner oder roher Form enthalten; als gemeinsame Quelle für Stickstoff und Kohlenstoff können organische Produkte wie Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Hefeextrakt oder Maisquellwasser und, falls erwünscht, anorganische Stickstoffquellen wie Nitrate, Ammoniumsalze dienen, und es können Mineralsalze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Magnesiumsulfat und Puffermittel wie Calciumcarbonat, Borate oder Phosphate und Spuren von Schwermetallsalzen zugesetzt werden. Solche Bestandteile des Mediums sind in der kanadischen Patentschrift 5 13 324, in den britischen Patentschriften 7 30 431 und 7 36 325 und in den USA.-Patentschriften 26 91 618, 26 58 018, 26 53 899, 25 86 762, 25 16 080, 24 83 892, 26 09 329 und 27 09 672 aufgeführt. Beispiele für geeignete Nährmedien sind im nachfolgenden Beispiel angegeben. Bevorzugte Nährmedien sind diejenigen, die Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthalten, welche sich von natürlichen Quellen wie Fleischextrakten ableiten, z. B. Aufguß von Rinderherz, hydrolysiertem tierischen Eiweiß (durch proteolytische Enzyme oder auf andere Weise, wobei eine Anzahl davon im Handel erhältlich ist), pflanzlichem Extrakt wie Maisquellwasser. Bei belüfteten submersen Züchtungen wird zur Regulierung des Schäumens häufig ein Antischaummittel wie flüssiges Paraffin, Fettöle oder ein Silikon verwendet. Im allgemeinen wird die Züchtung fortgesetzt, bis sich eine Menge an Enzym im Medium angesammelt hat.

Die Züchtung von Arthrobacter viscosus erfordert von etwa 6 bis 72 Stunden, um nennenswerte Mengen an Enzym herzustellen, und 24- bis 72stündiges Wachstum sind im allgemeinen ausreichend. Eine beträchtliche Menge des Enzyms oder der Enzymmischung wird meist in der Brühe gefunden, obgleich auch ein Teil im vegetativen Wachstum vorliegt, das aus der Züchtung des Organismus erhalten wird.

6-Aminopenicillansäure wird durch Umsetzen von Benzylpenicillin mit dem während der Züchtung von Arthrobacter vise osus erzeugten Penicillin spaltenden Enzym hergestellt. Dabei wird die oben befindliche Flüssigkeit der das vegetative Wachstum enthaltenden Brühe vom vegetativen Wachstum abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren, bevor sie im Verfahren verwendet wird. Benzylpenicillin wird in Lösung zugesetzt, z. B. in Wasser zur oben befindlichen Flüssigkeit, wodurch die enzymatische Hydrolyse des zugegebenen Benzylpenicillins bewirkt wird.

Die enzymatische Hydrolyse erfordert im allgemeinen 2 bis 30 Stunden, um nennenswert zum Abschluß

ίο zu gelangen. Die Hydrolyse wird bei einer Temperatur von etwa 30 bis 40⁰C durchgeführt, wobei 37° C eine geeignete Arbeitstemperatur darstellen. Während der enzymatischen Hydrolyse wird der pH-Wert der Reaktionsmischung auf etwa 8,0 bis 9,0 gehalten. Da der pH-Wert der Reaktionsmischung während der Hydrolyse gern sinkt, kann es erforderlich sein, im Verlauf der Reaktion eine pH-Wert-Einstellung vorzunehmen.

Nach Beendigung der enzymatischen Hydrolyse können alles nicht umgesetzte Penicillin, das noch in der Reaktionsmischung vorliegen kann, sowie die Phenylessigsäure, die während der Umsetzung abgespalten wird, durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie Methylisobutylketon, n-Butanol oder Butylacetat bei saurem ρH-Wert, z. B. 2 bis 3, entfernt werden.

Nach einem bequemen Verfahren zur Untersuchung der bei der enzymatischen Hydrolyse von Benzylpenicillin gebildeten 6-Aminopenicillansäure wird die 6-Aminopenicillansäure enthaltende Lösung mit 0,1 m Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) in einem Verhältnis von 1:20 verdünnt, und gleiche Mengen (etwa 10 Mikroliter) der verdünnten Lösung werden mit einer Injektionsspritze auf je zwei gleich markierte Papierstreifen an einer Stelle aufgebracht. Ein Streifen wird zweimal mit Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5; 0,1 m), dann zweimal mit einer 5%'gen Lösung von Phenylacetylchlorid in Aceton und dann abermals zweimal mit der Pufferlösung (zwischen jedem Aufsprühen wird der Streifen getrocknet) besprüht. Beide Streifen (besprüht und nicht besprüht) werden dann in eine Schale gelegt, die eine gleichmäßige Dispersion von Bacillus subtilis auf Nähragar enthält und über Nacht bei 28⁰C ausgebrütet wird. Die An-Wesenheit einer die Flecke umgebenden Hemmungszone zeigt die Bildung von Benzylpenicillin durch Reaktion des Phenylacetylchlorids mit der 6-Aminopenicillansäure, die durch die enzymatische Hydrolyse des Benzylpenicillins gebildet wird. Die Menge der 6-Aminopenicillansäure wird durch einen direkten Vergleich der auf dem besprühten Streifen hervorgerufenen Flecken mit den Flecken bestimmt, die durch bekannte Mengen Benzylpenicillin hervorgerufen werden.

Das nachfolgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel

a) Ein aus Maisquellwasser (5200 g), Glukose (650 g), Phenylessigsäure (650 g) und Ammoniumchlorid (130 g), das in 1301 Wasser gelöst ist, bestehendes Medium wird hergestellt, auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt und 30 Minuten sterilisiert. Dieses Medium wird mit einem Liter einer 27,5-Stunden-Schüttelkultur von Arthrobacter viscosus, A.T.C.C. 15 294, geimpft, die in einem Medium aus 0,5% Glukose, 1% Pepton, 0,5% Rinderextrakt, 0,25%

Natriumchlorid, 0,1 % Hefe sowie Wasser ausgebrütet ist und einen pH-Wert von 7,0 aufweist. Die Mischung wird 47 Stunden bei 28⁰C gezüchtet. In die Mischung leitet man sterilisierte Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 0,2 Liter pro Minute und pro Liter der Brühe 24 Stunden ein und erhöht dann die Geschwindigkeit auf 0,3 bis 0,4 Liter pro Minute und pro Liter Brühe. Nach 47 Stunden wird das Mycel durch Zentrifugieren gesammelt und mit Boratpuffer (pH-Wert 8,5) gewaschen. Es werden etwa 4600 g nasses Mycel erhalten.

b) Arthrobacter viscosus, A.T.C.C. 15 294, wird nach dem vorstehenden Verfahren gezüchtet. 250 ml

der Brühe werden zentrifugiert und ergeben 200 ml klare Flüssigkeit. Dieser werden 300 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung bei 0⁰C zugesetzt, und das Ganze wird über Nacht in einen Kühlschrank gestellt. Der Niederschlag wird durch Filtrieren aufgenommen und in wäßrigem Ammoniak gelöst. Man erhält 25 ml Enzymlösung. Die Enzymlösung wird mit 100 ml Boratpufferlösung (pH 8,5) verdünnt und mit 1,5 g Benzylpenicillin versetzt. Die Penicillinkonzentration ίο der entstandenen Lösung beträgt 20000 μ/ml. Nach 30 Minuten Reaktion bei 37° C werden 6420 y/ml 6-Aminopenicillansäure entsprechend einer Spaltrate von 88,1% erhalten.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch Spaltung von Benzylpenicillin mittels eines Enzyms, das durch Züchtung eines Stammes von Arthrobacter unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Phenylessigsäure erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet, daß man Arthrobacter viscosus A.T.C.C. 15 294 verwendet und die enzymatische Hydrolyse in der vom Mycel befreiten Fermentationsbrühe bei einer Temperatur von etwa 30 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 8,0 bis 9,0 durchführt.