DE2938377A1

DE2938377A1 - Verfahren zur herstellung von coenzym q tief 10

Info

Publication number: DE2938377A1
Application number: DE19792938377
Authority: DE
Inventors: Kunio Hata; Isao Kano; Motoi Matsui; Kihachiro Ohshima; Tadaaki Sato
Original assignee: Jujo Paper Co Ltd
Current assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd
Priority date: 1978-09-25
Filing date: 1979-09-22
Publication date: 1980-05-29
Also published as: US4245048A; JPS593197B2; JPS5548397A; DE2938377C2

Description

T 51 980

Anmelder: JUJO PAPER COMPANY LIMITED

No. 4-1, 1-chome, Ohji, Kita-ku Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung von Coenzym

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q₁₀- Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q₁₀ durch Kultivieren eines Mikroorganismus¹ JY-155, der der Gattung Trichosporon (FERM-P46 5O, ATCC 20566) angehört, in einem Kulturmedium, das Sulfitablauge (nachfolgend als "SWL" bezeichnet) als Kohlenstoffquelle enthält und Gewinnen des erzeugten Coenzyms Q_1o· Dieser Mikroorganismus JY-155 gehört der Hefe an und der Stamm JY-155 kann Coenzym Q₁₀ in seiner Zelle erzeugen und anreichern. Darüber hinaus kann dieser Stamm in einem SWL enthaltenden Kulturmedium gezogen werden.

Coenzym Q_1n ist eine Verbindung, die durch die folgende Formel dargestellt wird und eine wichtige Rolle als ein Element des Elektronenübertragungssystems in einem Organismus spielt.

CH₃

- (CH₂CH = C-CH₂J₁₀H

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Es ist bekannt, daß diese Verbindung eine ausgezeichnete pharmazeutische Wirkung bei verschiedenen Erkrankungen aufweist. In den letzten Jahren wurde sie klinisch zur Heilung von Herzinsuffizienzen durch orale Verabreichung verwendet.

Diese Verbindung wird industriell entweder über ein halbsynthetisches Verfahren hergestellt, bei dem ein Material verwendet wird, das in Pflanzen vorkommt, oder durch ein Fermentationsverfahren, bei dem die Verbindung aus Mikroben-Zellen extrahiert wird. Im Falle des Fermentationsverfahrens liegt eine der Bedingungen zur Verwirklichung einer vorteilhaften industriellen Produktion darin, Mikrobenzellen, die Coenzym Q₁ enthalten, mit niedrigen Kosten herzustellen, da die Menge des in den Mikrobenzellen angehäuften Coenzyms Q_1Q gering ist.

Was die Extraktionsmethode des Coenzyms Q₁₀ aus Mikroorganismen betrifft, insbesondere aus Hefe und dgl., wird auf die japanische Patentveröffentlichung Nr. 8836/1973, auf die japanische Patentveröffentlichung Nr. 19034/1976 und auf die offengelegte japanische Patentveröffentlichung Nr. 105288/1977 hingewiesen. Ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q₁₀/ das durch die Verwendung höherer Fettsäuren als ein Substrat bei der Kultivierung von Hefe charakterisiert ist, wird in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 4758/1975 beschrieben.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auf SWL als ein kostengünstiges Material zur Herstellung von Mikrobenzellen, die Coenzym Q₁₀ enthalten, zurückgegriffen.

Bekanntlich ist SWL eine Ablauge, die beim Verkochen von Holz erhalten wird, wobei diese Ablauge bei dem Verfahren zur Herstellung von Sulfitzellstoff bzw. Sulfitpulpe als Abstrom erhalten wird. Historisch wurde sie zur Herstellung von Hefe verwendet, die für Nahrungs- und Futtermittel ausgenutzt wurde, und sie wird kürzlich als ein Ausgangsmaterial zur Herstellung von Hefe der Gattung Torula verwendet, aus der wirksame Bestandteile, wie Nukleinsäure und Glutathion extrahiert werden. In der

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SWL liegen Saccharoide, Essigsäure und Alkohole vor, die zur Kultivierung von Hefe geeignet sind. Andererseits liegen auch viele Substanzen vor, die das Wachstum der Hefe inhibieren, wie Schwefligesäure, Zersetzungsprodukte von Lignin, Furfural, Ameisensäure und lose gebundenes Sulfit. Daher ist im allgemeinen die Eignung von SWL als Kulturmedium für Hefe gering, und die Hefearten, die ineinen Kulturmedium wachsen können, das SWL als eine Haupt-Kohlenstoffquelle enthält, sind begrenzt. D. h. lediglich die Gattung Torula und dgl. werden in dem Medium in industriellem Maßstab kultiviert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden nunmehr Mikroorganismen gefunden, die Coenzym Q₁₀ enthalten und SWL assimilieren können. Es hat sich gezeigt,daß in der Natur der Hefestamm JY-155 erhalten werden kann, der in dem Kulturmedium, das SWL enthält, eine wesentlich höhere Wachstumsgeschwindigkeit als Kulturen bekannten Typs aufweist, für eine langzeitige kontinuierliche Kultivierung geeignet sein kann und eine beträchtliche Menge an Coenzym Q₁ in seinen Zellen akkumuliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden genauer beschrieben.

Zunächst ist der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus ein Stamm JY-155, der der Gattung Trichosporon angehört, der im Rahmen der vorliegenden Erfindung aus Erdboden gewonnen wurde. Dieser Stamm kann in dem SWL als eine Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Kulturmedium kräftig wachsen und akkumuliert Coenzym Q₁₀ in seinen Zellen. Der Stamm weist folgende mikrobiologischen Eigenschaften auf.

a) Wachstum in Kulturmedium

1. Malzextraktmedium (flüssig)

Die Sprossung ist polypolar. Es bildet sich ein Film. Die

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Form stellt ein längliches Ellipsoid von 2,2-6,5 ^m (Mikron) auf 6,7 - 16,2 Ann (Mikron) dar.

2. MY-Agarmedium

Das Wachstum ist kräftig. Der Rand der Kolonie ist wellenförmig. Die Elevation der Kolonie ist kegelförmig oder konvex.Im Zentrum der Kolonie liegt eine Höhlung vor. Die Oberfläche der Kolonie ist rauh und der überzug bzw. Glanz der Kolonie ist kreideartig. Die Beschaffenheit der Kolonie ist zäh.

3. Streichkultur auf Kartoffelextrakt-Agarmedium

Mycelium und Pseudomycelium werden gebildet, und Keimspore und Oidium werden gebildet.

4. Streichkultur auf MY-Agarmedium
Endosporenbildung.

b) Ascosporenbildung
Keine Ascosporenbildung.

c) Bildung projektiver Sporen
Projektive Sporen werden nicht gebildet

d) Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Bedingung
pH: 5-7
Temperatur: 27 - 35°C

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2. Wachstumsbereich
pH: 3 - 11,5
Temperatur: 15 - 45 C

3. Assimilation von Nitrat: nein

4. Zersetzung von Fett: nein

5. Zersetzung von Harnstoff: ja

6. Verflüssigung von Gelatine: nein

7. Toleranz gegen osmotischen Druck mit Salz:

Der Stamm kann bei einer Salzkonzentration bis zu 12 % wachsen.

8. Bildung amyloidaler Substanz: nein

9. Bildung organischer Säure: nein

10. Bildung von Carotinoiden: nein

11. Vitaminerfordernis: Thiamin ist erforderlich.

12. Zersetzung von Arbutin: nein

13. Esterbildung: nein

14. Reaktivität von Lackmusmilch: nein

15. Cycloheximid-Toleranz: ja

16. Extinktionstemperatur: 50°C

e) Saccharoidfermentation: nein

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t) Assimilation von Kohlenstoffquellen!

D^Glucose D^GalactOse L*-SörbOse Saccharose Maltose Cellobiose irehalOse Lactose Melibiose fcaffinose Melezitose Inulin lösliche Stärke D-XylOse L"Arabiöse D-Ärabinose D-Riböse L-Rhamnose Äthanol Glycerin Erythrit Adönit Garactit D-Mannit

D-Glueit u, -Methyl-D-glucosid Salicin Arbutin DL-Lactat Citrat Suceinat Inosit D-Mannose D-Fruetose Kaliumglueonat bL· -Calciumketoglüconat Acetat Dextrin

werden die vorstehend beschriebenen Eigenschaften im Vergleich mit den in "The Yeast. A Taxonomic Study" (1970) von J» Lodder et al. beschriebenen bewertet, so gehört dieser Stamm zur
Gattung Trichosporon. ϊη dieser Gattung liegt jedoch keine
Spezies vor, die sich mit diesem Stamm identifizieren läßt.
Beispielsweise ist dieser Stamm ähnlieh Trichoepöron cutaneum, einem bekannten Stamm, unterscheidet sich jedoch deutlich von diesem Stamm im Hinblick auf die Assimilation von Inosit, sowie auch im Hinblick auf die SuIfittoleranz, Purfuraltoleranz und

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die Assimilation von SWL, wie in den folgenden Tabellen I und II gezeigt.

Daher wurde dieser Stamm als neue Spezies bezeichnet und mit dem Namen Trichosporon JY-155 versehen. Diesem Stamm wurden die Nummern FERM-P465O und ATCC-20566 zugeordnet, und er wurde im Fermentation Research Institute, Agency of Insutrial Science and Technology, Japan bzw. bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt.

Tabelle

Stamm	Wachstum beim Sulfitzusatz	nein	Wachstum beim Zusatz von lose gebundenem Sulfit	Wachstum beim Furfural- zusatz
Trichosporon		nein
JY-155, ATCC	20566 ja	nein	ja	ja
Trichosporon	cutaneum	nein
IFO-173	nein	nein
IFO-598	nein	nein
IFO-1200	nein	nein
IFO-1489	nein	nein

Untersuchungsmethode

Die Untersuchung wurde nach der Untersuchungsmethode für die Assimilation einer Kohlenstoffquelle, einer der mikrobiologischen Eigenschaften durchgeführt. Zu einem Kulturmedium, das 1 % Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt, wurden 0,5 % (Gew./Vol.) Na₃SO₃ als Sulfit oder 2 % (Vol/Vol.) einer gemischten Lösung von 1 Mol Natriumbisulfit als lose gebundenes Sulfit und 0,3 Mol

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Formaldehyd und 0,3 Mol Acetaldehyd oder 0,1 % (Gew./Vol.) Furfural gefügt. Die Trübung wurde mit dem bloßen Auge bewertet, um festzustellen, ob der Stamm gewachsen war oder nicht.

Tabelle II ⁺⁾

Assimilation von SWL

Stamm Zuckerverbrauch Konzentration der

gebildeten Zellen % g/l

9,7

0,6 0,7 0,3 0,9

Trxchosporon	77,3
JY-155 ATCC 20566
Trichosporon cutaneum	4,2
IFO-173	6,3
IFO-598	2,1
IFO-1200	5,0
IFO-1489

Untersuchungsmethode

In einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben wurden 50 ml eines Kulturmediums gefügt, das 1 % Glucose, 0,15 % Harnstoff, 0,15 % KH₂PO₄, 0,02 % MgSO₄.7H₂O, 0,01 % CaCl₂.2H₂O, 0,01 % NaCl und 0,2 % pulverisierten Hefeextrakt enthielt. Das Kulturmedium wurde mit jedem der vorstehenden Stämme inokuliert, und es wurde eine einleitende Kultur unter 24stündigem Schütteln bei 30°C durchgeführt. Anschließend wurde SWL zur Erzielung einer Zuckerausgangskonzentration von 1,4 % verdünnt. Die so verdünnte SWL wurde zu einer Substanz gefügt, die die gleiche Zusammensetzung hatte, wie das einleitende Kulturmedium, mit Ausnahme von Glucose, wodurch ein

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SWL enthaltendes Kulturmedium hergestellt wurde. Zu diesem Kulturmedium wurden 5 ml der einleitenden Kulturbrühe gefügt/ und die Kultivierung erfolgte unter den gleichen Bedingungen, wie die einleitende Kultivierung.

Es kann jedes Trichosporon JY-155, das mittels verschiedener künstlicher Modifiziermittel modifiziert wurde, verwendet werden, wenn es zur Erzeugung von Coenzym Q₁₀ unter Verwendung von SWL fähig ist.

Die Kultivierungsbedingungen, unter denen SWL als Ausgangsmaterial zur Kultivierung von Trichosporon JY-155 verwendet wird, wurden eingehend untersucht. Erfindungsgemäß wird SWL als solches oder nach geeigneter Verdünnung auf eine Zuckerkonzentration von 0,5 - 4 % (berechnet als Glucose) verwendet. Es können jegliche Kulturmedien verwendet werden, die hergestellt werden durch Zusatz einer assimilierbaren Stickstoffquelle, anderer anorganischer Salze und Vitamine zu der vorstehenden SWL. Beispiele für Stickstoffquellen sind wässriges Ammoniak, Ammonium-Salze (Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw.), Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt und andere anorganische oder organische, Stickstoff enthaltende Substanzen. Andere anorganische Salze schliessen Phosphat, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensaize, Mangansalze, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und gegebenenfalls Salze von Spurenmetallen ein. Wachstumspromotoren umfassen Vitamine, Aminosäuren,Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit usw.

Die Kultivierung erfolgt durch aerobes Schütteln oder durch Rühren unter Luftzufuhr. Die Kultivierungstemperatur liegt vorzugsweise im Bereich von 25 - 37°C. Der pH-Wert für die Kultivierung wird im Bereich von 4-8 gehalten. Bei der Kultivierung kann es sich entweder um den ansatzweisen Typ (10 Stunden bis 5 Tage Kultivierungszeitraum) oder um den kontinuierlichen Typ handeln. Letzterer ist für die Kultivierung in industriellem Maßstab bevorzugt.

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MikroorganismenzeIlen werden aus der Kulturbrühe durch eine Methode wie Zentrifugieren, Filtrieren usw. abgetrennt. In den so erhaltenen Zellen ist das Coenzym Q enthalten und angehäuft. Nach dem Trocknen und den anderen Behandlungen der Zellen kann das Coenzym Q zusammen mit den Zellen verwendet werden, für Ernährungszwecke, medizinische und andere Zwecke.

Die Zellen, aus denen Coenzym Q₁₀ abgetrennt werden soll, können lebende Zellen, trockene Zellen oder behandelte Zellen sein. Die Abtrennung des Coenzyms Q₁₀ aus den Zellen kann nach jeglicher üblicher Verfahrensweise erfolgen. Beispielsweise wird zur Extraktion des Coenzym Q₁₀ die in den Zellen enthaltene verseifbare Substanz unter Anwendung von Möthanol-Alkali oder Äthanol-Alkali in Anwesenheit von Pyrogallol verseift. Das Coenzym Q₁₀ aus der so verseiften Flüssigkeit wird in einem Lösungsmittel, wie η-Hexan oder Petroläther gelöst. Anschließen führt man eine fraktionierte Raffination unter Verwendung von Aluminiumoxid, Siliciumdioxidgel, Florizil oder dgl. durch, und anschließend wird mehrfach umkristallisiert, um reine Kristalle von Coenzym Q₁₀ zu erhalten.

Im folgenden wird die Erfindung durch ein Beispiel erläutert.

Beispiel

Ein 500 ml-Sakaguchi-Kolben, in dem 50 ml eines Kulturmediums enthalten waren, das 1 % Glucose, 0,15 % Harnstoff, 0,15 % KH₂PO₄, 0,02 % MgSO₄.7H₂O, 0,01 % CaCl₂-2H₂O, 0,01 % NaCl und O,2 % pulverisierten Hefeextrakt enthielt (pH 5,5), wurde mit Trichosporon JY-155 (FERM-P465O, ATCC 20566) inokuliert. Eine einleitende Kultivierung wurde unter Schütteln während 24 Stunden bei 30 C vorgenommen, und die so erhaltene Kulturbrühe wurde in ein Kulturmedium in einen 30 1-Fermentationsbehälter in einer Menge von 5 % gefügt. SWL wurde verdünnt zur Einstellung der Zuckerkonzentration auf 10 g pro 1, und die ursprüngliche

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Zusammensetzung des SWL-Mediums für die ansatzweise Kultur wurde durch Zusatz von 0,15 % Ammoniumsulfat, 0,15 % KH-PO-, O,O2 % MgSO₄.7H₂O, 0,01 % NaCl und 0,05 % pulverisierten Hefeextrakt bereitet. Die Kultur wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt. Kultivierungstemperatur 32°C; Luftbeschickungsgeschwindigkeit 18 1 pro Minute; Rotationsgeschwindigkeit 410 Umdrehungen pro Minute; Menge des flüssigen Mediums im Behälter 18 1; pH-Wert 5,1. Wenn das Wachstum der Hefe in die logarithmische Phase eintrat, wurde eine kontinuierliche Kultur durchgeführt, unter kontinuierlicher Beschickung des SWL-Mediums. Der Vorrat des SWL-Mediums wies den gleichen Gehalt an anorganischen Salzen auf, wie das Medium zur ansatzweisen Kultur, hatte eine Zuckerkonzentration von 30 g pro 1 in der SWL und 2 ppm Thiamin-Hydrochlorid wurden anstelle des pulverisierten Hefeextrakts zugesetzt. Die Kultur wurde durch Aufrechterhaltung eines 7O %igen Zuckerverbrauchs gesteuert, und so wurde der stabile Zustand erreicht. Zu diesem Zeitpunkt betrug die Hefekonzentration in dem Behälter etwa 1,3 %. Durch Zentrifugieren von 30 1 der aus dem Fermentationsbehälter überströmenden Brühe wurden 1820 g nasse Zellen erhalten (entsprechen 337 g trockene Zellen). In diesen Zellen waren 840 mg Coenzym Q₁₀ pro 1 g trockene Zellen enthalten. Diese Zellen wurden mit 3,6 1 Methanol, 18Og Pyrogallol und 900 ml 60 %igem Kaliumhydroxid vermischt, und das Gemisch wurde 1 Stunde unter Erwärmen auf 80°C unter Rückfluß gehalten. Nach dem Abkühlen des Gemische wurde die Coenzym Q₁₀ enthaltende Fraktion zweimal mit 3 1 η-Hexan extrahiert und in einer Schicht von η-Hexan gelöst. Das n-Hexan,in dem die das Coenzym Q₁ enthaltende Fraktion gelöst war, wurde mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und wurde anschließend mit Glauber-Salz getrocknet, worauf konzentriert und verdampft wurde. Der Rückstand wurde in Aceton gelöst, das Aceton wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in η-Hexan gelöst. Diese Lösung wurde in einerSiliciumdioxidgelsäule entwickelt, unter Verwendung eines Gemischs von Äther und η-Hexan, und das Coenzym Q₁ enthaltende Eluat wurde durch Fraktionieren gesammelt. Das Lösungsmittel diesesEluats wurde durch Verdampfen

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entfernt. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge Äthanol gelöst und an einem kühlen Ort stehengelassen.

Es fielen rohe Kristalle von Coenzym Q. aus.· Durch dreimalige Wiederholung der ümkristallisation aus Äth^sfoi erhielt man 106 mg Kristalle des Coenzyms Q₁₀- Diese Verbindung zeigte einen Schmelzpunkt von 48 - 50 C und wurde durch Dünnschichtchromatographie, Flüssigkeitschromatographie, UV-Absorptionsspektrum und Massenspektrum als Coenzym Q₁₀ bestätigt.

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ORIGINAL INSPECTED

Claims

T 51 980 Anmelder: JUJO PAPER COMPANY LIMITED No. 4-1, 1-chome, Ohji, Kita-ku, Tokyo, Japan Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q₁₀/ dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus JY-155, der der
Gattung Trichosporon angehört (FERM-P465O, ATCC 20566), in einem Kulturmedium kultiviert, das Sulfitablauge als Kohlenstoffquelle enthält, bis das Coenzym Q₁ gebildet und in der Kultur wesentlich angehäuft ist und das Coenzym Q₁₀ daraus gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Sulfitablauge eine Sulfitablauge einsetzt, die 0,5 - 4 Gew.-% Zucker, ausgedrückt als Glucosidgehalt, enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium einsetzt, das zusammen mit der Sulfitablauge eine Stickstoffquelle und anorganisches Salz enthält.