DE2344006B2

DE2344006B2 - Verfahren zur biotechnischen behandlung von epsilon-caprolactam enthaltenden abwaessern

Info

Publication number: DE2344006B2
Application number: DE2344006A
Authority: DE
Inventors: Shiro Tokio Hayakawa; Takashi Iguchi; Kazuyoshi Imamura; Tetsuhiro Kusunose; Akio Miyazaki Mimura; Kenji Nakamae; Masahira Sakashita; Satoshi Tsuchida
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1972-09-01
Filing date: 1973-08-31
Publication date: 1975-08-21
Also published as: JPS4986585A; FR2197976A1; GB1408515A; BE808041A; IN139594B; US3880740A; DE2344006C3; DD109607A5; NL7314889A; DE2344006A1; FR2197976B1; CA981197A; JPS516233B2; JPS4942873A

Description

Züchtung auf flüssigem RinderbouiUon: Bildung von dünnen Häutchen und trübem Sediment; keine Pigmentbildung. Gelatine-Stichkultur(26¹C, 14Tage): Oberflächenwachstum, keine Verflüssigung.

(C) Physiologische Eigenschaften

Wachstumstemperatur ... 18 bis 37 C; kein

Wachstum bei 42 C

Optimale Wachstums-

temperatur 25 bis 30⁼ C

pH-Bereich Wachstum bei pH 5,0

bis 10,0

Optimales Wachstum bei pH-Wert 6,0 bis

8,5

Sauerstoffbedarf aerob

Indolbildung negativ

Nitratreduktion positiv

Bildung von Schwefel-

wasserstoff negativ

Zersetzung von Stärke ... negativ Lackmusmilchreaktion .. negativ, eine Koagu-

lierung und Verflüssigung von Milch

M R-Test negativ

VP-Test negativ

Catalase positiv

Urease negativ

Ammoniak aus Peptonwasser

gebildet

Natriumchlorid-Resistenz Wachstum bis 5%

Bildung von Pigment in
glycerinhaltigen Medien negativ

Saurebildung aus Kohlenhydraten:

Glucose +

Arabinose -f

Xylose +

Maltose —

Saccharose —

Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Zitronensäure -(-

Methanol -

Äthanol I

n-Hexadecan —

Benzol -

Toluol —

Naphthalin —

Essigsäure h

e-Aminocapronsäure -j-

Auf Grund der vorgenannten Eigenschaften läßt sich die isolierte Spezies gemäß Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, in die Gattung Pseudomonas einordnen. Der isolierte Stamm weist Ähnlichkeiten mit der Art Pseudomonas desmolytica oder Pseudomonas rathonis auf, aber er unterscheidet sich offensichtlich in bezug auf die Verwertung von Kohlenwasserstoffen. Daher wird der erfindungsgemäße Stamm einer neuen Art zugerechnet, die als Pseudomonas lactamolyticus bezeichnet wird. Der erfindungsgemäß verwendete Stamm wurde als Pseudomonas lactamolyticus bezeichnet und beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, unter der Nr. FERM p 1520 hinterlegt.

Die für die Züchtung des erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus angewandten Bedingungen unterscheiden sich nicht wesentlich von üblichen Wachstumsbedingungen anderer Mikroorganismen. Im allgemeinen wird der erfindungsgemäße Mikro-Organismus in Nähnnedien mit einem Gehalt an *-Caprolactam von 0 2 bis 4,0 Gewichtsprozent, vorzugsweise 0,2 bis 1,5 Gewichtsprozent, gezüchtet Konzentrationen von mehr als 1,5 Gewichtsprozent bewirken eine teilweise Wachstumshemmung des Mikro-Organismus. Bei Verwertung von Abwässern mit hohen e-Caprolactamkonzentrationen ist es daher nötig, diese nach und nach dem Züchtungsmedium zuzusetzen. Es ist nicht nötig, dem Nährmedium eine Stickstoffquelle zuzusetzen. Jedoch wird das Wachstum des Mikroorganismus durch Zusatz einer geringen Menge einer Stickstoffquelle, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniak oder Harnstoff, stark verbessert. Daher werden vorzugsweise diese stickstoffhaltigen Verbindungen zugesetzt. Als weitere anorganische Salze können dem Nährmedium beispielsweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Zinksulfat und Mangansulfat zugesetzt werden. Auch durch Zusätze von organischen stickstoffhaltigen Verbindungen, wie Zuckerrohrmelasse, Maisquellfiüssigkeit und Hefeextrakt, wird das Wachstum des Mikro-Organismus verbessert.

Die Züchtung wird im allgemeinen unter Schütteln oder Rühren und unter aeroben Bedingungen bei Tempeiaturen von 18 bis 37' C und bei einem pH-Wert von 5 bis 9 durchgeführt. Die Züchtungsdauer hängt von der Konzentration der zugesetzten Kohlenstoffquelle ab und beträgt im allgemeinen 10 bis 50 Stunden.

In Tabelle 1 ist ein Beispiel	für die Zusammen
Setzung eines erfindungsgemäß	verwendbaren Nähr-
mediums angegeben.
Tabelle I
Bestandteil	Gewichtsprozent
E-Caprolactam	1,0
Kaliumdihydrogenphosphat	0,075
Magnesiumsulfat	0,025
Eisen(l I)-sulf at	0,003
Zinksulfat	0,002
Mangansulfat	0,002
pH-Wert	7,0

Wie bereits erwähnt, wird die Mikroorganismensuspension durch Zusatz von mindestens einer wenig wasserlöslichen, alkalisch reagierenden Calciumverbindung auf einen pH-Wert von mindestens 10 gebracht. Dabei wird vermutlich durch rasche Absorbtionsvorgänge an den Mikroorganismenzellen die Agglomeration bewirkt. Beispiele für wenig wasserlösliche, alkalisch reagierende Calciumverbindungen sind Calciumhydroxid, Calciumoxid und/oder CaI-ciumcarbonat. Vorzugsweise werden die Calciumverbindungen in Form einer Aufschlämmung zugesetzt. Anschließend wird die Suspension gerührt und sodann stehengelassen. Dabei fällt innerhalb von 1 bis 2 Minuten ein flockiger Niederschlag aus. Liegt der pH-Wert dabei unter 10, so ist der gebildete Niederschlag wenig transparent und das ausgeflockte Produkt sehr weich.

Es wurde festgestellt, daß das auf diese Weise ausgeflockte Produkt, das die Mikroorganismenzellen und die Calciumverbindungen enthält, zur Abtrennung und Dehydratisierung nach einem üblichen Verfahren noch

5 6

nicht geeignet ist. Um eine zufriedenstellende Abtren- chanische Scherkräfte, die bsi Vibrations- und Rühr-

nung und Dehydratisierung zu erreichen, wird minde- bewegungen auftreten, zerstören. Das ausgeflockte

stens eines der vorgenannten Eisen- oder Aluminium- Produkt wird entfernt und mit einem Bandfilter unter

salze zugesetzt. Die Menge der Aluminium- oder Verwendung eines Polyestergewebes abfiltriert. Dabei

Eisensalze beträgt 0,01 bis 0,2 Gewichtsprozent, vor- 5 wird ein Druck von 400 Torr, eine Eintauchztit von

zugsweise 0,02 bis 0,1 Gewichtsnrozent, bezogen auf 4 Minuten und eine Adsorptionszeit von 3 Minuten

das Gewicht der die Mikroorganismen enthaltenden eingehalten. Man erhält einen Schlamm mit einem

Suspension. Wassergehalt von 60%. Das nach dem Entfernen des

Die Aluminium- oder Eisensalze werden Vorzugs- Schlammes erhaltene Filtrat ist vollständig durchweise in Form einer wäßrigen Suspension eingesetzt io sichtig.

und können entweder unmittelbar nach der Zugabe Vergleichsbeispiel A
der alkalisch reagierenden Calciumverbindung oder

einige Tage danach zugesetzt werden. Eine gemäß Beispiel 1 hergestellte Suspension von

Die Abtrennung und Dehydratisierung des ausge- Pseudomonas lactamolyticus »FERM ρ 1520« wird mit

flockten Produktes kann auf übliche Weise durchge- 15 1,0°_o Calciumhydroxid versetzt und 5 Minuten bei

führt werden. Zum Beispiel kann das flockige Produkt 100 U/min und anschließend 3 Minuten bei 50 U/min

unter üblichen Bedingungen unter Verwendung von gerührt. Die Mikroorganismen agglomerieren rasch.

üblichen Dekantiervorrichtungen, Zentrifugen oder Die gebildeten Flocken haben einen Durchmesser von

Filtern, wie Oliver-Filtern, Bandfiltern oder Filter- 0,1 bis 2 mm und sind so brüchig, daß sie bereits bei

pressen, abgetrennt und dehydratisiert werden. Man 20 leichter Vibration zerstört werden und wieder in Sus-

erhält ein dehydratisiertes Produkt (Schlamm) mit pension gehen. Diese Flocken werden gemäß Beispiel 1

einem Wassergehalt von 60 bis 80%. Dieser Schlamm unter Verwendung des Bandfilters filtriert. Die Flocken

enthält keine giftigen Schwermetalle und kann daher passieren jedoch das Filtertuch und lassen sich nicht

nach dem Trocknen, z. B. durch Sprühtrocknung, filtrieren.

Trocknung durch heiße Luft oder Trommeltrocknung, 25 Aus diesem Beispiel geht hervor, daß der Zusatz von

als Futtermittel oder zur Bodenverbesserung verwen- Eisen(ill)-chlorid anschließend an den Calciumhy-

det werden. droxidzusatz eine wesentliche Verbesserung bei der

Beispiele des Verfahrens nach der Erfindung werden Abtrennung der Mikroorganismenzellen zur Folge hat.

im folgenden erläutert. Alle Prozentangaben beziehen . .

sich auf das Gewicht. Die im Beispiel 1 verwendete An- 30 Vergleichsbeispiel B

zuchtkultur wird folgendermaßen hergestellt: Eine Suspension von Pseudomonas lactamolyticus

Unter Zusatz von 2,0% Agarpulver zu dem in »FERM ρ 1520« mit einem pH-Wert von 7,2 wird geTabelle I angegebenen Nährmedium wird ein An- maß Beispiel 1 hergestellt. Diese Suspension wird mit zuchtschrägröhrchen hergestellt. Dieses Schrägröhr- 0,05°,, Eisen(III)-chlorid versetzt und gemäß Beichen wird mit Pseudomonas lactamolyticus »FERM 35 spiel 1 gerührt Die gebildeten Flocken sind äußerst ρ 1520« angeimpft und 24 Stunden bei 30⁰C gezüchtet. klein, und der Überstand weist einen hohen Trübungs-Arschließend werden 50 ml des in Tabelle I ange- grad auf.

gebenen Nährmediums in einen 500 ml fassenden Aus diesem Beispiel geht hervor, daß der Zusatz der

Schüttelkolben gegeben und sterilisiert. Dieses Nähr- wenig wasserlöslichen, alkalisch reagierenden CaI-

medium wird mit der vorgenannten Schrägröhrchen- 40 ciumverbindung für die Abtrennung der Mikroorga-

kultur angeimpft und 24 Stunden bei 30 C unter nismenzellen wesentlich ist und daß das Eisen(IIl)-

Schütteln inkubiert. chlorid als Agglomerierungshilfsmittel dient.

Beispiel 1 Vergleichsbeispiel C

Es wird das in Tabelle I aufgeführt Nährmedium 45 Eine gemäß Beispiel 1 hergestellte Suspension wird

verwendet, mit der Ausnahme, daß an Stelle von mit 0,01 % Calciumhydroxid versetzt, wodurch in der

ε-Caprolactavn eine 0,3°/„ige wäßrige Lösung von Suspension ein pH-Wert von 9,5 erreicht wird. Es wird

ε-Caporlactam eingesetzt wird. 2 Liter dieses Nähr- überhaupt keine Agglomeration der Mikroorganis-

mediums werden in einen Standard-Glasfermenter ge- menzellen beobachtet. Auch bei zusätzlicher Zugabe

geben. Jeweils 4% einer Anzuchtkultur von Pseudo- 50 von 0,05% Eisen(III)-chlorid tritt keine Agglomeration

monas lactamolyticus »FERM ρ 1520« werden in in der Suspension ein.

dieses Medium überimpft und anschließend unter . .

aeroben Bedingungen bei einer Luftzufuhr von 2 Liter Vergleichsbeispiel D

pro Minute, einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min, Das gemäß Beispiel 1 durch Zusatz von Calcium-

einer Temperatur von 30°C und einem pH-Wert von 55 hydroxid ausgeflockte Produkt wird mit 0,005%

7,0 ± 0,3 gezüchtet. Nach 6 Stunden ist die Züchtung Eisen(III)-chIorid versetzt. Durch diesen Eisenchlorid-

beendet. Die erhaltene Gärmaische (Suspension) wird zusatz wird nicht die gewünschte Wirkung erzielt. Das

mit 0,5% Calciumhydroxid versetzt und 5 Minuten erhaltene ausgeflockte Produkt passiert das Filtertuch

bei 100 U/min und sodann 3 Minuten bei 50 U/min und kann nicht abgetrennt und dehydratisiert werden,

gerührt. Dabei stellt sich der pH-Wert der Suspension 60 .

auf 12,4 ein. Die Mikroorganismen agglomerieren Beispiel 2

rasch und fallen innerhalb von 2 Minuten aus. An- Die gemäß Beispiel 1 nach Zusatz von Calcium-

schließend wird die Suspension mit 0,05% Eisen(IlI)- hydroxid ausgeflockte Suspension wird 1 Woche

chlorid versetzt und 5 Minuten bei 30 U/min gerührt. stehengelassen und anschließend mit 0,05% Eisen(III)-

Dabei vergrößern sich die Flocken rasch unter Bildung 65 chlorid [oder Eisen(III)-sulfat] versetzt. Man erhält ein

von zähen Flocken mit einem Durchmesser von 2 bis zähes ausgeflocktes Produkt, das mit dem im Beispiel 1

10 mm und einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis erhaltenen Produkt identisch ist. Dieses Produkt kann

1,15. Diese Flocken lassen sich nicht leicht durch me- gemäß Beispiel 1 abgetrennt und dehydratisiert werden.

Beispiele3bis8

Eine gemäß Beispiel 1 hergestellte Suspension von Pseudomonas lactamolyticus »FERM ρ 1250« wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung einer wenig wasserlöslichen, alkalisch reagierenden Calciumver-

bindung und eines Eisen- oder Aluminiumsalzes b handelt. Die Mikroorganismenzellen flocken rasch a und fallen aus. Das ausgeflockte Produkt wird gemi Beispiel 1 abgetrennt und dehydratisiert. Man erhi einen Schlamm mit dem in Tabelle II angegeben niederen Wassergehalt.

Tabelle II

Bei	Art und Menge der wenig	pH-Wert	Art und Menge des Aluminium	Wasser
spiel	wasserlöslichen, alkalisch	der	oder Eisensalzes	gehalt
	reagierenden	Suspension		des
	Calciumverbindungen			Schlam
				mes
	*r/o)*		(%)	(%)
3	Calciumoxid 0,6	12,8	Eisen(IIl)-chlorid 0,05	68
4	Calciumcarbonat 0,8	13,1	Eisen(IIl)-chlorid 0,05	71
5	Calciumhydroxid 0,5	13,2	Eisen(lII)-sulfatO,03	63
	Calciumoxid 0,5		Eisen(I I)-SuIf at 0,03
6	Calciumhydroxid 1,0	13,2	Eisen(I I)-sulfat 0,06	72
7	Calciumoxid 0,8	12,7	Aluminiumsulfat 0,08	70
8	Calciumoxid 0,8	12,7	Aluminiumpolychlorid 0,08	72

Claims

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren Patentansprüche: zur biotechnischen Behandlung von ε-Caprolactam enthaltenden wäßrigen Flüssigkeiten durch aerobe

1. Verfahren zur biotechnischen Behandlung von Züchtung von e-Caprolactam verwertenden Mikrof-Caprolactam enthalten !en wäßrigen Flüssigkeiten 5 Organismen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man durch aerobe Züchtung von f-Caprolactam verwer- Pseudomonas lactamolyticus »FERM ρ 1520« in der tenden Mikroorganismen, dadurch gekenn- Flüssigkeit züchtet, die erhaltene Zellensuspension mit zeichnet, daß man Pseudomonas lactamoly- mindestens einer wenig wasserlöslichen, alkalisch ticus »FERM ρ 1520« in der Flüssigkeit züchtet, die reagierenden Calcium verbindung auf einen pH-Wert erhaltene Zellensuspension mit mindestens einer io von mindestens 10 einstellt, das erhaltene Agglomerat wenig wasserlöslichen, alkalisch reagierenden CaI- durch Zusatz von mindestens einem Eisen- oder AIuciumverbindung auf einen pH-Wert von minde- miniumsalz vergrößert und abtrennt.

stens 10 einstellt, das erhaltene Agglomerat durch Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß

Zusatz von mindestens einem Eisen- oder Alumi- durch Zusatz von mindestens einer wenig wasserlös-

niumsalz vergrößert und abtrennt. 15 liehen, alkalisch reagierenden Calciumverbindung zur

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Suspension des erfindungsgemäßen Mikroorganismus zeichnet, daß man als Calciumverbindung CaI- unter Einstellung eines pH-Wertes von mindestens 10 ciumhydroxyd, Calciumoxid, Calciumcarbonatur.d/ eine rasche Agglomeration unter Flockenbildung ein- oder Calciumhydrogencarbonat verwendet. tritt. Bei anschließendem Zusatz mindestens eines

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch so Eisensalzes, wie Eisen(II)-chlorid, Eisen(lII)-chlorid, gekennzeichnet, daß man als Eisensalz Eisen(U)- Eisen(II)-sulfat oder Eisen(III)-sulfat oder mindestens chlorid, Eisen(Ill)-chlorid, Eisen(H)-sulfat und/ eines Aluminiumsalzes, wie Aluminiumsulfat, eines oder Eisen(IIl)-sulfat verwendet. Alauns oder Aluminiumpolychlorids wird das agglo-

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch merierte ausgedockte Produkt zäh.
gekennzeichnet, daß man als Aluminiumsalz Alu- »5 Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man miniumsulfat, einen Alaun und/oder Aluminium- Flocken von Mikroorganismenzellen, die sich äußerst polychlorid verwendet. leicht abtrennen und dehydratisieren lassen, einen

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, großen Durchmesser aufweisen, sich rasch ausfällen dadurch gekennzeichnet, daß man das Eisen- oder lassen und nicht leicht durch mechanische Scher-Aluminiumsalz in einer Menge von 0,01 bis 0,2 Ge- 30 kräfte, die bei Vibrations- oder Rührbewegungen aufwichtsprozent, bezogen auf das Gewicht der Mi- treten, zerstört werden. Durch übliche Koagulantien kroorganismensuspension, zusetzt. lassen sich Flocken dieser Qualität nicht erhalten.

Außerdem sind bei der erfindungsgemäßen Abtrennung geringere Metallsalzmengen erforderlich als bei

35 üblichen Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren

läßt sich auch in großtechnischem Maßstab einfach und billig durchführen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechni- Der erfindungsgemäß verwendete Stamm verwertet

sehen Behandlung von e-Caprolactam enthaltenden ε-CaproIactam als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, wäßrigen Flüssigkeiten durch aerobe Züchtung von 40 Er gehört auf Grund seiner morphologischen und f-Caprolactam verwertenden Mikroorganismen. physiologischen Eigenschaften sowie auf Grund seines

Bei der Herstellung von Polyamiden, z. B. Nylon 6, Züchtungsverhaltens zu einer neuen Art, die mit keiner ist es zur Reinigung der polymeren Produkte nötig, bisher beschriebenen Art zusammenfällt,
das in einer Mtnge von etwa 10°;, anfallende, nicht . .

umgesetzte Monomer, d. h. r-Caprolactam, abzu- 45 <^a> Morphologische Eigenschaften

trennen. Bisher wurde der Großteil dieses Mono- Gestalt stabförmig

nieren zurückgewonnen und im Kreislauf geführt, Größe 0,7 bis 0,9 · 1,5 bis

während der Rest mit dem Abwasser abgeleitet wurde. 3,5 μ

Da das Monomere im Abwasser nur in Konzen- Beweglichkeit beweglich mit vielen

trationen von etwa 1000 ppm enthalten ist, ist seine 5» monopolaren Geißeln

Rückgewinnung wirtschaftlich nicht vertretbar. Diese Pleomorphismus

Abwässer haben jedoch den Nachteil, daß sie einen der Zellen nicht beobachtet

hohen biologischen Sauerstoffbedarf aufweisen und Sporen nicht beobachtet

daher Schwierigkeiten bei der Abwasseraufbereitung Gram-Färbung gram-negativ

verursachen. 55 Färbung auf Säurefestig-

Es sind verschiedene Mikroorganismen bekannt, keit negativ

die unter Verwertung von ^-Caprolactam als einziger

Kohlenstoffquelle gezüchtet werden können, z. B. (_D) Züchtungseigenschaften

Stämme von Achromobacter cycloclastes, Coryne-

bacterium roseum, Pseudomonas aeruginosa, Pseudo- ⁶° Kulturen auf Rinderbouillon-Agar-Platten: gutes

monas desmolytica und Pseudomonas ovalis (Journal Wachstum; kreisförmige Kolonien; Oberfläche glatt-

of General and Applied Microbiology, Bd. 13 [1967], flächig, konvex, glänzend, durchsichtig oder durch-

S. 125). scheinend; glattrandig, Kolonien butverartig und

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein ein- cremefarben; keine Pigtnentbildung.
faches und billiges Verfahren zur biotechnischen Be- 65 Züchtung auf Rinderbouillon-Agar-Schrägröhrchen: handlung von e-Caprolaclam enthaltenden Flüssig- Wachstum gut, fädig, konvex; Oberfläche glänzend und keiten unter Verwendung von t-Caprolactam verwer- glattflächig, durchscheinend, cremefarben; butterartig, tenden Mikroorganismen zu schaffen. keine Pigmentbildung.