DE2056376C3 - Verfahren zur Herstellung von Zearalenon - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Zearalenon

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Description

Aus der US-PS 3196 019 ist ein Verfahren zur Herstellung von Zearalenon der Formel
HO
ο U CH3 \ /
OH Il I C=O -(CH2),
ι C- ί~*λ T
I
Λ/ I = CH
ϊ
CV
-CH2
durch Züchtung des Mikroorganismus Gibberella zeae (Gordon) bekannt. Dieses Verfahren erfordert ein festes Fermentationsmedium, mit dem die Aufarbeitung schwieriger ist als bei einem flüssigen Fermentationsmedium, in weichern die Mikroorganismen submers gezüchtet werden. Bisher blieben jedoch Versuche zur Herstellung von Zearalenon durch submerse Züchtung eines Mikroorganismus erfolglos.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zur Herstellung von Zearalenon durch submerse Züchtung eines Mikroorganismus in einem flüssigen Fermentationsmedium zu bekommen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Zearalenon durch Züchtung eines aeroben Stammes von Gibberella zeae in einem Fermentationsmedium, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralstoffe enthält, ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Gibberalla zeae (Schw.) Petch-Stamm 542 Keith ( = ATCC 20 273) oder Gibberella zeae (Schw.) Petch-Stamm Paul S. (= ATCC 20 271) einsetzt und daß man diese Stämme unter submersen Bedingungen in einem bewegten, belüfteten und wäßrigen Fermentationsmedium in flüssiger Phase züchtet.
Vorzugsweise wird zur Herstellung des Fermentationsmediums destilliertes Wasser, entionisiertes Wasser oder Leitungswasser, das zum Sieden erhitzt und dann filtriert wurde, verwendet. Die Belüftung erfolgt zweckmäßig durch Hindurchleiten von Luft, insbesondere steriler Luft, vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,25 bis 2 Volumenteilen Luft, gemessen bei Normaldruck pro Volumenteil Medium pro Minute, durch das Fermentationsmedium. Die Temperatur des Fermentationsmediums wird vorzugsweise auf etwa 20 bis 28, besonders auf etwa 21 bis 240C, gehalten. Während der frühen Stadien der Züchtung, beispielsweise vor Beginn der Zearalenon-Produktion, sollte die Temperatur möglichsi nicht weit über 24°C ansteigen. Das Fermentationsmedium wird bewegt, um die Luft zu verteilen und dem Mikroorganismus zuzuführen. Dies kann in bliebiger Weise erfolgen, beispielsweise unter Verwendung eines Rührers, der in einem 20 Liter-Gärbehälter mit etwa 200 bis 500 U/Min arbeitet
Die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff besteht zweckmäßig aus Glucose, z. B. Glucose p. A. oder Cerulose, einer weißen, kristallinen raffinierten Glucose.
ίο Ferner sind, wenn auch weniger bevorzugt, andere Kohlenhydrate brauchbar, die die Zearalenonproduktion nicht nachteilig beeinflussen, wie z. B. Xylose, Fructose, Saccharose und Galactose. Xylose wirkt besser, wenn man sie nicht als einzige Kohlenstoffquelle, sondern im Gemisch mit Glucose einsetzt (beispielsweise 7,5 Gewichtsteile Xylose und 22,5 Gewichtsteile Glucose). Falls erwünscht, kann auch ein Teil der Glucose, beispielsweise bis zu etwa 50 Gewichtsprozent, durch Glycerin ersetzt werden. Anstelle der Glucose kann man auch ein Glucosevorprodukt, wie Stärke, welches unter den Verfahrensbedingungen in Glucose umgewandelt wird, verwenden. Glucose wird beispielsweise in Mengen von etwa 20 bis 40, vorzugsweise etwa 25 bis 35 g/100 ml Medium zugesetzt.
Die Quelle für assimilierbaren Stickstoff kann anorganischer oder bevorzugt organischer Natur sein. Im allgemeinen eignen sich Ammoniak liefernde, leicht hydrolysierbare neutrale Verbindungen, wie Harnstoff, Asparagin, Ammoniumsalze, wie Ammoniumnitrat und Ammoniumfumarat, Glutamin, Glycin, Ammoniumhydroxid und Proteinhydrolysat. Die bevorzugte Stickstoffquelle ist Harnstoff, und dieser wird im allgemeinen in Mengen von etwa 0,2 bis 0,8, vorzugsweise von etwa 0,3 bis 0,7 g/100 ml Fermentationsmedium eingesetzt.
Die Mineralstoffquelle umfaßt die Elemente Eisen, Phosphor, Kalium, Schwefel und Magnesium, vorzugsweise in wasserlöslicher Form. Im allgemeinen liegt die wirksame Menge dieser Elemente, berechnet für das freie Element, zwischen etwa 0,001 und lg/100 ml Medium. Bevorzugte Mineralsloffquellen sind z. B. Dikaliumphosphat (d.h. K2HPO4), Magnesiumsulfat (z. B. in Form von MgSO« · 7 H2O), Kaliumchlorid und als Quelle für Eisen, Schwefel und Phosphor, das bereits oben genannte Proteinhydrolysat. Das Kaliumchlorid kann gleichzeitig den osmotischen Druck steigern, wie noch eingehender erläutert wird. Die bevorzugte Menge an Dikaliumphosphat liegt bei etwa 0,05 bis 0,3 g/100 ml Fermentationsmedium, und die bevorzugte Menge an Magnesiumsulfat (berechnet aus MgSO4 · 7 HjO) bei etwa 0,025 bis 0,2 g/100 ml Fermentationsmedium. Der Zusatz von Eisen ist insbesondere erwünscht, wenn die Kohlenstoffquelle aus analysenreiner Glucose besteht.
Vorzugsweise enthält das Fermentationsmedium ausbeutesteigernde Mengen eines Proteinhydrolysats, z. B. eines enzymatischen Proteinhydrolysats, und vorzugsweise eines enzymatischen Caseinhydrolysats. Ein Beispiel hierfür ist ein Pancreas-Hydrolysat von Casein, das sämtliche ursprünglich in Casein vorhande-
bo nen Aminosäuren in Form eines Gemisches aus Aminosäuren und Peptiden enthält. Das Hydrolysat liegt vorzugsweise in Mengen von mindestens etwa 0,1 g, beispielsweise von 0,1 bis 2 g/100 ml Fermentationsmedium vor. Weniger bevorzugt, jedoch auch
b5 verwendbar anstelle des Hydrolysats sind vitaminfreies Casein und Casein selbst. Die Verwendung eines Enzymhydrolysats empfiehlt sich insbesondere dann, wenn als Kohlenstoffquelle analysenreine Dextrose
verwendet wird.
Es empfiehlt sich ferner, dem Fermentationsmedium einen Hefeextrakt zuzusetzen. Allgemein geeignete Mengen liegen zwischen etwa 0,05 und 0,2 g Hefeextrakt pro 100 ml Fermentationsmedium. Die Zusammensetzung eines beispielshalber verwendeten Hefeextraktes hinsichtlich mineralischer Elemente ist im »Journal of Bacteriology«, Bd. 84, S. 869 (1962), wiedergegeben. Anstelle von Hefeextrakt können dem Medium auch Mais-Glutenmehl, Maiseinweichflüssigkeit, aus Baumwollsamen hergestelltes Protein, ein enzymatisches Abbauprodukt von Proteinen, eine Fraktion von autolysierter Brauereihefe und entfettetes Sojabohnenmehl zugesetzt werden. Hefeextrakt ist jedoch bevorzugt
Ferner kann man dem Medium wachstumafördernde Mengen tierischer Aminosäuren, ~ B. etwa 0,1 bis 03g/lG0ml, in Form von Rindfleischextrakt zusetzen. Ferner wird dem Fermentationsmedium zweckmäßig ein Schauminhibitor, vorzugsweise ein die ZearaJeonon-Produktion nicht nachteilig beeinflussender Inhibitor, zugesetzt Am wenigsten nachteilig für die Zearalenonausbeute sind Schauminhibitoren in Form von Silikonen, z. B. eine nichtionische Silikonemulsion mit etwa 10% Silikonfeststoffen. Weitere brauchbare Schauminhibitoren, die jedoch die Zearalenonausbeute etwas beeinträchtigen, sind z. B. Maisöl, Specköl, Mineralöl und Fettalkohole, wie Laurylalkohol.
Ferner kann man dem Fermentationsmedium ein den osmotischen Druck steigerndes Salz zusetzen. Als Beispiele derartiger Salze seien die Alkalimetallsalze, z. B. Natriumacetat, Natriumeitrat Natriumsuccinat, Natriumchlorid und Kaliumchlorid, genannt. Am meislen bevorzugt man die Alkalimetallhalogenide, z. B. Natriumchlorid und Kaliumchlorid, und diese liegen vorzugsweise in einer Menge von etwa 1 bis 4 g/100 ml Fermantationsmedium vor.
Die Zearalenonausbeute und die Verwertung der Kohlenstoffquelle werden verbessert, wenn nan das Medium vor der Inoculierung durch Autokla^enbehandlung sterilisiert, beispielsweise bei einem Volumen von bis zu 3 1 während etwa 10 bis 30 Minuten bei etwa 0,7 bis 1,4 atü Wasserdampfdruck.
Die Züchtung wird zweckmäßig so lange fortgesetzt bis im wesentlichen sämtlicher assimilierbarer Kohlenstoff verbraucht ist, d. h. im allgemeinen während etwa 5 bis 23 Tagen. Dann wird aus dem Fermentationsmedium das Zearalenon isoliert. Die Aufarbeitung kann auf beliebige Weise erfolgen, beispielsweise durch Filtrieren des Mediums, Aufschlämmung des Filterkuchens mit wäßriger Alkalilösung zwecks Lösen des Zearalenons, Filtrieren der Aufschlämmung, Ansäuern des Filtrats zwecks Ausfällung des Zearalenons, und Gewinnung des ausgefällten Zearalenons. Diese Methode ist in der BE-PS 7 21322 und der FR-PS 15 81430 näher beschrieben.
Der Ausgangs-pH-Wert des Fermentationsmediums liegt gewöhnlich bei etwa 6,1 bis 7,2 und vorzugsweise bei etwa 6,2 bis 7,0. Mit fortschreitender Fermentation nimmt der pH-Wert ab. Im allgemeinen fällt er innerhalb etwa 2 bis 4 Tagen auf etwa 3,4 bis 4,0, häufig auf etwa 3,6 bis 3,7 ab, und dieser Wert wird während der restlichen Züchtung beibehalten. Werden keine Zusätze zur erneuten Einstellung des pH-Wertes gemacht, so bleibt dieser Wert während der gesamten Fermentationsperiode erhalten. Vorteilhafterweise können sich relativ wenige verunreinigende Organismen bei pH-Werten unterhalb etwa 4 vermehren.
Tryptose 15,0 g/l
Sojamehl 5,0 g/l
Dextrose 5,0 g/l
1-Cystin 0,2 g/l
Natriumchlorid 4,0 g/l
Natriumsulfit 0,2 g/l
Natriumeitrat 1,0 g/l
Agar 15,0 g/l
Rest destilliertes Wasser
Beispiel 1
Herstellung von Gibberella zeae (Schw.)
Petch Stamm 543 Keith (ATCC 20 273)'
Makrokonidien von Gibberella zeae ATCC 20 028 wurden wie folgt mit einem Mutagen behandelt:
Makrokonidien (etwa l,3xlO6/ml wurden in Phosphatpufferlösung von pH 7,0 suspendiert, dann wurde die unbehandelte Kultur mit dem nachstehend beschrie-
!0 benen Medium so verdünnt daß 30 bis 40 Kolonien pro Schale erhalten wurden.
Zusammensetzung des Fermentationsmediums:
Dem geschmolzenen und auf 45° C abgekühlten Fermentationsmedium wurden sodann N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in solcher Menge zugesetzt, daß die Endkonzentration 2 Mikrogramm pro ml betrug.
Gleiche Teile der Konidienverdünnungen wurden zugesetzt und mit dem Medium vermischt und auf Petrischalen gegossen. Die Schalen wurden bei 3O0C inkubiert, bis die Kolonien ausreichend groß waren, um visuell bestimmt zu werden.
Aufgrund der Kolonienmorphologie und der vom Stamm ATCC 20 028 verschiedenen Pigmentierung wurden Zellgruppen ausgelesen und auf Agar-Schrägnährbögen verbracht.
Auf Czapek's Dextrose-Agar folgender Zusammensetzung:
wurden folgende morphologische Eigenschaften der Organismen ermittelt:
Der Organismus ist ein rasch wachsender Fungus, der innerhalb 4 Tagen bei 22 bis 3O0C einen Koloniendurchmesser von 3 bis 7 cm erreicht. In diffusem Licht oder in Dunkelheit bildet sich nahe der Agar-Oberfläche ein kompaktes Luftmycel. Man beobachtet wenig oder kein ausgedehntes watteartiges Luftmycel. Das Zentrum der Kolonie ist dunkelgelb mit Übergang nach rot an den Rändern. Kulturen, die älter sind als 5 Tage, sind normalerweise insgesamt rot. Die Unterseite ist tiefrot aufgrund der Produktion eines wasserunlöslichen Pigmentes.
Normalerweise werden Makrokonidien nicht in der Dunkelheit gebildet, doch tritt bei Belichtung eine starke Bildung ein. Die Makrokonidien entstehen in schleimiger Masse, mit verschiedenen Längen von 10 bis 80 μίτι, mit gewöhnlich 3 bis 5 Scheidewänden und allgemein 0 bis 9 Scheidewänden (Septation). Die Makrokonidien weisen die Form eines Ochsenhoms auf und besitzen häufig eine sichtbare Fußzelle. Ihre Breite
Natriumnitrat 2,0 g/l
Kaliumchlorid 0,5 g/l
Magnesiumsulfat 0,5 g/I
Eisen(5I)-sulfat 0,01 g/l
Dikaliumphosphat 1,0 g/l
Dextrose 50,0 g/l
Agar 15,0 g/l
Rest destilliertes Wasser
ist konstanter, sie liegt zwischen 2,0 und 5,0 μίτι und im allgemeinen bei ca. 4,0 μm. Auf Laboratoriumsmedien wurden weder Mikrokonidien noch Perithecien beobachtet.
In den nachfolgend beschriebenen sporenbildenden Fermentationsmedien entwickeln sich die Makrokonidien reichlich, wobei sie einzeln aus einer einfachen Konidiophore entstehen. Makrokonidien entwickeln sich jedoch nicht in komplexen flüssigen Med'en der ebenfalls nachstehend beschriebenen ArL Die Bildung von Ch'amydosporen überwiegt bei älteren Kulturen, wobei die Sporen sowohl zwischengeschoben wie endständig sind.
Medium zur Makrokonidien-Sporenbildung
Hefeextrakt 1.0 g/l
Kaliumchlorid 0,5 g/l
Magnesiumsulfat 0,5 g/l
Natriumnitrat 0,15 g/i
Eisen(fl)-Sulfat 0,007 g/l
Ammoniumnitrat 0,55 g/l
Dikaliumphosphat 1,0 g/l
Dextrose 5,8 g/l
Rest destilliertes Wasser
komplexes Medium — keil ne Sporenb
Hefeextrakt 1,0 g/l
Kaliumchlorid 0,20 g/l
Magnesiumsulfat 0,25 g/l
Dikaliumphosphat 0,5 g/l
Harnstoff 4,1 g/l
Proteinhydrolysat 3,0 g/l
Cerelose 110,0 g/l
Rest destilliertes Wasser
Vegetatives Mycel oder Sporen werden zweckmäßig bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
100 ml des folgenden Mediums (modifiziertes Bennet-Medium) Cerelose
Proteinhydrolysat
Hefeextrakt
Natriumchlorid
Rest destilliertes Wasser
1,1 g/100 ml Medium 0,4 g/100 ml Medium 0,1 g/100 ml Medium 0,25 g/100 ml Medium
wurden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben verbracht und 15 Minuten lang bei 1,05 atü im Autoklaven behandelt. Dann wurden Sporen von Gibberella zeae (Schw.) Petch Stamm 542 Keith ( = ATCC 20 273) zugesetzt, und es wurde 24 Stunden lang bei 30°C auf der Schüttelmaschine inkubiert. Das resultierende Material wurde zur Inoculierung einer zweiten Portion des obigen Fermentationsnv diums (im Autoklaven behandelt) verwendet, und dieses zweite Fermentationsmedium wurde wiederum 24 Stunden lang bei 300C auf der Schüttelmaschine inkubiert.
Fermentationsmedium
Cerelose
Harnstoff
Hefeextrakt
Proteinhydrolysat
MgSO4 · 7 H2O
K2HPO4
KCI
Rest destilliertes Wasser
33 g/100 ml Medium 0,4 g/100 ml Medium 0,1 g/100 ml Medium 0,3 g/100 ml Medium 0,025 g/100 ml Medium 0,05 g/100 ml Medium 0,025 g/100 ml Medium 100 ml des Fermentationsmediums wurden in einen 500-ml-Kolben gegeben und bei 1,05 atü Wasserdampfdruck 15 Minuten lang im Autoklaven behandelt Als Inoculum wurden dann 100 ecm des vorstehend in zweiter Stufe erhaltenen Materials zugesetzt Das Medium wurde 2 Wochen lang bei 200C auf einer Schüttelmaschine mit 300 U/Min. inkubierL Nach dieser Zeit enthielt das Medium Zearalenon in einer Menge von 15,2 g/l.
Beispiel 2
Zu 1500 ml des modifizierten Mediums nach Bennett (siehe Beispiel 1) in einem 6-1-Erlenmeyerkolben wurden 100 ml eines Impfmaterials von ATCC 20 273 der ersten Stufe, hergeste'it wie in Beispiel 1, zugegeben. Der Kolben wurde dann auf einer Schüttelmaschine bei 300C 24 Stunden lang inkubiert, wobei man das endgültige Inoculum der zweiten Stufe enthielt.
Fermentationsmedium
Hefeextrakt 15,0 g
Proteinhydrolysat 45,0 g
KCl 3,75 g
MgSO4 · 7 H2O 3,75 g
K2HPO4 7,5 g
Cerelose 4950 g
Harnstoff 61,5 g
destilliertes Wasser
(zum Auffüllen auf 13,5 1)
Silikon-Schauminhibitor 15 ml
Das Fermentationsmedium wurde auf drei 6-1-Kolben verteilt, und darin 30 Minuten lang bei 1,05 atü im Autoklaven behandelt. Das abgekühlte Medium wurde dann in einen sterilen 20-1-Gärbehälter überführt und mit 1500 ml des obigen Inoculums inoculiert. Durch den Gärbehälter wurden 3 1 Luft/Minute von etwa 0,14 bis 0,18 atü hindurchgeleitet. Die Rührgeschwindigkeit betrug 250 U/Min., die Temperatur des Mediums wurde bei 200C gehalten. Nach 15 Tagen hatte die Zearalenonkonzentration einen Wert von 12,529 g/l erreicht.
Das Verfahren wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Gibberella zeae ATCC 20 271 anstelle von ATCC 20 273.
Beispiel 3
189 1 des modifizierten Mediums nach Benett (siehe Beispiel 1) wurden in ein Fermentationsgefäß aus nichtrostendem Stahl von 3801 Inhalt eingefüllt und dann mit Wasserdampf von 121°C 15 Minuten lang sterilisiert. Nach dem Abkühlen auf etwa 28 bis 300C wurde das Medium mit 31 eines Inoculums von ATCC 20 273 inoculiert, das nach Beispiel 1 hergestellt worden war. Das inoculierte Medium wurde dann 24 Stunden lang bei 28 bis 30°C belüftet (0,085 mVMin. Luft von 0,14 bis 0,21 atü) und mit 100 U/Min, gerührt. Das Wachstum war dann ausreichend (280 mg/100 ml Medium) zur Verwendung als Inordüm bei einer Fermentation von Produktionsmaßstab.
Fermentationsmedium
Hefeextrakt 265 g
KCl 66 g
MgSO4 · 7 H2O 66 g
K2HPO4 133 g
Cerelose 87 kg
Harnstoff 1087 g
Silikon-Schauminhibitor 60 ml
destilliertes Wasser
zum Auffüllen auf 265 1
Das Fermentationsrriedium wurde in einen Gärbehälter von 3801 Inhalt verbracht, mit Wasserdampf von 121°C 15 Minuten lang sterilisiert, auf 20°C abgekühlt und mit etwa 61 der Impfkultur inoculiert. Die Temperatur wurde dann weiterhin bei 200C gehalten,
und mit einem Druck von 0,21 atü wurde Luft (0,113 mVMin.) unter Rühren des Mediums mit 200 U/ Min. eingeleitet. Nach 8 Tagen wies das Medium einen pH-Wert von 3,8 auf. Durch Zusatz von Harnstoff und Ammoniumhydroxid wurde der pH-Wert auf 8,0 eingestellt, dann mit Salpetersäure auf 5,6 gesenkt Am 19. Tag betrug der Zearalenongehalt des Fermentationsmediums 8,829/1, das Volumen des Fermentationsmediums 242 1.
•30 249/35

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Zearalenon durch Züchtung eines aeroben Stammes von Gibberalla zeae in einem Fermentationsmedium, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralstoffe enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Gibberalla zeae (Schw.) Petch-Stamm 542 Keith (=ATCC 20 273) oder Gibberella zeae (Schw.) Petch-Stamm Paul S. (=ATCC 20 271) einsetzt und daß man diese Stämme unter submersen Bedingungen in einem bewegten, belüfteten und wäßrigen Fermentationsmedium in flüssiger Phase züchtet.
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