AT218673B - Verfahren zur Herstellung von Rifomycin B - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Herstellung von Rifomycin B 
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Rifomycin B durch submerse Fermentation und insbesondere die Verwendung von Barbituraten als Hilfsstoffen in dieser Fermentation. 



   Gemäss einem nicht zum Stande der Technik gehörenden Vorschlag (belgische Patentschrift Nr. 581408) wird die Herstellung einer Gruppe von Antibiotika durch submerse Kultur von Streptomyces mediterraneus ATCC 13685 in einem üblichen Nährboden durchgeführt, das Maisquellwasser, Ammoniumsulfat, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl oder Gemische derselben als Stickstoffquellen und Glukose, Saccharose, Stärke, Dextrin oder Gemische derselben als Kohlenstoffquellen, Phosphate und andere Mineralelemente enthält. Das erhaltene Gemisch von Antibiotika wird durch verschiedene Verfahren, wie Chromatographie oder Gegenstromtrennung, in seine Fraktionen getrennt. Die Schwierigkeit der Durchführung dieser zwei Verfahren verhindert aber die Herstellung in grossen Mengen und die erhaltenen Ausbeuten sind sehr gering.

   Es wurde nun gefunden, dass durch Anwendung von Barbituraten als Hilfsstoffen bei der Fermentation Rifomycin B als einziger antibiotischer Stoff mit guter Ausbeute und in kristalliner Form gewonnen werden kann. 



   Zur Herstellung von Rifomycin B eignen sich viele Stämme von Streptomyces mediterraneus, wie z. B. die beiden ursprünglich aus dem Boden isolierten ME/83 Stämme und viele durch übliche Methoden erhaltene Varianten und Mutanten. 



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur gärtechnischen Herstellung von Rifomycin B nach üblichen Methoden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dem Fermentationsmedium als Hilfsstoff eine Barbitursäure der allgemeinen Formel 
 EMI1.1 
 in welcher R und R'Wasserstoff oder einen niederen Alkyl-, Alkenyl- oder Arylrest, X Sauerstoff oder Schwefel bedeuten, gegebenenfalls als Alkalisalz   zugefugt   wird. 



   Der Rifomycin erzeugende Mikroorganismus kann in   Oberflächenkultur oder   submers kultiviert werden, wobei gleichzeitig belüftet wird. Die Ausbeute an Rifomycin B hängt von der Konzentration der Nährbodenbestandteile und dem Gleichgewicht zwischen den Stickstoff- und Kohlenstoffquellen und den Mineralzusätzen ab. Ausserdem spielen auch die Temperatur und die physikalischen Bedingungen wie Rühren und Belüftung des Nährbodens eine wichtige Rolle. 



   Im Verfahren zur selektiven Herstellung von Rifomycin B kann der geeignete Mikroorganismus in einem wässerigen Nährboden gezüchtet werden, der Stoffe der folgenden Klassen enthält : a) eine organische Stickstoffquelle, wie Maisquellwasser, Pepton, Protein enthaltende Pflanzenmaterialien, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Kasein, Malzextrakt "distiller's solubles" usw. und/oder eine anorganische Stickstoffquelle wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat usw. ; b) eine Kohlenstoffquelle wie Stärke, Dextrin, Glukose, Saccharose, Laktose usw. ; 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 c) einen Mineralzusatz wie Calciumcarbonat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Kaliumchlorid, Zinksulfat, Ferrosulfat, Mangansulfat,   Kobaltch10rid,   Ammoniummolybdat usw. oder Gemische derselben ;

   d) als Hilfsstoff eine Barbitursäure der allgemeinen Formel 
 EMI2.1 
 
 EMI2.2 
 
 EMI2.3 
 
<tb> 
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 5 <SEP> g
<tb> (NH <SEP> vs04 <SEP> 7 <SEP> g
<tb> MgS04'7O <SEP> 1 <SEP> g
<tb> KHPO <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Na-Barbiturat <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> CACA <SEP> 3 <SEP> 9 <SEP> g
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Cuss. <SEP> 5H2O <SEP> 3,3 <SEP> mg
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 50,0 <SEP> mg
<tb> FeSO4.7H2O <SEP> 10,0 <SEP> mg
<tb> MnSO4. <SEP> 4H2O <SEP> 4,0 <SEP> mg
<tb> dest. <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> cm3.
<tb> 
 



   Der pH-Wert wird mit konz. NaOH auf 7, 0 eingestellt. Die Sterilisierung erfolgt 30 Minuten lang bei 121 C. Das Wachstum des Organismus erfolgt unter Rühren (800 Umdr/min des Rührwerks) und Belüftung   (1, 5 Vol./1 Vol. Imin)   bei 28 C. Das Volumen des Mycels erhöht sich ungefähr um 25 - 35%. Die höchste antibiotische Wirksamkeit wird nach 48-72 Stunden erhalten ; die Ausbeuten an Rifomycin B schwanken zwischen zirka 100 und 200   y/cm.   
 EMI3.2 
 Beispiel 1 beschrieben hergestellt.

   Die Vorzüchtung wird wie oben mit der Anwendung folgenden Saatmediums durchgeführt : 
 EMI3.3 
 
<tb> 
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Laktose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> KHPC <SEP> l <SEP> g
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Zens04. <SEP> 7HO <SEP> (0, <SEP> 2%-Lsg.) <SEP> 1 <SEP> cm <SEP> 
<tb> CuSO. <SEP> 5HjjO <SEP> (0, <SEP> 5%-Lsg.) <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> dest. <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb> 
 
Nach   24stlindigem   Wachstum erhöht sich das Volumen des Mycels um   4-5% ; pH 4, 0-4, 5.   Ein 10%iges Impfmaterial vom vegetativen Medium wird für die Fermentationsphase verwendet.

   Das Fermentationsmedium enthält : 
 EMI3.4 
 
<tb> 
<tb> Glukose <SEP> 70 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Erdnussmehl <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 7 <SEP> g
<tb> KH2PO4 <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Na-Diäthylbarbiturat <SEP> 3 <SEP> g
<tb> CaCO <SEP> 6 <SEP> g
<tb> MgSO4.7H2O <SEP> 1 <SEP> g
<tb> CuSO. <SEP> 5H2O <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> mg
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 50 <SEP> mg
<tb> MnSO4.4H2O <SEP> 4 <SEP> mg
<tb> FeSO4.7H2O <SEP> 10 <SEP> mg
<tb> CoCl2 <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Ammoniummolybdat <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> dest. <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> cm3.
<tb> 
 



   Der PH-Wert wird auf 7, 0 eingestellt. Die Fermentation wird wie im Beispiel 1 durchgeführt. Optimale Konzentrationen von zirka 400 bis 500   y/cm Rifomycin   B werden nach 72 - 96 Stunden erhalten. 



  Das Fermentationsmedium (41). das am Ende der Fermentation einen   PH- Wert 6, 0   zeigt, wird mit verdünntem Natriumhydroxyd auf PH 7, 5 eingestellt und nach Zusatz eines geeigneten Filtrationshilfsstoffes 
 EMI3.5 
 hiert. Der Chloroformextrakt (2, 95 1) wird zweimal mit 750   cms   Phosphatpuffer bei PH 8, 0 extrahiert. 



    Die Pufferlösung wird bis PH 2,0 mit 10%iger Salzsäure angesäuert und mit Äthylacetat (500 cm3) extrahiert. Das Lösungsmittel wird zu kleinem Volumen abdestilliert (zirka 50 cm5. Beim Einengen fällt   Rifomycin B aus und nach einigen Stunden Kühlung wird gesammelt und mit etwas Äthylacetat und Äthyl- äther gewaschen. Nach dem Trocknen zeigt Rifomycin B einen mikrobiologischen Wert von   980 y/mg   gegen einen Rifomycin B-Standard. Rifomycin B zersetzt sich bei zirka 160 C und schmilzt nicht unter- 
 EMI3.6 
 
Be is pie 1 3 : Die Fermentationsverfahren werden wie im Beispiel 1 durchgeführt ; das Fermentationsmedium wird jedoch durch Zusatz von 20 g/l Bohnenmehl verstärkt. Dimethylbarbitursäure wird als Hilfsstoff in einer Konzentration von 0, 5% verwendet.

   Optimale Rifomycin-Ausbeuten von 500 bis 700 y/cm3 werden nach 48- bis 72stündiger Fermentation erhalten. 

 <Desc/Clms Page number 4> 

   Beispiel 4 :   Das Fermentationsverfahren wird wie im Beispiel 2 durchgeführt. Das folgende Fermentierungsmedium wird jedoch in der letzten Stufe verwendet : 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Maisquellwasser <SEP> 10 <SEP> g
<tb> L-Glutaminsäure <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Na-Phenylbarbiturat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> CaCO <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Mineralsalze <SEP> wie <SEP> im <SEP> Beispiel <SEP> 2.
<tb> 
 



   Optimale Rifomycin B-Ausbeuten von 200 bis   300 y/cm werden   nach 72 - 96 Stunden erhalten. 



   Beispiel 5 : Das Fermentationsverfahren wird wie im Beispiel 4 mit Na-Diäthylbarbiturat als Hilfsstoff durchgeführt. Optimale Rifomycin B-Ausbeuten von 1500 bis   2000'Y/cm3   werden nach   96- bis   120stündiger Fermentation erhalten.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur gärtechnischen Herstellung von Rifomycin B nach üblichen Methoden, dadurch gekennzeichnet, dass dem Fermentationsmedium als Hilfsstoff eine Barbitursäure der allgemeinen Formel EMI4.2 in welcher R und R'Wasserstoff oder einen niederen Alkyl-, Alkenyl- oder Arylrest, X Sauerstoff oder Schwefel bedeuten, gegebenenfalls als Alkalisalz zugefugt wird.