Verfahren zur Herstellung von Rifamycin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B durch submerse Fermentation unter Verwendung von Barbituraten als Hilfsstoffe in dieser Fermentation.
Wie in unserem Schweizer Patent Nr. 395 431 beschrieben ist, wird die Herstellung einer Gruppe von Antibiotika durch Fermentation eines Stammes eines Rifamycin produzierenden Mikroorganismus, z. B.
Strepto, myces mediterraneus ATCC 13 685, in einem Nährboden durchgeführt, der z. B. Maisquellwasser, Ammoniumsulfat, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl oder Gemische derselben als Stickstoffquellen und z. B.
Glukose, Saccharose, Stärke, Dextrin oder Gemische derselben als Kohlenstoffquellen, sowie Phosphate und andere anorganische Salze enthält. Das erhaltene Gemisch von Antibiotika kann durch verschiedene Verfahren, wie Chromatographie oder Gegenstrom- trennung in seine Fraktionen getrennt werden. Die Schwierigkeit der Durchführung dieser Trennver- fahren verhindert aber die Herstellung in grossen Mengen und die erhaltenen Ausbeuten sind sehr gering. Wie haben jetzt gefunden, dal3 durch Anwendung von Barbituraten als Hilfsstoffe bei der Fermentation Rifamycin B als einziger antibiotischer Stoff mit guter Ausbeute und in kristalliner Form gewonnen werden kann.
Zur Herstellung von Rifamycin B eignen sich u. a. viele Stämme von Str. mediterraneus, wie z. B. die beiden, ursprünglich aus dem Boden isolierten ME/83-Stämme und viele durch übliche Methoden erhaltene Varianten und Mutanten.
Gegenstand des vorliegenden Patentes ist ein Verfahren zur gärtechnischen Herstellung von Rifamycin B unter Verwendung eines Hilfsstoffes der Formel I, der den Mikroorganismus zur Erzeugung besserer Ausbeuten von Rifamycin B ohne Nebenherstellung anderer Fraktionen von Rifamycin anregt.
Das Wachstum des Rifamycin erzeugenden Mikro- organismus wird durch submerse Fermentation vorgenommen. In einem Handelsverfahren wird der Streptomyces in submerser Kultur wie gewöhnlich gezüchtet und die Erzeugung des Rifamycins B durch ein Belüftungssystem aktiviert. Die Ausbeute von Rifamycin B wird dabei durch die Konzentration der Nährbodenbestandteile und das Gleichgewicht zwi schen den Stickstoff-und Kohlenstoffquellen und den Mineralzusätzen bedingt. Ausserdem sind die Temperatur und die physikalischen Bedingungen wie Rühren und Belüftung des Nährbodens wichtige Faktoren.
Im Verfahren zur selektiven Herstellung von Rifamycin B kann der geeignete Mikroorganismus in einem wässrigen Nährboden gezüchtet werden, der folgende Nährmittel enthält : a) eine onganische Stickstoffquelle, wie Maisquell wasser, Pepton, Protein enthaltende Pflanzen materialien, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Kasein,
Malzextrakt, distiller's solubles usw., und/oder eine anorganische Stickstoffquelle, wie Ammo niumsulfat, Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat usw. ; b) eine Kohlenstoffquelle wie Stärke, Dextrin, Glu kose, Saccharose, Laktose usw. ;
c) einen Mineralzusatz wie Calciumcarbonat, Kalium phosphat, Magnesiumsulfat, Kaliumchlorid, Zink sulfat, Ferrosulfat, Mangansulfat, Cobaltchlorid, Am, moniummolybdat usw. oder Gemische der selben ; und erfindungsgemäss d) als Hilfsstoff, eine Barbitursäure der Formel
EMI1.1
in welcher R und R'gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, einen niederen Alkylrest, einen
Alkenyl-oder Arylrest und X Schwefel oder
Sauerstoff bedeuten, oder deren Alkalisalze.
Es ist dabei darauf hinzuweisen, dass die genannten Hilfsstoffe die Ausbeute von Rifamycin B in Gärungsverfahren unabhängig von der Art des verwendeten Rifamycin B erzeugenden Streptomyces Stammes und von der Zusammensetzung des Nährbodens erhöhen. Diese Hilfsstoffe werden zweckmässig im Medium in einer Konzentration von 0, 01 bis 5, 0%, vorzugsweise 0, 1 bis 0, 5%, verwendet.
Die ganze Menge des Hilfsstoffes kann am Anfang der Fermentation oder allmählich im Laufe derselben zugesetzt werden.
Die Gewinnung von Rifamycin B aus den Fermentationsmedia kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden. Das Medium wird bei einem pH Wert von 5, 0 bis 8, 0 filtriert, obwohl auch bei niedrigerem pH die grösste Menge des Antibiotikums ins Filtrat übergeht. Es ist aber nicht ratsam, bei einem pH-Wert unterhalb 5, 0 zu filtrieren, wegen der niedrigen Löslichkeit des Antibiotikums in seiner sauren Form. Aus dem filtrierten Medium wird das Antibiotikum nach Ansäuern mit einem Lösungs- mittel, welches das Antibiotikum auflösen kann und in welchem der Hilfsstoff praktisch unlöslich ist, extrahiert.
Zum Beispiel kann man das filtrierte Medium mit Chloroform (1/1o bis 1 Volumen mit Bezug auf das Volumen des Mediums) extrahieren, so dass das ganze Rifamycin B und nur ein niederer Prozentgehalt des Hilfsstoffes ins Lösungsmittel gebracht wird. Rifamycin B wird nochmals aus Chloroform mit einer wässrigen Lösung bei zwischen 5, 0 und 9, 0 liegenden pH-Werten extrahiert, vorzugsweise mit der Anwendung eines Phosphatpuffers von etwa pH 7, 5.
Das Volumen der wässrigen Phase kann etwa 1/10 des Volumens von Chloroform sein. Das ganze Rifamycin B geht als Dinatriumsalz in die wässrige Phase über und wird nochmals durch ein geeignetes Lösungs- mittel wie Chloroform oder Athylacetat nach Ansäuern extrahiert. Andere geeignete Lösungsmittel sind z. B. Butanol, Benzol und verschiedene Ester wie Amyl-und Butylacetat. Bei Konzentration i. Vak. zu kleinem Volumen kristallisiert Rifamycin B in Form von gelben glänzenden Kristallen aus.
Rifamycin B wird gesammelt und mit Äthylacetat und Äthyläther gewaschen. Nach Trocknen zeigt es die im oben genannten Patent beschriebenen Eigenschaften. Rifamycin B kann auch vorteilhaft aus Äthylacetat, Benzol oder Methanol kristallisiert werden.
Es kann auch so vorgegangen werden, dass Rifamycin aus den filtrierten Medien durch ein Lö- sungsmittel, in welchem auch der Hilfsstoffüberschuss löslich ist, nach Ansäuern extrahiert wird. In diesem Falle kann der Hilfsstoff in verschiedenen Weisen beseitigt werden. Zum Beispiel wird die rohe Mischung mit einem Lösungsmittel behandelt, in welchem die eine der zwei Substanzen löslich ist. Zu praktischen Zwecken wird jedoch das oben beschriebene Verfahren vorzugsweise verwendet.
Beispiel 1
Eine Kultur von Streptomyces mediterraneus wird in 500-cm3-Schüttelkolben geimpft, die 100 cms Saatmedium der folgenden Zusammensetzung enthalten : Fleischextrakt 5 g, Hefeautolysat 6 g, Pepton 5 g, Kaseinhydrolysat 3 g, Glukose 20 g, NaCl 1, 5 g, dest. H20 1000 cm. ; pH 7, 3.
Nach 24stiindigem Wachstum bei 28 C auf einem Wechselschüttler (100 Schläge/min mit
80 mm Weite) wird der Inhalt der Kolben in 10-Liter- Glasfermentatoren mit 4 Litern desselben Saatmediums geimpft. Die Vorzüchtung erfolgt unter Umrühren (800 U./min. des Rührwerks) und Belüftung (1 Vol./ 1 Vol./m) bei 28 C. Nach 24 Stunden erhöht sich das Volumen des Mycels um 4-5 %. Der pH-Wert liegt zwischen 6, 0 und 6, 8.
Ein 10 % iges Impfmaterial aus dem vegetativen Stadium wird in einen anderen Glasfermentator eingeführt, der 4 Liter des folgenden Mediums enthält :
Glukose.. 50 g
Sojabohnenmehl. 5 g (NH4) 2 SO4.... 7 g MgS04 7 H2O 1 g KH2PO4. 3 g
Na-barbiturat. 4, 0 g CaCOss.. 9 g CuSO4 5H2O 3, 3 mg ZnS04 7 H20 50, 0 mg FeSO4 7H2O 10, 0mg MnSO-4HaO. 4, 0mg dest. Wasser.. 1000 cm5
Der pH-Wert wird mit konz. NaOH auf 7, 0 eingestellt.
Die Sterilisierung erfolgt 30 Minuten lang bei 121 C. Das Wachstum des Organismus erfolgt unter Rühren (800 U./min des Rührwerks) und Belüftung (1, 5/Vol./Vol./m) bei 28 C. Das Volumen des Mycels erhöht sich ungefähr um 25-30 %. Die höchste antibiotische Wirksamkeit wird nach 48 bis 72 Stunden erhalten ; die Ausbeuten von Rifamycin B schwanken zwischen etwa 100 und 200, ag/cm3.
Beispiel 2
Eine Kultur von Streptomyces mediterraneus wird in einer geschüttelten Flasche wie im Beispiel 1 be schrieben, hergestellt. Die Vorzüchtung wird wie oben mit der Anwendung folgenden Saatmediums durchgeführt :
Sojabohnenmehl 5 g
Ammoniumsulfat. 7 g
Laktose 10 g
Glukose.. 10 g KH2PO4...... 1 g
MgSO4 7 H20.... 1 g ZnSO4#7H2O (0, 2%-Lsg.) 1 cm3 CuSO4#5H2O (0, 5%-Lsg.) 1 cm3 dest. Wasser 1000 cm3
Nach 24stündigem Wachstum erhöht sich das Volumen des Mycels um 4-5 % ; pH 4, 0-4, 5. Ein 10 % iges Impfmaterial vom vegetativen Medium wird für die Fermentationsphase verwendet.
Das Fermentationsmedium enthält :
Glukose..... 70 g
Sojabohnenmehl. 5 g Erdnussmehl. 20 g
Ammoniumsulfat. 7 g KH, PO,... 2g
Na-Diäthylbarbiturat 3 g CaCOs... 6 g MgS04 #7H2O 1 g CuSO4#5H2( 3, 3 mg ZnSO4#7H2O . 50 mg
MnSO4 4 H2O 4 mg FeSO4#7H2O 10 mg
COC12.. 2 mg
Ammoniummolybdat. 1 mg dest. Wasser. 1000 cm3
Der pH-Wert wird auf 7, 0 eingestellt. Die Fermentation wird wie im Beispiel 1 durchgeführt. Optimale Konzentrationen von etwa 400-500, ug/cm3 Rifamycin B werden nach 72-96 Stunden erhalten.
Das Fermentationsmedium (4 Liter), das einen pH Wert 6, 0 zeigt, wird mit verdünntem Natriumhydroxyd auf pH 7, 5 eingestellt und mit Zusatz eines geeigneten Filtrationshilfsstoffes filtriert. Das Mycel wird mit Wasser (1 Liter) gewaschen und entfernt ; die vereinigten Filtrate werden mit 10% iger Salzsäure auf pH 2, 1 eingestellt. Das saure Medium wird zweimal mit 1, 5 Liter Chloroform extrahiert.
Der Chloroformextrakt (2, 95 Liter) wird zweimal mit 750 cm3 Phosphatpuffer bei pH 8, 0 extrahiert.
Die Pufferlösung wird bis pH 2, 0 mit 10% iger Salz- säure angesäuert und mit Athylacetat (500 cm3) extrahiert. Das Lösungsmittel wird zu kleinem Volumen abdestilliert (etwa 50 cm3). Bei der Konzentration fällt Rifamycin B aus und wird nach einigen Stunden Kühlung gesammelt und mit etwas Athylacetat und Athyläther gewaschen. Nach Trocknen zeigt Rifamycin B einen mikrobiologischen Wert von 980, ug/mg gegen einen Rifamycin B-Standard. Rifamycin B zersetzt sich bei zirka 160 C und schmilzt nicht unterhalb 300 C. [a] 2D-11 (c 1, Methanol).
Beispiel 3
Die Fermentationsverfahren werden wie in Beispiel 1 durchgeführt ; das Fermentationsmedium wird jedoch durch Zusatz von 20 g/Liter Bohnenmehl verstärkt. Dimethylbarbitursäure wird als Hilfsstoff in einer Konzentration von 0, 5 % verwendet. Optimale Rifamycin-Ausbeuten von 500-700, g/cm3 werden nach 48-72stündiger Fermentation erhalten.
Beispiel 4
Das Fermentationsverfahren wird wie im Beispiel 2 durchgeführt. Das folgende Fermentierungsmedium wird jedoch in der letzten Stufe verwendet :
Maisquellwasser 10 g L-Glutaminsäure 20 g
Ammoniumsulfat 4 g Na-phenylbarbiturat 0, 5 g
CaCO3 . . . . . 3 g
Mineralsalze wie im Beispiel 2.
Optimale Rifamycin B-Ausbeuten von 200 bis 300, ug/cm3 werden nach 72 bis 96 Stunden erhalten.
Beispiel S
Das Fermentationsverfahren wird wie im Beispiel 4 mit Na-Diäthylbarbiturat als Hilfsstoff durchgeführt. Optimale Rifamycin B-Ausbeuten von 1500 bis 2000, g/cm3 werden nach 96-120stündiger Fermentation erhalten.