DE2938377A1 - Verfahren zur herstellung von coenzym q tief 10 - Google Patents
Verfahren zur herstellung von coenzym q tief 10Info
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Description
T 51 980
Anmelder: JUJO PAPER COMPANY LIMITED
No. 4-1, 1-chome, Ohji, Kita-ku
Tokyo, Japan
Verfahren zur Herstellung von Coenzym
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q10- Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren
zur Herstellung von Coenzym Q10 durch Kultivieren eines Mikroorganismus1
JY-155, der der Gattung Trichosporon (FERM-P46 5O,
ATCC 20566) angehört, in einem Kulturmedium, das Sulfitablauge
(nachfolgend als "SWL" bezeichnet) als Kohlenstoffquelle enthält und Gewinnen des erzeugten Coenzyms Q1o· Dieser Mikroorganismus
JY-155 gehört der Hefe an und der Stamm JY-155 kann Coenzym Q10 in seiner Zelle erzeugen und anreichern. Darüber
hinaus kann dieser Stamm in einem SWL enthaltenden Kulturmedium gezogen werden.
Coenzym Q1n ist eine Verbindung, die durch die folgende Formel
dargestellt wird und eine wichtige Rolle als ein Element des Elektronenübertragungssystems in einem Organismus spielt.
CH3
- (CH2CH = C-CH2J10H
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Es ist bekannt, daß diese Verbindung eine ausgezeichnete pharmazeutische Wirkung bei verschiedenen Erkrankungen aufweist.
In den letzten Jahren wurde sie klinisch zur Heilung von Herzinsuffizienzen durch orale Verabreichung verwendet.
Diese Verbindung wird industriell entweder über ein halbsynthetisches
Verfahren hergestellt, bei dem ein Material verwendet wird, das in Pflanzen vorkommt, oder durch ein Fermentationsverfahren,
bei dem die Verbindung aus Mikroben-Zellen extrahiert wird. Im Falle des Fermentationsverfahrens liegt eine der
Bedingungen zur Verwirklichung einer vorteilhaften industriellen Produktion darin, Mikrobenzellen, die Coenzym Q1 enthalten, mit
niedrigen Kosten herzustellen, da die Menge des in den Mikrobenzellen angehäuften Coenzyms Q1Q gering ist.
Was die Extraktionsmethode des Coenzyms Q10 aus Mikroorganismen
betrifft, insbesondere aus Hefe und dgl., wird auf die japanische Patentveröffentlichung Nr. 8836/1973, auf die japanische
Patentveröffentlichung Nr. 19034/1976 und auf die offengelegte japanische Patentveröffentlichung Nr. 105288/1977 hingewiesen.
Ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q10/ das durch die
Verwendung höherer Fettsäuren als ein Substrat bei der Kultivierung von Hefe charakterisiert ist, wird in der japanischen
Patentveröffentlichung Nr. 4758/1975 beschrieben.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auf SWL als ein
kostengünstiges Material zur Herstellung von Mikrobenzellen, die Coenzym Q10 enthalten, zurückgegriffen.
Bekanntlich ist SWL eine Ablauge, die beim Verkochen von Holz erhalten wird, wobei diese Ablauge bei dem Verfahren zur Herstellung
von Sulfitzellstoff bzw. Sulfitpulpe als Abstrom erhalten wird. Historisch wurde sie zur Herstellung von Hefe verwendet,
die für Nahrungs- und Futtermittel ausgenutzt wurde, und sie wird kürzlich als ein Ausgangsmaterial zur Herstellung
von Hefe der Gattung Torula verwendet, aus der wirksame Bestandteile, wie Nukleinsäure und Glutathion extrahiert werden. In der
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SWL liegen Saccharoide, Essigsäure und Alkohole vor, die zur Kultivierung von Hefe geeignet sind. Andererseits liegen auch
viele Substanzen vor, die das Wachstum der Hefe inhibieren, wie Schwefligesäure, Zersetzungsprodukte von Lignin, Furfural,
Ameisensäure und lose gebundenes Sulfit. Daher ist im allgemeinen die Eignung von SWL als Kulturmedium für Hefe gering, und die
Hefearten, die ineinen Kulturmedium wachsen können, das SWL als eine
Haupt-Kohlenstoffquelle enthält, sind begrenzt. D. h. lediglich die Gattung Torula und dgl. werden in dem Medium in industriellem
Maßstab kultiviert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden nunmehr Mikroorganismen
gefunden, die Coenzym Q10 enthalten und SWL assimilieren
können. Es hat sich gezeigt,daß in der Natur der Hefestamm
JY-155 erhalten werden kann, der in dem Kulturmedium, das SWL enthält, eine wesentlich höhere Wachstumsgeschwindigkeit als
Kulturen bekannten Typs aufweist, für eine langzeitige kontinuierliche Kultivierung geeignet sein kann und eine beträchtliche
Menge an Coenzym Q1 in seinen Zellen akkumuliert.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden genauer beschrieben.
Zunächst ist der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus ein
Stamm JY-155, der der Gattung Trichosporon angehört, der im
Rahmen der vorliegenden Erfindung aus Erdboden gewonnen wurde. Dieser Stamm kann in dem SWL als eine Hauptkohlenstoffquelle
enthaltenden Kulturmedium kräftig wachsen und akkumuliert Coenzym Q10 in seinen Zellen. Der Stamm weist folgende mikrobiologischen
Eigenschaften auf.
a) Wachstum in Kulturmedium
1. Malzextraktmedium (flüssig)
Die Sprossung ist polypolar. Es bildet sich ein Film. Die
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Form stellt ein längliches Ellipsoid von 2,2-6,5 ^m
(Mikron) auf 6,7 - 16,2 Ann (Mikron) dar.
2. MY-Agarmedium
Das Wachstum ist kräftig. Der Rand der Kolonie ist wellenförmig. Die Elevation der Kolonie ist kegelförmig oder
konvex.Im Zentrum der Kolonie liegt eine Höhlung vor. Die Oberfläche der Kolonie ist rauh und der überzug bzw. Glanz
der Kolonie ist kreideartig. Die Beschaffenheit der Kolonie ist zäh.
3. Streichkultur auf Kartoffelextrakt-Agarmedium
Mycelium und Pseudomycelium werden gebildet, und Keimspore und Oidium werden gebildet.
4. Streichkultur auf MY-Agarmedium
Endosporenbildung.
Endosporenbildung.
b) Ascosporenbildung
Keine Ascosporenbildung.
Keine Ascosporenbildung.
c) Bildung projektiver Sporen
Projektive Sporen werden nicht gebildet
Projektive Sporen werden nicht gebildet
d) Physiologische Eigenschaften
1. Optimale Bedingung
pH: 5-7
Temperatur: 27 - 35°C
pH: 5-7
Temperatur: 27 - 35°C
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2. Wachstumsbereich
pH: 3 - 11,5
Temperatur: 15 - 45 C
pH: 3 - 11,5
Temperatur: 15 - 45 C
3. Assimilation von Nitrat: nein
4. Zersetzung von Fett: nein
5. Zersetzung von Harnstoff: ja
6. Verflüssigung von Gelatine: nein
7. Toleranz gegen osmotischen Druck mit Salz:
Der Stamm kann bei einer Salzkonzentration bis zu 12 % wachsen.
8. Bildung amyloidaler Substanz: nein
9. Bildung organischer Säure: nein
10. Bildung von Carotinoiden: nein
11. Vitaminerfordernis: Thiamin ist erforderlich.
12. Zersetzung von Arbutin: nein
13. Esterbildung: nein
14. Reaktivität von Lackmusmilch: nein
15. Cycloheximid-Toleranz: ja
16. Extinktionstemperatur: 50°C
e) Saccharoidfermentation: nein
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t) Assimilation von Kohlenstoffquellen!
D^Glucose D^GalactOse L*-SörbOse
Saccharose Maltose Cellobiose irehalOse
Lactose Melibiose fcaffinose Melezitose Inulin
lösliche Stärke D-XylOse L"Arabiöse
D-Ärabinose D-Riböse L-Rhamnose
Äthanol Glycerin Erythrit Adönit Garactit D-Mannit
D-Glueit u, -Methyl-D-glucosid
Salicin Arbutin DL-Lactat Citrat Suceinat
Inosit D-Mannose D-Fruetose Kaliumglueonat
bL· -Calciumketoglüconat
Acetat Dextrin
werden die vorstehend beschriebenen Eigenschaften im Vergleich
mit den in "The Yeast. A Taxonomic Study" (1970) von J» Lodder
et al. beschriebenen bewertet, so gehört dieser Stamm zur
Gattung Trichosporon. ϊη dieser Gattung liegt jedoch keine
Spezies vor, die sich mit diesem Stamm identifizieren läßt.
Beispielsweise ist dieser Stamm ähnlieh Trichoepöron cutaneum, einem bekannten Stamm, unterscheidet sich jedoch deutlich von diesem Stamm im Hinblick auf die Assimilation von Inosit, sowie auch im Hinblick auf die SuIfittoleranz, Purfuraltoleranz und
Gattung Trichosporon. ϊη dieser Gattung liegt jedoch keine
Spezies vor, die sich mit diesem Stamm identifizieren läßt.
Beispielsweise ist dieser Stamm ähnlieh Trichoepöron cutaneum, einem bekannten Stamm, unterscheidet sich jedoch deutlich von diesem Stamm im Hinblick auf die Assimilation von Inosit, sowie auch im Hinblick auf die SuIfittoleranz, Purfuraltoleranz und
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die Assimilation von SWL, wie in den folgenden Tabellen I und II
gezeigt.
Daher wurde dieser Stamm als neue Spezies bezeichnet und mit dem Namen Trichosporon JY-155 versehen. Diesem Stamm wurden die
Nummern FERM-P465O und ATCC-20566 zugeordnet, und er wurde im
Fermentation Research Institute, Agency of Insutrial Science and Technology, Japan bzw. bei der American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, USA, hinterlegt.
Stamm | Wachstum beim Sulfitzusatz |
nein | Wachstum beim Zusatz von lose gebundenem Sulfit |
Wachstum beim Furfural- zusatz |
Trichosporon | nein | |||
JY-155, ATCC | 20566 ja | nein | ja | ja |
Trichosporon | cutaneum | nein | ||
IFO-173 | nein | nein | ||
IFO-598 | nein | nein | ||
IFO-1200 | nein | nein | ||
IFO-1489 | nein | nein |
Untersuchungsmethode
Die Untersuchung wurde nach der Untersuchungsmethode für die Assimilation einer Kohlenstoffquelle, einer der mikrobiologischen
Eigenschaften durchgeführt. Zu einem Kulturmedium, das 1 % Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt, wurden 0,5 % (Gew./Vol.)
Na3SO3 als Sulfit oder 2 % (Vol/Vol.) einer gemischten Lösung
von 1 Mol Natriumbisulfit als lose gebundenes Sulfit und 0,3 Mol
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Formaldehyd und 0,3 Mol Acetaldehyd oder 0,1 % (Gew./Vol.) Furfural gefügt. Die Trübung wurde mit dem bloßen Auge bewertet,
um festzustellen, ob der Stamm gewachsen war oder nicht.
Tabelle II +)
Assimilation von SWL
Stamm Zuckerverbrauch Konzentration der
gebildeten Zellen % g/l
9,7
0,6 0,7 0,3 0,9
Trxchosporon | 77,3 |
JY-155 ATCC 20566 | |
Trichosporon cutaneum | 4,2 |
IFO-173 | 6,3 |
IFO-598 | 2,1 |
IFO-1200 | 5,0 |
IFO-1489 | |
Untersuchungsmethode
In einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben wurden 50 ml eines Kulturmediums
gefügt, das 1 % Glucose, 0,15 % Harnstoff, 0,15 % KH2PO4, 0,02 %
MgSO4.7H2O, 0,01 % CaCl2.2H2O, 0,01 % NaCl und 0,2 % pulverisierten
Hefeextrakt enthielt. Das Kulturmedium wurde mit jedem der vorstehenden Stämme inokuliert, und es wurde eine einleitende
Kultur unter 24stündigem Schütteln bei 30°C durchgeführt. Anschließend wurde SWL zur Erzielung einer Zuckerausgangskonzentration
von 1,4 % verdünnt. Die so verdünnte SWL wurde zu einer Substanz gefügt, die die gleiche Zusammensetzung hatte, wie das
einleitende Kulturmedium, mit Ausnahme von Glucose, wodurch ein
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SWL enthaltendes Kulturmedium hergestellt wurde. Zu diesem Kulturmedium
wurden 5 ml der einleitenden Kulturbrühe gefügt/ und die Kultivierung erfolgte unter den gleichen Bedingungen, wie die
einleitende Kultivierung.
Es kann jedes Trichosporon JY-155, das mittels verschiedener
künstlicher Modifiziermittel modifiziert wurde, verwendet werden, wenn es zur Erzeugung von Coenzym Q10 unter Verwendung von SWL
fähig ist.
Die Kultivierungsbedingungen, unter denen SWL als Ausgangsmaterial
zur Kultivierung von Trichosporon JY-155 verwendet wird, wurden eingehend untersucht. Erfindungsgemäß wird SWL als solches
oder nach geeigneter Verdünnung auf eine Zuckerkonzentration von 0,5 - 4 % (berechnet als Glucose) verwendet. Es können
jegliche Kulturmedien verwendet werden, die hergestellt werden durch Zusatz einer assimilierbaren Stickstoffquelle, anderer
anorganischer Salze und Vitamine zu der vorstehenden SWL. Beispiele für Stickstoffquellen sind wässriges Ammoniak, Ammonium-Salze
(Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw.), Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt und andere anorganische oder organische, Stickstoff
enthaltende Substanzen. Andere anorganische Salze schliessen Phosphat, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensaize, Mangansalze,
Natriumchlorid, Kaliumchlorid und gegebenenfalls Salze von Spurenmetallen ein. Wachstumspromotoren umfassen Vitamine,
Aminosäuren,Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit usw.
Die Kultivierung erfolgt durch aerobes Schütteln oder durch Rühren unter Luftzufuhr. Die Kultivierungstemperatur liegt
vorzugsweise im Bereich von 25 - 37°C. Der pH-Wert für die Kultivierung wird im Bereich von 4-8 gehalten. Bei der Kultivierung
kann es sich entweder um den ansatzweisen Typ (10 Stunden bis 5 Tage Kultivierungszeitraum) oder um den kontinuierlichen
Typ handeln. Letzterer ist für die Kultivierung in industriellem Maßstab bevorzugt.
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MikroorganismenzeIlen werden aus der Kulturbrühe durch eine
Methode wie Zentrifugieren, Filtrieren usw. abgetrennt. In den so erhaltenen Zellen ist das Coenzym Q enthalten und angehäuft.
Nach dem Trocknen und den anderen Behandlungen der Zellen kann das Coenzym Q zusammen mit den Zellen verwendet werden,
für Ernährungszwecke, medizinische und andere Zwecke.
Die Zellen, aus denen Coenzym Q10 abgetrennt werden soll, können
lebende Zellen, trockene Zellen oder behandelte Zellen sein. Die Abtrennung des Coenzyms Q10 aus den Zellen kann nach jeglicher
üblicher Verfahrensweise erfolgen. Beispielsweise wird zur Extraktion des Coenzym Q10 die in den Zellen enthaltene verseifbare
Substanz unter Anwendung von Möthanol-Alkali oder Äthanol-Alkali in Anwesenheit von Pyrogallol verseift. Das Coenzym Q10 aus der
so verseiften Flüssigkeit wird in einem Lösungsmittel, wie η-Hexan oder Petroläther gelöst. Anschließen führt man eine
fraktionierte Raffination unter Verwendung von Aluminiumoxid, Siliciumdioxidgel, Florizil oder dgl. durch, und anschließend
wird mehrfach umkristallisiert, um reine Kristalle von Coenzym Q10 zu erhalten.
Im folgenden wird die Erfindung durch ein Beispiel erläutert.
Ein 500 ml-Sakaguchi-Kolben, in dem 50 ml eines Kulturmediums
enthalten waren, das 1 % Glucose, 0,15 % Harnstoff, 0,15 % KH2PO4, 0,02 % MgSO4.7H2O, 0,01 % CaCl2-2H2O, 0,01 % NaCl und
O,2 % pulverisierten Hefeextrakt enthielt (pH 5,5), wurde mit
Trichosporon JY-155 (FERM-P465O, ATCC 20566) inokuliert. Eine
einleitende Kultivierung wurde unter Schütteln während 24 Stunden bei 30 C vorgenommen, und die so erhaltene Kulturbrühe wurde
in ein Kulturmedium in einen 30 1-Fermentationsbehälter in
einer Menge von 5 % gefügt. SWL wurde verdünnt zur Einstellung der Zuckerkonzentration auf 10 g pro 1, und die ursprüngliche
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Zusammensetzung des SWL-Mediums für die ansatzweise Kultur wurde
durch Zusatz von 0,15 % Ammoniumsulfat, 0,15 % KH-PO-, O,O2 %
MgSO4.7H2O, 0,01 % NaCl und 0,05 % pulverisierten Hefeextrakt
bereitet. Die Kultur wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt. Kultivierungstemperatur 32°C; Luftbeschickungsgeschwindigkeit
18 1 pro Minute; Rotationsgeschwindigkeit 410 Umdrehungen pro Minute; Menge des flüssigen Mediums im Behälter 18 1;
pH-Wert 5,1. Wenn das Wachstum der Hefe in die logarithmische Phase eintrat, wurde eine kontinuierliche Kultur durchgeführt,
unter kontinuierlicher Beschickung des SWL-Mediums. Der Vorrat des SWL-Mediums wies den gleichen Gehalt an anorganischen Salzen
auf, wie das Medium zur ansatzweisen Kultur, hatte eine Zuckerkonzentration von 30 g pro 1 in der SWL und 2 ppm Thiamin-Hydrochlorid
wurden anstelle des pulverisierten Hefeextrakts zugesetzt. Die Kultur wurde durch Aufrechterhaltung eines 7O %igen
Zuckerverbrauchs gesteuert, und so wurde der stabile Zustand erreicht. Zu diesem Zeitpunkt betrug die Hefekonzentration in
dem Behälter etwa 1,3 %. Durch Zentrifugieren von 30 1 der aus dem Fermentationsbehälter überströmenden Brühe wurden 1820 g
nasse Zellen erhalten (entsprechen 337 g trockene Zellen). In diesen Zellen waren 840 mg Coenzym Q10 pro 1 g trockene Zellen
enthalten. Diese Zellen wurden mit 3,6 1 Methanol, 18Og Pyrogallol
und 900 ml 60 %igem Kaliumhydroxid vermischt, und das Gemisch wurde 1 Stunde unter Erwärmen auf 80°C unter Rückfluß
gehalten. Nach dem Abkühlen des Gemische wurde die Coenzym Q10
enthaltende Fraktion zweimal mit 3 1 η-Hexan extrahiert und in einer Schicht von η-Hexan gelöst. Das n-Hexan,in dem die das
Coenzym Q1 enthaltende Fraktion gelöst war, wurde mit Wasser
bis zur Neutralität gewaschen und wurde anschließend mit Glauber-Salz
getrocknet, worauf konzentriert und verdampft wurde. Der Rückstand wurde in Aceton gelöst, das Aceton wurde durch Verdampfen
entfernt, und der Rückstand wurde in η-Hexan gelöst. Diese Lösung wurde in einerSiliciumdioxidgelsäule entwickelt,
unter Verwendung eines Gemischs von Äther und η-Hexan, und das Coenzym Q1 enthaltende Eluat wurde durch Fraktionieren gesammelt.
Das Lösungsmittel diesesEluats wurde durch Verdampfen
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entfernt. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge Äthanol gelöst und an einem kühlen Ort stehengelassen.
Es fielen rohe Kristalle von Coenzym Q. aus.· Durch dreimalige
Wiederholung der ümkristallisation aus Äth^sfoi erhielt man 106 mg
Kristalle des Coenzyms Q10- Diese Verbindung zeigte einen Schmelzpunkt
von 48 - 50 C und wurde durch Dünnschichtchromatographie, Flüssigkeitschromatographie, UV-Absorptionsspektrum und Massenspektrum
als Coenzym Q10 bestätigt.
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Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q10/ dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Mikroorganismus JY-155, der der
Gattung Trichosporon angehört (FERM-P465O, ATCC 20566), in einem Kulturmedium kultiviert, das Sulfitablauge als Kohlenstoffquelle enthält, bis das Coenzym Q1 gebildet und in der Kultur wesentlich angehäuft ist und das Coenzym Q10 daraus gewinnt.
Gattung Trichosporon angehört (FERM-P465O, ATCC 20566), in einem Kulturmedium kultiviert, das Sulfitablauge als Kohlenstoffquelle enthält, bis das Coenzym Q1 gebildet und in der Kultur wesentlich angehäuft ist und das Coenzym Q10 daraus gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Sulfitablauge eine Sulfitablauge einsetzt, die 0,5 - 4
Gew.-% Zucker, ausgedrückt als Glucosidgehalt, enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium einsetzt, das zusammen mit der Sulfitablauge
eine Stickstoffquelle und anorganisches Salz enthält.
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DE2938377C2 DE2938377C2 (de) | 1985-05-02 |
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---|---|---|---|
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- 1978-09-25 JP JP53116732A patent/JPS593197B2/ja not_active Expired
-
1979
- 1979-09-20 US US06/077,430 patent/US4245048A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-09-22 DE DE2938377A patent/DE2938377C2/de not_active Expired
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