DE1545585A1 - Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansaeure - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR.-ING. WOLFRAM BUNTE

β MÜNCHEN 18, HAYDNSTRASSE 5. FERNRUF C08J1) 83 Alii ψ#* Γ* J& ^

München, den Θ. April I965 M/7787

VERPAHEEN ZUR HERSTELLUNG VON 6AAMINOPENICILLANSIuRE.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure. Im besonderen betrifft sie ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Penicillinen zu 6-Aminopenicillansäure. Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines penicillinspaltenden Enzyms.

Die Wichtigkeit der 6-Aminopenicillansäure als wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung verschiedener Penicilline ist bokjnint. Sie wurde verwendet, um zahlreiche neue Penicilline durch Umsetzung mit Aoylierungsmitteln wie SäureChloriden und Säureanhydriden herzustellen. Viele dieser neuen Penicilline haben eine starke antibakterielle Wirksamkeit gezeigt, und manche besitzen überdies überraschende Eigenschaften wie eine verstärkte Wirksamkeit gegen resistente Organismen sowie eino Widerstandsfähigkeit gegenüber der Zerstörung durch Säure oder Penicillinase. Einige dieser neuen Penicilline, die oft als "synthetische Penicilline" bezeichnet werden, sind auoh im Handel erhältlich. g_AD

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Kürzlich ist bekannt geworden, daß 6-Aminopenicillansäure durch Fermentation eines Penicillin erzeugenden Schimmelpilzes in einem geeigneten Nährmedium erhältlich ist, wobei jedoch sehr geringe Ausbeuten erzielt werden» In jüngster Zeit ist 6-Aminopenicillansäure durch enzymatische Hydrolyse von Penicillinen erhalten worden. Diese bei dem Verfahren verwendeten Enzyme werden aus Bakterien und Pilzen gewonnen.

Wegen der Wichtigkeit der 6-Aminopenicillansäure jedoch zur Herstellung neuer Penicilline und besonders aufgrund der Verwendung bei der technischen Herstellung der "synthetischen Penicilline" haben die Faohleute die Suche nach neuen Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenioillansäure fortgesetzt»

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein neues Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure·

Weiterhin ist ein Verfahren zur Herstellung eines penicillinspaltenden Enzyms Gegenstand der Erfindung·

Die Ziele der Erfindung wurden durch ein Verfahren erreicht, das, kurz gesagt, darin besteht, Benzylpenicillin mit einem Enzym in Berührung zu bringen, das durch den Mikroorganismus Arthrobacter viscosus eraeugt wird, um 6-Aminopenicillansäure herzustellen»

Ss wurde nun gefunden, daß Benzylpenicillin (Penicillin G) mittels eines Enzyms oder einer Gruppe von Enzymen zu 6-Aminopenicillansäure

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umgesetzt werden kann, das oder die Ton einer neuen Art der Gattung Arthrobaoter der Bezeichnung Arthrobacter viscosus sp« nov. erzeugt werden. Der hier Terwendete Ausdruolc "Benzylpenicillin" bezieht sich auf 6-(Phenylaoetaraido)-penicillansäure und deren Salze einaohliefilioh der Metallsalze_f der Ammoniumsalze und der substituierten Ammoniumsalze, z.B. mit Triethylamin, Prooain, etc. Der Ausdruolc "Bn*ya^w bezeichnet die Enzyme oder Enzymgruppen, die durch Züchtung von Arthrobaoter viecosus sp. nov. erzeugt werden, welcher Penicillin zu 6-Aminopenicillansäure hydrolysiert.

Im allgemeinen sind die durch Züchtung von Mikroorganismen wie Becheriohia ooli erzeugten und die in den US-Patentschriften 3 088 880, 3 109 779» 3 116 218 und 3 121 667 beschriebenen penicillinspaltenden Enzyme zellgebunden. Daher war es ziemlioh überraschend, als nach der Züchtung von Arthrobaoter viecosus gefunden wurde, daß sin großer Teil der enzymatischan Wirksamkeit im Medius -vorliegt.

Der das Enzym erzeugende Mikroorganismus, der in dem er fin dünge <gemäßen Verfahren verwendet wird, wurde aus einer bei Anjo City, Aichi Prefecture, Japan., genommenen Bodenprobe isoliert· Der Mikroorganismus ist eine neue Art der Gattung Arthrebaeter und wurde als Arthrebaeter visoosus, sp. nov. bezeichnet. Eiste Kultur der lebendem Organismen mit der Laboratoriumsbezeichnung 1.-9722 vur&e bei der American Type Culture Collection, Kockville, Md., hinterlegt uad der dortiges Sammlung von Mikroorganismen als A₆T.CC« I5 294 einverleibt. ^ - ~

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Die morphologischen und Kultüreigenschaften des Arthrobacter Tieoosus, A.T.C,C. 15 294t werden nachstehend beschrieben,

Morphologie! Stäbohen in Ketten, besonders in Jungen Kulturbrühen, Stäbchen in Größe und Gestalt veränderlich, überwiegend 0,8 -1,0 ι 2,0 - 7,0 u in einer 24 Stunden-Kultur. V-förmige Paare sind sehr häufig, die eine sohnittartige Unterteilung zeigen, während die Zellen gekrümmt, gerade oder gewölbt sein können. Zwiebelartige Zellen werden häufig in älteren Kulturen gebildet, insbesondere in festen Medien. Eine Aufspaltung der Stäbohen in kleinere Stäbohen und kugelförmige Körper tritt innerhalb von J2 Stunden ein. Die Kokken haben eine Größe von 0,5 - 1,0 u. Gram-variabel, sind die Stäbohen und Kokken überwiegend Grampositivf sohwaoh beweglich.

Gelatine·tioh1 Langsame, schiohtenförmige Verflüssigung bei 22 - 24 C,

weißes Sediment, Flüssigkeit trüb. Gelatine-Agar-Abstriohi Breite Hydrolysezone.

Sryptioaee-Soja-Agar-Kolonieni Kreisförmig, 1-2 mm bei 24 Stunden, 3 - 5 mm bei 48 Stunden, ungeteilt, konvex bis kissenförmig, gläncend, klebrig, feinkörnig, cremefarbig. Kultur erzeugt eine feste, rauhe Form mit einem gelappten Band und rauher Oberfläche.

Xryptioase-Soja-Agar-Sohrägkulturi Reichliches Wachstum, fadenförmig, Kante leioht gefaltet, glänzend, klebrig oremefarben.

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Nährbodenexfcrakt-Agar-Schrägkulturi Wachstum ähnlich, wie bei Tryptioase-Soja-Agar-Sohrägkultur.

Grlucose-Asparagin-Agar-Sohrägkultur» Mäßiges Wachstum, fadenförmig mit abgeknickten Kanten, Wachstum nach 24 Stunden bei 35 G gering· Gluoose-Nährbrüheι Mäßiges Wachstum, einheitliche Trübung, feines Sediment, pH-Wert 7,5 nach 7 Tagen (grobe Variante pH 6,9)· 4 $ige NaCl-Nährbrüheι Mäßiges Wachstum, einheitliche Trübung, kein Wachstum in 1 $Lger NaCl-brühe.

Trypticase-Sojabrühet Mäßiges Wachstum, einheitliche Trübung, feines Sediment, kein Oberflächenwachs^tum (leichter Ring nach 7 Tagen)· Kartoffel! Kein Wachstum bei 28⁰C oder 35°C )grobe Variante erzeugt mäßiges bis reichliches glänzendes braunes Wachstum bei 28 C und auch bei 35°C).

Purpurmilch» (purple milk)» Variabel, keine Veränderung bis leiohte Pep-. tonisierung nach 7 Tagen, Reaktion unverändert bis schwaoh alkalisch*

Methylrotprüfungi Negative

Xn Trpyton-Nitrat-Medium werden aus Hfcraten keine Nitrite erzeugt· Indol wird nicht erzeugt·
Acetylmethyloarbinol wird nicht erzeugt.
Aus Thiosulfat wird kein Schwefelwasserstoff erzeugt. Stärke-Agar-Strichkulturi Stärke wird nach 7 Tagen nicht hydrolysiert. Casein-Agar-Striohkulturt Langsame Hydrolyse von Casein·

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Hämolyse von Blut ι Negativ. Aus Glucose oder Lactose wird in Proteose-Peptonbrühe keine Säure gebildet.

Ureasebildung veränderlich, glatter Stamm gewöhnlich negativ, rauher Stamm stark positiv.

Verwertet Ammoniumsalze als Stickstoff quelle} Citrate werden als alleinige Quelle für Kohlenstoff verwertet (Wachstum auf abgeändertem Koser-Citrat-Hedium, aber kein Wachstum auf Simnons-Citrat-Agar.)

Katalyse positiv.

Günstigste Temperatur zwischen 28 C'und 35°C, gutes Wachstum bei 10 C und 4O⁰C, kein Wachstum bei 45⁰C

Arthrobacter viscosus sp· nov· ähnelt am meisten dem Arthrobacter Simplex, aufgeführt in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage. Die Tatsache, daß diese Kultur Nitrate oder Ammoniumsalze als einzige Stickstoffquelle, Citrate als alleiniges organisches Nährmittel verwertet, nicht ohromogen ist, Stärke nicht hydrolysiert und bei 37 C gut gedeiht, stellt sie in die Nähe von Arthrobacter simplex nach Bergey's Arteneinteilung·

Arthrobaoter viscosus sp· nov. unterscheidet sich von Arthrobacter Simplex durch die Bildung viel größerer Zellen, der Fähigkeit, Urease au bilden, der Unfähigkeit, in einem Thiosulfatmedium Schwefelwasserstoff zu erzeugen, der Fähigkeit, bei 10°c _zu gedeihen und der Unfähigkeit, Nitrit· aus Nitraten zu bilden·

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Arthrobacter Tiscosus sp. nov. kann von dem in der US-Patentschrift 3 116 218 beschriebenen Arthrobacter sp· NSHL-2743 dadurch unterschieden, werden, daß die Zellen der Arthrobaoter viscosus-Kultüren überwiegend grampositiT sind, während die des Arthrobaoter ep. NEBL-2743 überwiegend gramnegatiT sind· Sie Zellen des Arthrobacter ep. NEEL-2743 sind kleiner ale die des Arthrobaoter vieoosus, besondere in halbfesten Medien. Arthrobaoter βρ· NREL-2743 gedeiht nicht in einer aomoniumsalahaltigen, synthetischen Salzlösung als einziger Stiokstoffquelle und in Citrat als alleinigen organischen Nährstoff, während Arthrobaoter Tisoo-8U8 gut in diesem Medina, gedeiht· Andere Unterschiede zwischen diesen beiden Kulturen sind in Tabelle I zusammengefaßt.

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Bas penicillinepaltende Enzym oder die Snsymmisohung wird durch Impfen von Zellen dee Arthrobaoter visoosus in einem geeigneten wäßrigen Nährmedium und anschließender Züchtung, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, erzeugt. Sie Züchtung auf einem festen Medium ist mSglioht, für eine praktische Herstellung im großen.Maßstab ist jedooh die Züchtung in einem glüssigen Medium vorteilhafter· Die Temperatur bei der Züchtung kann innerhalb weiter Grenzen schwanken, z.B. zwischen etwa 10 C bis etwa 40 C, d.h. dem Temperaturbereich, in dem der Organismus gedeihen kann, wobei jedoch eine Temperatur von etwa 28 C bis etwa 55 C im allgemeinen bevorzugt angewendet wird. Sie Züohtung erfolgt im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 32 C. Der pH-Wert des wäfrigen Nährmediums wird vorzugsweise mindestens auf etwa 7»0 und vorzugsweise auf etwa 7,0 bis 9,5 vor Beginn der Züchtung eingestellt. Ss wurde gefunden, daß der pH-Wert während der Züohtung ansteigt«

Bei der Züohtung des Organismus sur Herstellung des fttsyms

oder der Mischung von Enzymen zur Spaltung von Benzylpenicillin kann das / Medium als Quelle für den Kohlenstoff ein im Handels erhältlioh·· QIyceridöl oder ein Kohlenhydrat wie Stärke, GHukose, GHyoerin, Maltose, Dextrin, Sucrose, Lactose etc. in reiner oder roher form enthalten; a}i gemeinsame Quelle für Stickstoff und Kohlenstoff können organische Produkte wie Sojabohnenmehl, Distillers solubles, Erdnußmehl, BaumwoJlaamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Hefeextrakt, Maisquellsrasser

BAD ORiGSNAL

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etc., und, falls erwünscht, anorganische Stickstoffquellen vie Nitrate, Ammoniumsalze dienen, und es können Mineralsalz· wie Natriumchlorid, Kaliumohlorid und Magnesiumsulfat und Puffermittel wie Caloiumcarbonat, Borate oder Phosphat· und Spuren von Schwermetallsalzen zugesetzt werden* Solche Bestandteile des Mediums sind in der kanadischen Patentschrifi 513 324, in den britischen Patentschriften 730 43I und 736 325 und in den US.Patenttohriften 2 69I 618, 2 658 018_f 2 653 899, 2 586 762, 2 516 080, 2 483 892, 2 609 329 und 2 70S 672 aufgeführt. Beispiele für geeignete Nährmedien sind in den nachfolgenden Beispielen angegeben. Bevorzugte Nährmedien sind diejenigen, die Quellen für Kohlenstoff und / Stickstoff enthalten, welche sich von natürlichen Quellen wie Fleisch- •itrakten ableiten, z.B» Aufguß von Binderherz, hydrolysiertem tierischen Iiweiß (durch proteolytisohe Bnsyme oder auf ander· Weise, wobei eine Anzahl davon im Handel erhältlich ist), pflanzlichem Extrakt wie Mais·* qu«llwft»s«r «to« Bei belüfteten submersen Züohtungen wird zur Regulierung das Sohäumene häufig ein Antisohaummitel wie flüssiges Paraffin, •in fett·· öl oder ein Silikon verwendet. Im allgemeinen wird die Züchtung fortgesetzt, bis sich eine Menge an Enzym im Medium angesammelt hat.

Die Züchtung von Arthrobaoter visoosus erfordert von etwa 6 bis 72 Stunden, um nennenswerte Mengen an Enzym herzustellen, und 24 bis 72-stündigeβ Waohetum sind im allgemeinen ausreichend. Eine beträoht-

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lioh· Meng· de· Enzyme oder der lazymmisehung wird met at in der Brühe gefunden, obgleich auoh ein üfeil im vegetativen Waohetum vorliegt, das au· der Züchtung des Organismus erhalten wird«

6-Aminopenicillansäure wird durch Umsetzen τοη Benzylpenicillin mit dem während der Züchtung τοη Arthrobacter viaooaua erzeugten Penicillin spaltenden Xnzym hergestellt. Dabei kann die gesamte, das TegetatiTe Wachstum enthaltende Brühe verwendet werden, aber vorsugsweise wird die oben befindliche Flüssigkeit Tom vegetativen Wachstum abgetrennt, z.B, duroh Zentrifugieren, bevor sie im Verfahren verwendet wird. Die Zellen können jedoch gleichfalls verwendet werden, da sie etwas enzymatische Aktivität enthalten· Benzylpenicillin wird in Lösung zugesetzt, z.B. in Wasser zur gesamten Brühe oder der oben befindlichen Flüssigkeit, wodurch die enzymatisch· Hpiroly·· des zugegebenen Benzylpenicillin» bewirkt wird· Die enzymatisohe Hydrolyse erfordert im all« gemeinen 2 bis JO Stunden, um nennenswert sum Abschluß zu gelangen. Die Hydrolyse verläuft bei einer Temperatur τοη etwa 20⁰C bis 50°0 und wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 30 0 bis 40 C durchgeführt, wobei 37°C eine geeignete Arbeitstemperatur darstellen· Während der ensymatischen Hydrolyse ist es erwünscht, den pH-Wert der Reaktionsmisohung auf etwa 7,0 bis 9t5 zu halten und ein pH-Wert von etwa 8,0 bis 9,0 ist besonders geeignet. Da der pH-Wert der Eeaktionsmisohung während der Hydrolyse gern sinkt, kann es erforderlich sein, im Verlauf der Eeaktion eine pH-Wert-Einstellung vorzunehmen.

909 831 /151 3 BAD ORlSlNAl

Nach Beendigung der enzyaatisohen Hydrolye· wird alle· vorhandene, unlöaliohe regetatiTe Material beispielsweise, durch filtrieren aua der Reaktionsaiachung entfernt, Allee nicht uageaetzte Penicillin, daa noch in der Reaktionaaiaohung vorliegen kann sowie die Phenylesaigsäure, die während der Vasetsung abgespalten wird, können du roh Extraktion ait einen organiaohen Lösungsmittel wie Methyliaobutylketon, n-Butanel oder Butylaoetat sei sauren pH-Wert, z.B. 2 bia 3, entfernt werden·

Bei einen anderen Verfahren sur Hydrolyse τοη Benzylpenicillin su 6-Aainopenioillansäure wird ein adsorbierendes Material wie Diatoaeenerde oder Hol«kohle der gesamten Brühe oder der oben befindlichen Flüssigkeit (etwa 3 g absorbierende Stoffe pro 100 al Brühe oder oben befiadliohe flüssigkeit) sugesetstf daa Penicillin spaltende Snzya wird daran absorbiert· Das enayahaltige, absorbierende Material wird mit dem Tegetatiten Waohstua oder auch allein abgetrennt und einer wäßrigen LOauag sagefügt Oder ia eiae Säule gegeben· Bas Benzylpenicillin ia flüssiger Lösung fließt durch die Säule, wobei die ensymatisohe Hydrolyse des sugeaetsten Bensylpealoillina erfolgt· Dieses Terfahren sur Heratelluag rom 6-lmiaopenioillansäure ist halb kontinuierlich und wird uater dea gleiohea Bedingungen durchgeführt, die -vorher beschrieben wurdea.

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Nach einem bequemen Verfahren zur Untersuchung der bei der enzymatischen Hydrolyse von Benzylpenicillin gebildeten 6-Aminopenioillansäure wird die 6-Aminopenicillansäure enthaltende Lösung mit 0,1 m Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) in einem Verhältnis von 1 ι 20 verdünnt, und gleiche Mengen (etwa 10 Mikroliter) der verdünnten Lösung werden mit einer Injektionsspritze auf je zwei gleich markierte Papierstreifen an einer Stelle aufgebracht. Ein Streifen wird zweimal mit Phosphatpuff erlösung (pH-Wert 7,5$ 0,1 m), dann zweimal mit einer 5 #Lgen Lösung von Phenylaoetylohlorid in Aceton und dann abermals zweimal mit der Pufferlösung (zwischen jedem Aufsprühen wird der !Streifen getrooknet) besprüht* Beide -Streifen (besprüht und nioht besprüht) werden dan» in eine Sohale gelegt, die eine flaohe Dispersion von Baoillu» subtilis auf Nähragar enthält und über Nacht bei 28⁰C ausgebrütet wird· Sie Anwesenheit einer die ileoke umgebenden Heaaungszone neigt die Bildung von Benzylpenicillin durch Beaktion des Phenylaoetylohlorids mit der 6-Aminopenicillansäure, die durch die enzyaatische Hydrolyse des Benzylpenicillins gebildet wird. Sie Menge der 6-Aminopenioillansäure wird durch einen direkten Vergleich der auf des besprühten Streife» hervorgerufenen Flecken mit den Flecken bestimmt, die duroh bekannte Mengen Benzylpenicillin hervorgerufen werden.

Selbstverständlich ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Verwendung von Arthrobaoter fiicoau«, A.I.Q.C. 15 294, btsahräakt

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sondern umfaßt alle Penicillin spaltenden, Enzyme erzeugenden Stämme des Arthrobacter viscosus. Es schließt auch die Penicillin spaltenden, Enzyme erzeugenden Mutanten ein, die aus Stämmen des Arthrobacter viscosus durch verschiedene Methoden wie Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung eto. gebildet werden.

Sie folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung und schränken diese nicht ein.

Beispiel I

Bin aus Maisquellwasser (5200 g), Glukose (65O g), Phenylessigsäure (65O g) und Ammoniumchlorid (I3O g), das in I3O 1 Wassern gelöst w»r, bestehendes Medium wurde hergestellt, auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt und 30 Minuten sterilisiert· Dieses Medium wurde mit 1 Liter einer 27,5 h-Schüttelkultur von Irthrobacter visoosus, A.T.C.C. 15294, gelupft, die in einem Medium aus 0,5 i» Glukose, 1 $> Pepton, 0,5 i» Binderertrakt, 0,25 Ί* Natriumchlorid, 0,1 36 Hefe sowie Wasser ausgebrütet wurde und einen pH-Wert von 7,0 aufwies· Die Mischung wurde 47 Stunden bei 28⁰O gezüohtet. In die Mischung wurde sterilisierte Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 0,2 Liter pro Minute und pro Liter der Brühe 24 Stunden eingeleitet, und dann wurde die Geschwindigkeit auf 0,3 bis 0,4 Liter pro Minute und pro Idter Brüh* ?rh55ht. Nach 47

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Stunden wurde dae Myoel duroh Zentrifugieren geseunmtel und atit Boratpuffer (pH-Wert 8,5) gewasohen. Es wurden etwa 46OO g naeeea Myoel erhalten·

Zu 0,2 1 einer «adrigen Lösung van Benzylpenicillin (IOO 000 u/ml) wurden 735 S naeeee Myoel gegeben. Sie Misobung wurde 4 Stunden bei 37°C gerührt und der pH-Wert durch Zusatz verdünnten Natriumhydroxid· auf 8,5 eingestellt· Kaoh 4 Stunden Reaktion wurde die Mischung auf 6-Aminopenioillanaäure und Benzylpenicillin getrennt untersucht, und es wurde gefunden, daß sie 26 200 mog/ml 6-Aminopenioillamsaure und 2 700ji/al Benzylpenicillin entsprechend einer Ausbaut· von 71,5 ^ enthielt.

Beieniel II

Arthrfcbaoter vis00sue, A.T.C.C. I5 294, wurde 47 Stunden bei 28°C in dem in Beispiel I beschriebenen Medium gezüchtet. Zu 120 1 der Brühe wurden 6 kg Diatomeenerde zugesetzt, und die Misohung wurde 3O Minuten gerührt· Die Siatomeenerde wurde duroh Zentrifugieren abgetrennt und dabei ein nasser Kuohen mit einem Gewicht τοη 13 600 g erhalten. Zu 20 1 einer wäßrigen Benzylpenioillinsösung (75 25Ο ü/ml) wurde» 46ΟΟ g dee naesen Kuohens gegeben und die Misohung 4 Stunden bei 57 Q gerührt, wobei der pH-Wert mit verdünntem latriumhydroacyd auf 8,5 gehalten wurde· Sie Mischung enthielt 20 000 «cg/ml 6-AminopenioUlameäure und 6 72Ο u/ml Benzylpenicillin.

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Beispiel III

Arthrobaoter risoosus, A.T.C.C. I5 294» wurde 47 Stunden bei 28⁰O in des in Beispiel I beschriebenen Medina gezüchtet. Zu 800 1 der Brühe wurde Diatomeenerde gegeben und die Misohung JO Minuten gerührt. Die Di&toaeenerde wurde duroh Zentrifugieren abgetrennt und einer wäßrigen Lösung too, Benzylpenicillin (Θ50 l) τοη 38 65Oji/ml zugesetzt. Nach 2 Stunde» Reaktion bei 3f °0 und einea pH-Wert τοη 8,5 wurden 6520 aog/al 6-lainopeniolllansäure erhalten, die 9 370 g 6-Aminopenioillansäure oder einer Ausbeute τοη 82,4 ^ entsprechen·

Beispiel IY

Arthrobaoter Tisoosus, A.T.C.C. 15 294, wurde 47 Stunden bei 28⁰O in des in Beispiel I beschriebenen Msdiua gezüchtet. 25 kg Siato- »eeaerde wurden 5OO 1 der Brühe zugesetzt, duroh Zentrifugieren abgetrennt und alt Beratpuffer (pH-Wert 8,5) gewaschen. Der Kuchen wurde su 1050 1 des nitrate der Beniylpenioillin-Fermentationsbrühe (7010^1/gl) gegeben. Fach 2 Stunden bei 37°0 und eines pH-Wert τοη 8,5 betrug der 6-JLainopenioillansäuregehalt des filtrate der Beaktion 2175 Kog/tl* Di·· entsprioht 2610 g 6-Aalaopenlolllansäure und einer Auebeute τα* ββ,2 ?ί»

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Beispiel Y

Die Ztiohtung von. Arthrobaoter vieoosue, A.T.G.C. 15294» wurde wie in Beispiel X durohgeführt. 200 1 der Brühe wurden 1 000 1 Benzylpenicillin-Fermentationibrühe (8800 u/ml) zugesetzt· Nach 2 Stunden Reaktion bei 37⁰C und einem pH-Wert von 8 wurde festgestellt, daß die Misohung 2375 mog/ml 6-Aminopenicillansäure enthielt. Die gesamte gebildete 6-Aminopenicillansäure betrug 2850 g, die Ausbeute 86,6 #.

Beispiel YI

Sine Lösung von Benzylpenicillin wurde mit dem duroh 4rthrobaoter visoosus , A.T.C.G. 15294» erzeugten Enzym wie in den vorhergehenden Beispielen behandelt. Ss wurden 95 1 einer Lösung mit 12 720 meg/ ml 6-Aminopenicillansäure erhalten· Sie gesamte 6-Aminopenioillansäure in der Lösung wurde mit 1210 g berechnet. Die Lösung wurde auf 5 C abgekühlt, mit Methyl!sobutylkaton (35 l) versetzt und I5 Minuten bei -einem pH-Wert von 2,0 zur Entfernung de» Penicillin· und anderer eaurer Substanzen gerührt. Die wäßrige Sohioht wurde bis zum isoelektriaohen Punkt mit verdünntem Natriumhydroxyd neutralisiert und die 6-Jüoinopenioillansäure ausgefällt. Die 6-Aminopenioillansäure hatte ein Gewicht von 765 g und eine Eeinheit von 94 $·

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Beispiel· VII

Arthrobacter visooeus, A.T.C.C. 15294, wird· nach dem Verfahren Ton Beispiel I gezüchtet. 25O ml der Brühe wurden zentrifugiert und ergaben 200 ml klare Flüssigkeit, Dieser wurden 3OO ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung bei 0°C zugesetzt, und das ganze wurde über Naoht in einen Kühlschrank gestellt. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren aufgenommen und in wäßrigem Ammoniak gelöst. Es wurden 25 ml Enzymlösung erhalten· Die Enzymlösung wurde mit 100 ml Boratpufferlösung (pH 8,5) Terdünnt und mit 1,5 g Benzylpenicillin versetzt. Sie Penicillinkonzentration der entstandenen Lösung betrug 20 000 u/ml_β Nach JO Minuten Reaktion bei 37 C wurden 6420 aog/ml 6-Aminopenicillansäure entsprechend einer Ausbeute von 68,1 $ erhalten.

	Beigpifl	0,5 #
Sb	L VIII	3,0 #
hergestellt!	wurde ein wäßriges Nährmedium folgender Zusammensetzung	0,5 $>
		0,5 i>
	Glukose	1,0 i»
	Mais quellwasser	94,5 #
	Ammoniumnitrat
	CalciuMcarbonat
	Milch-Feststoff·
Wasser

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100 al dieses Mediums wurden in einen 5OO ml-Kolben gegeben» mit einem Proberohr einer Schrägkultur -von Arthrobaoter visoosus, A,T. O.e. I5294, geimpft und in einem Sohiittelgefäß 24 Stunden bei 32⁰G ausgebrütet. Naoh diesen 24 Stunden wurde 1 ml der entstandenen Suspension •verwendet, ua je seohs 5OO ml-Kolben au impfen, die 100 ml des oben genannten Kährmediums enthielten. Sie Kolben wurden 67 Stunden in einem Sohiittelgefäß einer Temperatur von 32⁰C ausgesetzt, und dann wurde das vegetative Wache turn durch Zentrifugieren des Mediums bei 6000 U/min für 30 Minuten entfernt.

Zu 43O ml der überstehenden Flüssigkeit von einem pH»«*ert von 8,6 wurden 18 g Diatomeenerde (Handelsbezeichnung Dioaüte) gegeben} die Mischung wurde 30 Minuten bei Baum temperatur gerührt, in eine Säule von 2 ι 30 oa gegeben und einem leichten Luftdruck ausgesetzt· 1000 al einer wäßerigen Lösung von Benzylpenioillin-Kallum (25 mg/ml) in einer 0,2 m Kaliumphoaphat-Pufferlösung (pH-Wert 8,6) sit einem pH-Wert von 8,3 wurden in den Torratsbehälter der Säule gegeben und sit einer Geschwindigkeit von 0,8 bis 0,9 ml pro Minute durch die Säule geleitet. Ss wurden 10 ml-Praktionen abgenommen und auf 6-Aadnopenioillansäure untersucht. Sie Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

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TABlLLI II

fraktlom Ir·	pH-Wert	6-Aaiaopani oillaaa äur·
1	8,7	300
2	8,75	350
3	8,75	250
4	8,75	300
5	8,65	1820
6	7,95	7930
7	7,8	625O
β	7,8	6000 .
9	7,8	525O
10	7,85	4900
11	7,85	44OO
12	7,9	4100
13	7,95	3600
14	7,8	4400
15	7,8	. 3930
16	7,9	37OO
17	7.9	5400
18	7,85	3IOO
19	7,9	2830
20	8,0	273O

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Fraktion Nr.	pH-Wert	6-Aminopenicillansäure
	7,95	2500
22	8,0	23OO
23	8,0	2020
24	8,1	I63O
• 25	8,1	I4OO

Sie größte Umsetzung wurde in Fraktion 6 erhalten. Das 25 mg/ ml Benzylpenioillin-Kalium etwa 145OOjig/ml 6-Aminopenioillansäure äquivalent sind, betrug die Umsetzung in Fraktion 6 χ 100 » 54 &

Die vorliegende Erfindung ist in einer bevorzugten Aueführunga· form beschrieben und durch Beispiele erläutert worden. Dem Fachmann ist es jedooh ohne weiteres möglich, entsprechende Abänderungen Torzunehmen, ohne daß der Brfindungegedanke davon betroffen wird»

0 9 8 3 1/15 13 ^ßAD

Claims (1)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von ^-Aminopenicillansäure, dadurch gekennzeichnet , daß Benzylpenicillin mit einem durch den Mikroorganismus Arthrobaoter viaoosus erzeugten, Penioillin spaltenden Enzym bei einer Temperatur von etwa 20⁰C bis etwa 30⁰C und einem pH-Wert ▼on etwa 7»0 bis etwa 9,5 umgesetzt und die 6-Aminopenicillansäure, falle erwünscht, daraus gewonnen wird·

2* Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Arthrobaoter viscosus A.T.G.C. 15 294 Verwendung findet.

3· Verfahren nach Anspruch 2_S dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ArtteirK 3ter viscosus A.3J.C.C· 15 294 in einem wäßrigen Nähnsedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen etwa 10 C und 4O C und bei einem pH-Wert von mindestens etwa J₉O zur Erzeugung eines Penioillin spaltenden Enzyms gezüchtet und Benzylpenicillin mit dem Enzym zur Umsetzung gebracht wird.

4· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Arthrobaoter viscosus A„T.C.C. I5 294 zur Erzeugung eines Penioillin spaltenden Enzyms in einem wäßrigen Näbr»

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medium gesiiohtet, «in· absorbierend· Substana nie Biatoseenerde oder Holzkohle dem Medium sur Absorption de» Emsyms angesetzt» die absorbierende Substanz und das feet·, vegetative Wachstum tob H&hrmedium abgetrennt und eine wäßrig· Lösung tob. BenKylpenicilllä mit der Abeorptionaaubstans und den TtgetatiTtn Waohstus uageeetssi wird· )

Terfahrem naoh einen der Anspruch· 1 bis 5» dadurch gekemixeiehnet, dai der Mikroorganiemua Arthrobaoter riscosu· A.T.0.0. I5 294 «ur Irxsuguag «in·· Penioillin epaltenäen Sneya« in einem wäßrige» Nährmedium gesUohtetf das rtgetatire Vaohstum rom Medium abgetrennt, eine absorbierend· Smliataas nie Siate;:';9n«rde oder Holskohle sum Abeorbierea des Sn«yme dem Ktdlum «ugse^i·Λ was, eine väSrige Lösung τοη Beniylpeaioillin mit der absorbierst«,a "''-'^nms in Berührung gebracht wird.

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