DE2056443C3 - Verfahren zur Herstellung von Zearalenon - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zearalenon durch Züchtung eines aeroben Stammes von Gibberella zeae in einem Fermentationsmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralstoffe enthält.

Ein solches Verfahren ist aus der US-PS 3 96 019 bekannt, doch arbeitet dieses Verfahren nicht submers in einem flüssigen Fermentationsmedium, sondern durch Züchtung des Mikroorganismus auf der Oberfläche eines festen Fermentationsmediums. Feste Fermentationsmedien aber sind für ein Arbeiten in industriellem Maßstab nicht geeignet.

Außerdem war es nach dem Stand der Technik üblich, zur Steigerung der Zearalenonausbeute Hefeextrakt zuzusetzen, der das Verfahren relativ aufwendig macht. j^r>

Die der Erfindung zugrundeligende Aufgabe bestand somit darin, ein in technischem Maßstab einfacher und mit billigeren Ausgangsstoffen durchführbares Verfahren zur Herstellung von Zearalenon zu bekommen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Zearalenon durch Züchtung eines aeroben Stammes von Gibberella zeae in einem Fermentationsmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralstoffe enthält, ist dadurch gekennzeichnet, daß man Gibberella zeae (Schw.) Petch-Stamm 542 Keith ATCC 20 273 oder Gibberella zeae (Schw.) Petch-Stamm Paul S. ATCC 20 271 unter submersen Bedingungen und unter Rühren in einem belüf'eten, wäßrigen, flüssigen Fermentationsmedium züchtet und dem Fermentationsmedium 0,09 bis 0,23 μg ^r>o kationisches Zink pro Milliliter zusetzt.

Zearalenon besitzt die Strukturformel:

CH₃

C O—CH

(CH₂).,

C = O

HO

CH=CH-CH₂-(CH₂J₂

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b0

Gibt man in zweckmäßiger Weise neben dem kationischen Zink in Form einer Zinkverbindung noch eine ausbeutesteigernde Menge eines enzymetischen Proteinhydrolysats zu, so kann man im wesentlichen _b5 dieselben Ausbeuten erzielen wie bei der Verwendung von Hefeextrakt. Ein Vorteil der Erfindung liegt also darin, daß die wasserlöslichen Zinkverbindungen relativ billig sind, während die äquivalente Menge an Hefeextrakt um einige tausend Mal teuer sein kann. Der weitere Vorteil liegt darin, daß das Verfahren der Erfindung mit einem flüssigen und damit pumpfähigen Fermentationsmedium submers durchgeführt wird.

Beispiele geeigneter Quellen für kationisches Zink sind anorganische und organische wasserlösliche Zinkverbindungen, wie Zinksulfat, Zinkchlorid, Zinknitrat und Zinkacetat Die Gesamtmenge an kationischem Zink im Fermentationsmedium ist gering und liegt vorzugsweise zwischen etwa 0,14 bis 0,18 μg pro ml des Mediums. Bei Verwendung von Zinksulfat liegt beispielsweise die optimale Konzentration bei etwa 0,4 bis 0,8 Mikrogramm ZnSO4 pro ml.

Vorzugsweise verwendet man für das Fermentationsmedium destilliertes Wasser, entionisiertes Wasser oder Leitungswasser, das zum Sieden erhitzt und dann filtriert wurde. Die Belüftung erfolgt vorzugsweise unter Hindurchleiten von Luft, insbesondere steriler Luft, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,25 bis 2 Volumenteile Luft, berechnet bei Normaldruck, pro Volumenteil Fermentationsmedium pro Minute. Die Temperatur des Fermentationsmediums wird vorzugsweise bei etwa 20 bis 28 und speziell bevorzugt bei etwa 21 bis 24°C gehalten. Während der frühen Stufen der Fermentation, beispielsweise vor Beginn der Zearalenon-Produktion, sollte die Temperatur nicht weit über 24°C ansteigen. Das Fermentationsmedium wird gerührt, um die vorhandene Luft zu verteilen und den Mikroorganismen zuzuführen. Dies kann beispielsweise mit Hilfe eines Rührers erfolgen, der in einem 20-1-Gärgefäß mit etwa 200 bis 5000 Umdrehungen pro Minute arbeitet

Die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff im Fermentationsmedium besteht zweckmäßig aus Glucose, wie Cerelcse, einer weißen, kristallinen, raffinierten Glucose. Ebenso brauchbar, jedoch weniger bevorzugt sind andere Kohlenhydrate, die die Zearalenon-Produklion nicht nachteilig beeinflussen, wi2 z. B. Xylose, Fructose, Saccharose und Galactose. Xylose wirkt besser im Gemisch mit Glucose (beispielsweise bei einem Gewichtsverhältnis von 7,5 Teilen Xylose zu 22,5 Teilen Glucose), verglichen mit einem Versuch, der ausschließlich mit Xylose arbeitet. Falls erwünscht, kann ein Teil der Glucose, beispielsweise bis zu etwa 50 Gewichtsprozent durch Glycerin ersetzt werden. Ferner kann man dem Fermentationsmedium anstelle von Glucose ein Glucosevorprodukt, z. B. Stärke, welches unter den Verfahrensbedingungen in Glucose überführt wird, zusetzen. Bei Glucose liegt die Menge beispielsweise im allgemeinen bei etwa 20 bis 40 und vorzugsweise bei etwa 25 bis 35 g pro 100 ml Fermentationsmedium.

Die Quelle für assimilierbaren Stickstoff im Fermentationsmedium kann anorganisch oder organisch sein und ist vorzugsweise organischer Natur. Im allgemeinen eignen sich Ammoniak-bildende, neutrale, leicht hydrolysierbare Verbindungen, wie Harnstoff, Asparagin, Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumnitrat und Ammoniumfumarat Glutamin, Glycin, Ammoniumhydroxyd und Proteinhydrolysat. Die bevorzugte Stickstoffquelle ist Harnstoff, und dieser wird im allgemeinen in Mengen zwischen etwa 0,2 und 0,8 und vorzugsweise zwischen etwa 0,3 und 0,7 pro 100 ml Fermentationsmedium eingesetzt.

Die zugesetzten Mineralquellen enthalten die Elemente Eisen, Phosphor, Kalium, Schwefel und Magnesium, vorzugsweise in wasserlöslicher Form. Im allgemei-

nen liegen wirksame Mengen der obigen Elemente, berechnet für das freie Element, zwischen etwa 0,001 und 1 g pro 100 ml Fermentationsmedium. Bevorzugte Mineralquellen sind z.B. Dikaliumphosphat (K₂HPO₄), Magnesiumsulfat (ζ. B. in Form von MgSOt · 7 H2O), Kaliumchlorid, und als Quelle für Eisen, Schwefel und Phosphor das oben genannte Proteinhydrolysat Kaliumchlorid kann auch zur Erhöhung des osmotischen Drucks dienen, wie nachstehend noch erläutert werden wird. Die bevorzugte Menge an Dikaliumphosphat liegt bei etwa 0,05 bis 0,3 g pro 100 ml, die bevorzugte Menge an Mangesiumsulfat (berechnet als MgSO₄ ■ 7 H₂O) bei etwa 0,025 bis 0,2 g pro 100 ml Fermentationsmedium. Eisen ist ein besonders wichtiger Bestandteil, wenn man als Kohlenstoffquelle analysereine Glucose verwendet.

Vorzugsweise werden dem Fermentationsmedium auch ausbeutesteigernde Mengen eines Proteinhydrolysates, z. B. eines enzymatischen Proteinhydrolysats und vorzugsweise eines enzymatischen Caseinhydrolysats zugesetzt Ein Beispiel hierfür ist ein handelsübliches Pankreas-Hydrolysat von Casein, welches sämtliche ursprünglich im Casein vorhandenen Aminosäuren in Form eines Gemischs aus Aminosäuren und Peptiden enthält. Dieses Hydrolysat wird zweckmäßig in einer Menge von mindestens etwa 0,1 g, beispielsweise etwa 0,1 bis 2 g pro 100 ml Fermentationsmedium verwendet. Weniger bevorzugt, jedoch ebenfalls verwendbar sind anstelle des Hydrolysats vitaminfreies Casein und Casein selbst Die Verwendung eines enzymatischen Hydrolysats empfiehlt sich insbesondere dann, wenn als Kohlenstoffquelle analysenreine Dextrose verwendet wird.

Dem Medium können ferner wachstumsfördernde Mengen tierischer Aminosäuren, beispielsweise in Mengen von etwa 0,1 bis 0,3 g pro 100 ml des Fermentationsmediums, in Form von Rindfleischextrakt zugesetzt werden.

Ferner empfiehlt es sich, dem Fermüntationsmedium einen Schauminihbitor zuzusetzen, insbesondere einen solchen, der die Zearalenon-Produktion nicht nachteilig beeinflußt. Am wenigsten nachteilig für die Zearalenon-Bildung sind als Schauminhibitoren Silikone. Andere wirksame Schauminhibitoren, die die Zearalenon-Ausbeute jedoch etwas verschlechtern, sind Maisöl, Specköl, Mineralöl und Fettalkohole, wie Laurylalkohol.

Dem Fermentationsmedium kann ferner ein den osmotischen Druck erhöhendes Salz zugegeben werden. Als Beispiele für solche Salze seien die Alkalimetallsalze wie z. B. Natriumacetat, Natriumeitrat, Natriumsuccinat, Natriumchlorid und Kaliumchlorid genannt. Besonders bevorzugt sind die Alkalimetallhalogenide, ζ. B. Natriumchlorid und Kaliumchlorid, und diese liegen vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis 4 g pro 100 ml Fermentationsmedium vor.

Die Zearalenon-Ausbeute und die Ausnutzung der Kohlenstoffquelle werden verbessert, wenn man das Fermentationsmedium vor der Inoculierung durch Autoklavenbehandlung sterilsiert, beispielsweise bei einem Volumen von bis zu 3 1 während etwa 10 bis 30 Minuten bei etwa 0,7 bis 1,4 Atmosphären Überdruck.

Zweckmäßig läßt man die Fermentation fortschreiten, bis im wesentlichen der gesamte assimilierbare Kohlenstoff verbraucht ist, was im allgemeinen während etwa 5 bis 23 Tagen der Fall ist. Dann wird das Fermentationsmedium zur Gewinnung des Zearalenons aufgearbeitet. Die Isolierung des Zearalenons kann beispielsweise durch Filtrieren des Mediums, Aufschlämmen des Filterkuchens mit wäßriger Alkalilösung zwecks Lösung des Zearalenons, Filtrieren der Aufschlämmung, Ansäuern des Filtrats zwecks Ausfällung des Zearalenons, und Gewinnung des ausgefällten Produkts erfolgen. Diese Methode ist in der BE-PS -, 7 21 322 und der FR-PS 15 81 430 erläutert

Der Ausgangs-pH-Wert des Fermentationsmediums liegt im allgemeinen bei etwa 6,1 bis 7,2 und vorzugsweise zwischen etwa 6,2 und 7,0. Mit fortschreitender Vergärung nimmt der pH-Wert ab. Gewöhnlich fällt er innerhalb von 2 bis 4 Tagen auf etwa 3,4 bis 4,0, häufig auf etwa 3,6 bis 3,7, und die restliche Fermentation verläuft dann bei diesen pH-Werten. Wird der pH-Wert nicht nachgestellt, so werden die letztgenannten Werte während der gesamten Fermentationsperiode aufrecht erhalten. Vorteilhafterweise vermehren sich relativ wenige verunreinigende Organismen bei pH-Werten unterhalb 4.

Beispiel 1

Mehrere Versuchsreihen wurden unter Zusatz von 0,05 bis 0,23 μg (berechnet als kationisches Zink) Zinksulfat pro ml Fermentationsmedium ausgeführt

Das Inoculum wurde mit dem nachstehend beschriebenen Medium hergestellt. In jedem Fall wurden 100 ml

2') des Inoculiermediums in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gegossen, dann wurde der Kolben mk einem Wattepfropfen verschlossen und 15 Minuten lang bei 2 bar Wasserdampfdruck im Autoklaven behandelt.

Die erste Stufe eines zweistufigen Inoculums wurde mit 5 ml einer Mycelsuspension oder 5 ml einer Sporensuspension von ATCC 20 273 inoculiert Nach 24stündiger Inkubation bei 30⁰C auf der Schüttelmaschine wurden 5 ml des ersten Inoculums in einen zweiten Kolben mit dem gleichen Medium überführt.

r, Die zweite Stufe, die ebenfalls bei 30⁰C auf der Schüttelmaschine gezüchtet wurde, war nach 20 bis 22 Stunden gebrauchsfertig.

Jeweils 100 ml Fermentationsmedium in 500-ml-Erlenmeyerkolben wurden mit zwei Milchfilterscheiben verschlossen und bei 2 bar 10 Minuten lang im Autoklaven behandelt. Dann wurden 5 ml des Inoculums aus der zweiten Stufe zugesetzt. Nach 12 bis 14 Tagen wurde der Kolbeninhalt durch UV-Spektophotometrie untersucht, wobei die bei 236 πιμ für die

4') Gehaltsberechnung verwendet wurde.

Zusammensetzung des Inoculiermediums

Handelsübliches Proteinhydrolysat der
r₎₀ Handelsbezeichnung

»NZ Amine Typ A«

Rindfleischextrakt

Hefeextrakt

NaCl
Cerelose

Destilliertes Wasser

0,2 g pro 100 ml Medium
0,1 g pro 100 ml Medium
0,1 g pro 100 ml Medium
0,25 g pro 100 ml Medium
1,0 g pro 100 ml Medium
Rest

Zusammensetzung des Fermentationsmediums

Cerelose
KCI
^bü K₂H PO4

MgSO₄ · 7 H₂O
Harnstoff
Hefeextrakt oder
Zinksulfat

De- .illiertes Wasser

33,0 g pro 100 ml Medium
0,025 g pro 100 ml Medium
0,05 g pro 100 ml Medium
0,025 g pro 100 ml Medium
0,41 gpro 100 ml Medium

wie angegeben
Rest

Die bei den Versuchen ermittelten Ergebnisse sind aus den folgenden Tabellen Ia und Ib zu ersehen. In

5 6

Tabelle Ia sind die prozentualen Zearalenon-Ausbeuten, medium, in Tabelle Ib, bezogen auf den Bestwert der bezogen auf die Ausbeute des Versuches mit 0,1 g Versuchsreihe, wiedergegeben.
Hefeextrakt statt Zinksulfat pro 100 ml Fermentations-Tabelle 1 a

Zearalenon-Ausbeute, %, bezogen auf die Ausbeute beim Vergleichsversuch mit 0,1 g Hefeextrakt pro 100 ml Fermentationsmedium

Zink **)	Versuch Nr.	15,3	2
	1	30,8
0,05	56,5
0,07	86,0
0,09	101,8
0,11	109,7	102,9
0,14	126,3	95,8
0,16	115,6	71,5
0,18	114,6	35,7
0,21		27,8
0,23

87,5

95.7 98,4 85,4 78,7 100,7 96,7

20.8 87,4 75.0

**) ug kaiionisches Zink pro Milliliter Fermentationsmedium.

Tabelle 1 b

Zearalenon-Ausbeute, %, bezogen auf den Bestwert der Versuchsreihe

Zink	Versuch Nr.	12,1	2	3	4	88.9	5	8	5,6
	1	24,4				100
0,05	44,6				98,2		39,4
0,07	68,1				88.8
0,09	80,6					75,3
0,11	86,9	100	100		100
0,14	100	93,1				100
0,16	91,5	69,5	21,8	87,8
0,18	90,7	34,7			79,6
0,21		27,0
0,23

Beispiel 2

In 5 weiteren Versuchen mit einem Fermentationsmedium gemäß Beispiel 1 mit 0,14 ug kationischem Zink wurden jeweils 0,3 g des handelsüblichen Proteinhydrolysates zugesetzt. Die Zearalenon-Ausbeute war im Durcnschnitt um 34% höher als bei den Versuchen mit kationischem Zink, jedoch ohne das Proteinhydrolysat.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Zearalenon durch Züchtung eines aeroben Stammes von Gibberella zeae in einem Fermentationsmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralstoffe enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man Gibberella zeae (Schw.) Petch-Stamm 542 Keith ATCC 20 273 oder Gibberella zeae (Schw.) Petch-Stamm Paul S. ATCC 20 271 unter submersen Bedingungen und unter Rühren in einem belüfteten, wäßrigen, flüssigen Fermentationsmedium züchtet und dem Fermentationsmedium 0,09 bis 03 μg kationisches Zink pro Milliliter zusetzt