DE1299292B

DE1299292B - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 2-Keto-L-gulonsaeure

Info

Publication number: DE1299292B
Application number: DET24743A
Authority: DE
Inventors: Yoshino Hiroshi; Okazaki Hisayoshi; Nakanishi Itaru; Motizuki Kazuwo; Sasajima Ken-Ichi; Nara Kiyoshi; Isono Masao; Kanzaki Toshihiko
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1962-09-20
Filing date: 1963-09-19
Publication date: 1969-07-17
Also published as: US3234105A; GB994119A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, die als Ausgangsprodukt für die Herstellung der als Vitamin C bekannten, physiologisch wichtigen L-Ascorbinsäure dient, durch Umwandlung von Sorbit mit Hilfe des Enzymsystems von Mikroorganismen aus den Gattungen Pseudonomas oder Acetobacter.
2-Keto-L-gulonsäure kann aus D-Glucose nach der Reichsteinschen Methode über Sorbit, L-Sorbose, Diacetonsorbose und Diaceton-2-keto-L-gulonsäure als Zwischenverbindungen oder nach der Grayschen Methode über 5-Keto-D-gluconsäure und L-Idonsäure hergestellt werden. Bekannt ist in diesem Zusammenhang beispielsweise aus der deutschen Auslegeschrift 1009 583 bzw. der französischen Patentschrift 873 562 sowie den USA: Patentschriften 2 918 492 und 2917435 die Herstellung von 2-Ketogulonsäure aus Gulonsäure, Glukose oder Idonsäure. Bei diesen Verfahren müssen jedoch mehrere Reaktionsstufen durchlaufen werden. Hierdurch sind diese Verfahren in technischer Hinsicht unvorteilhaft, da sie sich nur schwierig kontinuierlich durchführen lassen. Neben der Überwindung dieser Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren hat sich die Erfindung insbesondere auch das Ziel gesetzt, die 2-Keto-L-gulonsäure aus einem leicht zugänglichen Ausgangsmaterial, nämlich aus Sorbit zu gewinnen, den man bekanntlich leicht durch katalytische Hydrierung von Glukose in praktisch quantitativer Ausbeute erhalten kann.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Sorbit mit Mikroorganismen der Familie Pseudomonadaceae, insbesondere vom Genus Pseudomonas oder Acetobacter, oder deren Enzymsystemen nach an sich bekannten Methoden inkubiert. Gemäß der Erfindung gelingt dabei die Umwandlung von Sorbit in 2-Keto-L-gulonsäure in einer einzigen Stufe.
Pseudomonas und Acetobacter sind die Bezeichnungen von Gattungen, die zur Familie Pseudomonadaceae und der Ordnung Pseudomonadales gehören. Diese Klassifizierung stimmt überein mit derjenigen in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 7.Auflage,1957, von Robert S. B r e e d, E. G. D. Murray und Nathan R. S m i t h, herausgegeben von The Williams & Wilkins Company. Wie bereits erwähnt, gehören die Mikroorganismen, die zur Herstellung des Enzymsystems verwendet werden, den Sorbit in 2-Keto-L-gulonsäure umzuwandeln vermag, zur Gattung Pseudomonas und Acetobacter. Einige spezielle Beispiele sind nachstehend aufgeführt: Acetobacter melanogenum ATCC 15163 Acetobacter sp. ATCC 15164 Acetobacter rubiginosus IFO 3243 Acetobacter suboxydans NRRL B-72 Acetobacter gluconicum ATCC 9324 Acetobacter xylinum ATCC 10245 Acetobacter albidus IFO 3250 Acetobacter albidus IFO 3251 Acetobacter albidus IFO 3253 Acetobacter suboxydans IFO 3255 Acetobacter industrium IFO 3260 Bacterium orleanense IFO 3259 Acetobacter cerinus IFO 3263 Acetobacter cerinus IFO 3264 Acetobacter cerinus IFO 3265 Acetobacter cerinus IFO 3266 Acetobacter cerinus var.ammoniacus IFO 3267 Acetobacter cerinus var.ammoniacus IFO 3269 Acetobacter cerinus IFO 3268 Pseudomonas strafaciens IFO 3309 Pseudomonas coronafaciens IFO 3310 Pseudomonas sp. ATCC 15165 Anmerkung: Nach dem Klassifizierungssystem von Bergey's Manual of Determinativc Bacteriology gehört Bacterium orleanense zur Gattung Acetobacter.
Die Zahlen und Buchstaben hinter den Mikroorganismen geben die jeweiligen Hinterlegungsnummern der Stämme bei den folgenden Stellen an: Northern Utilization Research Brauch, US.-Department of Agriculture, Peoria, 11l. USA. (NRRL), American Type Culture Collection, Washington, D. C., USA. (ATCC), und Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO).
Die Festlegung der Bezeichnung der Species ist jedoch zuweilen kompliziert und verwickelt. Auf jeden Fall sind die Mikroorganismen, die nach der Klassifizierung von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology zu den Gattungen Pseudomonas oder Acetobacter gehören und das Enzymsystem bilden können, das Sorbit in 2-Keto-L-gulonsäure umwandelt, in der vorliegenden Beschreibung auch unter diesen Gattungen aufgeführt, auch wenn sie nach anderen Nomenklaturen unter andere Gattungsbezeichnungen fallen.
Die für die Zwecke der Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind außer bei den obengenannten Stellen beim Centralbureau voor Schimmelcultures, Holland, und bei der National Collection of Industrial Bacteria, Teddington, England, erhältlich. Diese wilden Kulturen lassen sich auch leicht von Blumen, Früchten oder aus dem Boden gewinnen.
Die obengenannten Mikroorganismen können in Mutanten umgewandelt werden, die in höherem Maße als die wilden Ausgangsstämme die Fähigkeit haben, das Enzymsystem zu bilden, das Sorbit in 2-Keto-L-gulonsäure umzuwandeln vermag. Diese Mutation kann durch Behandlung der wilden Stämme mit einem mutagenen Stoff, z. B. Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen oder salpetriger Säure, ausgelöst werden. Es ist auch möglich, einen durch spontane Mutation auftretenden Stamm zu isolieren.
Die Induktion der gewünschten Mutation an wilden Stämmen kann in bekannter Weise vorgenommen werden. Geeignete Methoden sind beispielsweise in »Methods in Medical Research«, Band 3 von R. W. G e r a r d, herausgegeben von YEAR Book Publishers, Inc., Chicago, 1950, und »Nature«, Bd.183, S.1829 (1959), von F. K a u d e w i t z beschrieben.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann nach den folgenden beiden Methoden durchgeführt werden: 1. Ein Mikroorganismus wird in einem Medium gezüchtet, das Sorbit und andere geeignete Nährstoffe enthält.
2. Nach der Züchtung führt man entweder die ganze Kultur, die aus der Kultur abgetrennten Zellen oder die aus den Zellen erhaltenen Enzympräparate nach den in der Enzymologie üblichen Methoden mit Sorbit zusammen.
Bei der Methode 1 wird der Mikroorganismus in einem wäßrigen Medium unter Belüftung gezüchtet. Die Züchtung ist bei pH-Werten zwischen etwa 4 und 9, vorzugsweise zwischen etwa 5 und 8, durchzuführen. Bevorzugt werden Temperaturen von etwa 20 bis 30°C, besonders von etwa 25 bis 30°C. Die Bebrütungsdauer ist verschieden je nach der Art des Mikroorganismus und des verwendeten Nährmediums, jedoch werden mit Bebrütungsdauern von 3 bis 10 Tagen gewöhnlich die besten Ausbeuten erhalten.
Die Sorbitkonzentration im Medium ist verschieden je nach der Art des Mikroorganismus, sie beträgt jedoch im allgemeinen etwa 1 bis 200 g/1, vorzugsweise etwa 5 bis 100 g/1.
Das Kulturmedium muß im allgemeinen die Nährstoffe für den Mikroorganismus enthalten, z. B. assimilierbare Kohlenstoffquellen, digerierbare Stickstoffquellen und vorzugsweise anorganische Substanzen, Vitamine, Spurenelemente und sonstige wachstumsfördernde Faktoren. Sorbit selbst kann als Kohlenstoffquelle dienen, jedoch kann man auch Stärke, Rohrzucker, Lactose, Dextrin, Glycerin oder Maltose hilfsweise als Kohlenstoffquelle verwenden. Ihre Konzentration beträgt etwa 1 bis 10 g/1. Als Stickstoffquelle eignen sich die verschiedensten organischen oder anorganischen Substanzen, z. B. Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Kasein, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Harnstoff, Nitrate oder Ammoniumsalze. Als anorganische Nährstoffe kommen beispielsweise Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat, Ferro- und Ferrichloride oder Calciumcarbonat in Frage. Da die Bestandteile des Mediums je nach der Art des Mikroorganismus verschieden sind, ist es zweckmäßig, von Fall zu Fall ein geeignetes Medium zusammenzustellen.
Bei der Methode 2 wird der Mikroorganismus unter den gleichen Bedingungen wie bei der Methode 1 bebrütet. Bei einer Bebrütungsdauer von 1 bis 2 Tagen werden gewöhnlich die besten Ergebnisse hinsichtlich der Bildung von Zellen erhalten, die aus Sorbit 2-Keto-L-gulonsäure zu bilden vermögen. Nach einer Arbeitsweise gibt man Sorbit als solches oder als wäßrige Lösung in solcher Menge zum Kulturmedium, das die Sorbitkonzentration etwa 1 bis 200 g/1 beträgt. Das Gemisch kann etwa 1 Tag unter den gleichen Bedingungen wie bei der vorhergehenden Bebrütung bebrütet werden. Nach einer anderen Arbeitsweise trennt man die Zellen durch Zentrifugieren aus dem Kulturmedium ab und suspendiert sie erneut in einem wäßrigen Medium, das mit Phosphaten, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan usw. bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 8 gepuffert wird. Dann wird Sorbit auf die oben beschriebene Weise zugegeben. Die anschließende Bebrütung kann ebenfalls unter den vorstehend beschriebenen- Bedingungen durchgeführt werden.
Die im Reaktionsgemisch gebildete 2-Keto-L-gulonsäure muß nicht abgetrennt werden, vielmehr kann man Reaktionsgemisch unmittelbar der Veresterung und anschließenden Enolisierung und Lactonisierung unter Bildung von L-Ascorbinsäure unterwerfen. Will man jedoch die 2-Keto-L-gulonsäure aus dem Reaktionsgemisch abtrennen, so trennt man sie zweckmäßig als Salz oder durch Ausnutzung der Unterschiede zwischen Produkt und Verunreinigungen hinsichtlich der Löslichkeit, der Adsorbierbarkeit oder des Verteilungskoeffizeinten zwischen zwei Lösungsmitteln ab. Am vorteilhaftesten erfolgt die Abtrennung des Produkts unter Verwendung eines Adsorptionsmittels, z. B. von Ionenaustauschharzen. Die auf diese Weise erhaltene 2-Keto-L-gulonsäure ist im allgemeinen nicht rein und kann nach üblichen Methoden, z. B. Umkristallisation und Chromatographie, gereinigt werden.
Wie bereits erwähnt, kann die 2-Keto-L-gulonsäure gegebenenfalls nach bekannten Verfahren in L-Ascorbinsäure umgewandelt werden. Die letztere wird im allgemeinen durch Veresterung von 2-Keto-L-gulonsäure in Gegenwart einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure, Salzsäure oder von stark sauren Kationenaustauschharzen als Katalysator, anschließende Enolisierung des Esters und anschließende Lactonisierung der Enolverbindung synthetisiert.
In folgenden Beispielen sind sämtliche Mengenangaben auf das Gewicht bezogen, falls nicht anders angegeben. Die Temperaturen sind unkorrigiert.

Beispiel l Zellen eines ausgewählten Stamms von Acetobacter sp., ATCC 15164, die auf einem Sorbit-Hefeextrakt-Agar-Nährboden 2Tage bei 28°C bebrütet worden waren, wurden in sterilem Wasser suspendiert. Mit 1 cm" dieser Zellsuspension wurde eine 1-1-Schüttelflasche beimpft, die 150 cm$ des folgenden wäßrigen Mediums enthielt, das vorher in einem Autoklav bei einem Dampfdruck von 1,05 atü sterilisiert worden war

Sorbit ........................... 2,0°/o

Glucose ......................... 0,5°/0

Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,501,

CaCO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,01/,)

Die Bebrütung wurde 7 Tage bei 28°C unter Schütteln durchgeführt. Das Kulturmedium wurde mit 50 g Aktivkohle behandelt und filtriert. Das Filtrat wurde über das Kationenaustauschharz #>Amberlite IR-120<c geleitet. Die ablaufende Lösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei rohe, kristalline 2-Keto-L-gulonsäure erhalten wurde.

Das rohe, kristalline Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 160°C, jedoch zeigten die umkristallisierte Probe und ihr Methylester die gleichen physikalischen Eigenschaften (z. B. Schmelzpunkt, Infrarot-Absorptionsspektrum) wie eine bekannte Probe von 2-Keto-L-gulonsäure und ihr Methylester.

Schmelzpunkt der freien Säure: 165 bis 166°C. Elementaranalyse für C,H1007H20:

Berechnet ... C 34,010/0, H 5,7 0/0;

gefunden ... C 34,740/0, H 5,29°/0.

Schmelzpunkt des Methylesters: 154 bis 155°C. Elementaranalyse für C7H"07:

Berechnet . . . C 40,28 0/0, H 5,62 0/0;

gefunden ... C 40,3 0/0, H 5,6 0/0.

Beispie12 Mit einer Öse wurden Zellen eines ausgewählten Stamms von Acetobacter sp., ATCC 15164, in eine Schüttelflasche übergeführt, die 500 cmg des folgenden wäßrigen Mediums enthielt, und 18 Stunden bei 30'C unter Schütteln bebrütet:

Sorbit ........................... 20/0

Glucose ......................... 0,50/0

Hefeextrakt ...................... 0,50/0

Für die eigentliche Erzeugung von 2-Keto-L-gulonsäure wurde ein Grundmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

Sorbit ........................... 5,0°/0

Glucose ......................... 0,5010

Hefeextrakt ...................... 0,50/0

CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/0

500 em3 des bebrüteten Inoculums wurden zu 301 <des obengenannten Mediums in einem Gärgefäß gegeben, das ein Fassungsvermögen von 501 hatte. Die Bebrütung wurde bei 28 bis 29°C bei einer Rührgeschwindigkeit von 280 UpM, unter Zuführung von 15 bis 241 Luft je Minute und bei einem Innendruck von 1,05 bis 1,4 kg/cm2 durchgeführt. Nach einer Bebrütungsdauer von 150 Stunden hatte die Ausbeute an 2-Keto-L-gulonsäure etwa 500 mg/100 cm3 Kulturmedium erreicht. Die Zellen und Feststoffe im Kulturmedium wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, wobei etwa 271 klares Filtrat erhalten wurden. 11 des Filtrats wurde mit 50 g Aktivkohle entfärbt, über das Harz Amberlite IR-120 geleitet und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Die Ausbeute an 2-Ketoi.-gulonsäure betrug etwa 4,3 g/1 Filtrat.

Beispiel 3 Zellen eines ausgewählten Stamms von Acetobacter cerinus, WO 3266, die 2 Tage bei 28°C auf einem Sorbit-Hefeextrakt-Agar-Nährboden bebrütet worden waren, wurden in 10 cms sterilem Wasser suspendiert. Mit 5 cm3 dieser Zellsuspension wurde eine 14 Schüttelflasche beimpft, die 150 cms eines wäßrigen Nährmediums enthielt, vorher in einem Autoklav bei einem Wasserdampfdruck von 1,05 atü sterilisiert worden war und folgende Zusammensetzung hatte:

Sorbit ........................... 50/0

Glucose ......................... 0,50/0

Hefeextrakt ...................... 0,50/0

CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/0

Die Bebrütung wurde 10 Tage bei 28°C unter Schütteln mit einer Frequenz von 225 durchgeführt. Das Kulturmedium wurde filtriert und das Filtrat über Amberlite IR-120-Harz geleitet. Die als Produkt erhaltene 2-Keto-L-gulonsäure wurde dann an Amberlite IR-45-Harz adsorbiert. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde das Produkt mit ln-Kaliumhydroxyd eluiert und das Eluat eingeengt und mit Aktivkohle entfärbt. Die entfärbte Lösung wurde erneut über Amberlite IR-120-Harz geleitet und die ablaufende Lösung durch schlagartige Verdampfung eingeengt. Aus dem Kulturmedium von zehn Schüttelflaschen wurden auf diese Weise 4,7 g rohe 2-Keto-L-gulonsäure erhalten.

Beispie14 Mit einer Öse wurden Zellen eines mutierten Stammes von Acetobacter suboxydans, NRRL, B-72, in eine 200-cm3-Schüttelflasche übergeführt, die 15 cm" eines wäßrigen Mediums der nachstehenden Zusammensetzung enthielt, und bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bebrütet:

Sorbit ........................... 2,00/0

Polypepton ...................... 0,10/0

Casaminosäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,250/0

Glycerin ......................... 0,10/0

KH2P04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 0,05010

M9S04 # 7H20 . . . . . . . . . .. . . . .. . . . 0,050/0

Während der Bebrütung wurde eine geringe Menge des Kulturmediums alle 2 Tage aus der Schüttelflasche entnommen und mit phenolgesättigtem Wasser als Lösungsmittelsystem chromatographiert. Die Papierzone, die der 2-Keto-L-gulonsäure entsprach, wurde abgeschnitten und mit Wasser eluiert. Die eluierte Lösung wurde mit Somogyi-Nelson-Reagenzien behandelt, um die gebildete Menge an 2-Keto-L-gulonsäure zu ermitteln. Folgendes Ergebnis wurde erhalten:

Tage

3 1 5 1 7

2-Keto-L-gulonsäure (V,g/cm3) . . I 120 (1850I 2100

Beispiel s Ein mutierter Stamm von Acetobacter suboxydans (NRRL B-72) wurde von einem Agar-Nährboden in eine 2-1-Schüttelflasche gespült, die 500 cm3 eines wäßrigen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:

Sorbit ........................... 20/0

Glycerin ......................... 0,010/0

Polypepton ...................... 0,050/0

Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00/0

K2HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0070/0

M9S04 # 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0010/0

FeS04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0010/0

KH2P04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... 0,0030/0

Der Kolben wurde 48 Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Dieses Kulturmedium diente als Inoculum. 500 cm3 dieses Kulturmediums wurden zu 301 eines Mediums der obengenannten Zusammensetzung in einem Gefäß gegeben, das ein Fassungsvermögen von 501 hatte. Die Bebrütung wurde bei 28°C, einer Rührerdrehzahl von 260 UpM und unter Zuführung von 301 Luft je Minute durchgeführt. Der Reaktionsfortschritt wurde verfolgt, indem auf die im Beispiel 4 beschriebene Weise kleine Proben des Kulturmediums genommen wurden und der Gehalt an 2-Keto-L-gulonsäure bestimmt wurde. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Tage

3 @ 5 j 7 1 10

2-Keto-L-gulonsäure

(v-g/cm3) . . . . . . . . . . . . .

130

22001250012500

251 des Kulturmediums wurden mit »Hyflo Super Cell« filtriert, und das Filtrat wurde über Ionenaustauschharz »Amberlite IR-200« (H+-Typ) geleitet. Die saure Fraktion wurde dann an einem Ionenaustauschharz »Amberlite XE-168« adsorbiert und mit 1 n-Ammoniumhydroxyd eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und mit Aktivkohle entfärbt. Der pH-Wert wurde dann. durch weitere Behandlung mit dem Ionenaustauschharz »Amberlite IR-200« auf etwa 1,5 eingestellt, worauf Calciumhydroxyd bis zu einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 zugegeben wurde. Nach der Filtration wurde der pH-Wert des Filtrats erneut mit Ionenaustauschharz »Amberlite IR-200« auf 1,5 eingestellt. Anschließend wurde die 2-Keto-L-gulonsäure an Ionenaustauschharz »Amberlite XE-168« adsorbiert und mit 0,1n-Ammoniumhydroxyd eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 45 g kristalline 2-Keto- L-gulonsäure erhalten wurden. Dieses Produkt hatte die gleichen physikalischen Eigenschaften wie eine bekannte Probe von 2-Keto-L-gulonsäure.

Beispiel 6 Die nachstehenden Mikroorganismen wurden auf die im Beispiel 4 beschriebene Weise bebrütet. Die Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure wurde durch Papierchromatographie mit wassergesättigtem Phenol bestimmt. Acetobacter suboxydans NRRL B-72 Acetobacter gluconicum ATCC 9324 Acetobacter xylinum ATCC 10245 Acetobacter albidus IFO 3250 Acetobacter albidus IFO 3251 Acetobacter albidus IFO 3253 Acetobacter suboxydans IFO 3255 Acetobacter industrium IFO 3260 Bacterium orleanense IFO 3259 Acetobacter cerinus IFO 3263 Acetobacter cerinus IFO 3264 Acetobacter cerinus IFO 3265 Acetobacter cerinus var ammoniacus IFO 3267 Acetobacter cerinus var ammoniacus IFO 3269 Acetobacter cerinus IFO 3268 Beispiel 7 Ein ausgewählter Stamm von Pseudomonas striafaciens (IFO 3309) wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise bebrütet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Tage

i. 3 I 5 I

2-Keto-L-gulonsäure (#tg/cms) . . I 500 1600 1800

-Beispiel 8 Der gleiche Stamm von Pseudomonas striafaciens wie im Beispiel 7 wurde auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise bebrütet, wobei jedoch folgende Medien verwendet wurden: Medium für die Inoculumkultur:

Sorbit ................... . ..... 2,00/0

Hefeextrakt .....................: 0,50/0

Grundmedium für die eigentliche Bebrütung:

Sorbit ........................... 5,0%

Hefeextrakt ...................... 0,5%

Polypepton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,20/,)

KIHP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10/0

M9S04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05010

Während der Bebrütung wurde eine Probe des Kulturmediums jeden 2. Tag aus dem Gefäß genommen und die gebildete Menge an 2-Keto-L-gulonsäure auf die im Beispiel 4 beschriebene Weise bestimmt. Folgendes Ergebnis wurde erhalten:

Tage

3 1 5 J 7

2-Keto-L-gulonsäure (#tg/cm3) . . I 170 I 1500 3600

Auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise wurden 53 g kristalline 2-Keto-L-gulonsäure erhalten. Das kristalline Produkt hatte die gleichen physikalischen Eigenschaften wie eine bekannte Probe von 2-Keto-L-gulonsäure. Beispiel 9 Mit der von einer Öse aufgenommenen Menge von Pseudomonas striafaciens IFO 3309 Pseudomonas coronafaciens IFO 3310 Pseudomonas sp. ATCC 15165 wurde ein Schüttelkolben beimpft, der ein Medium folgender Zusammensetzung enthielt:

Sorbit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0%

Glycerin ......................... 0,01%

Polypepton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05010

Maisquellwasser .................. 1,00/0

KH,P04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0030/,

KZHPO4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0070/0

MgS04 - 711,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0010/0

FeS04 - 714,0 . . : . . . . . . :.. . . . . . . . . 0,001%

NaCI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0051110

Die Bebrütung wurde bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt. Die gebildete Menge an 2-Keto-L-gulonsäure wurde durch Papierchromatographie mit wassergesättigtem Phenol als Lösungsmittelsystem bestimmt.

Beispiel 10 Mit der an einer Öse aufgenommenen Zellmenge eines ausgewählten Stamms von Acetobacter melanogenum ATCC 15163, wurde ein Schüttelkolben bebrütet, der 500 cm$ eines wäßrigen Inoculummediums folgender Zusammensetzung enthielt:

Sorbit ........................... 2,00/0

Glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,501,

Hefeextrakt . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . 0,5010

Die Bebrütung wurde 18 Stunden bei 30°C unter Schütteln vorgenommen. Für die eigentliche Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure wurde ein Grundmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

Sorbit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0010

Glucose ......................... 0,5%

Hefeextrakt ...................... 0,5%

CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/,

500 cmg des bebrüteten Inoculums wurden zu 301 des genannten Mediums in einem rostfreien Gefäß gegeben, das ein Fassungsvermögen von 501 hatte. Die Bebrütung wurde bei 28 bis 29°C, einer Rührgeschwindigkeit von 280 UpM, einer Luftzuführung von 15 bis 24l je Minute und bei einem Innendruck von 1,05 bis 1,4 kg/cm2 durchgeführt. Nach einer Bebrütungsdauer von 150 Stunden hatten sich 650 mg 2-Keto-L-gulonsäure/100 cm" Kulturmedium gebildet. Die Zellen und die Feststoffe des Kulturmediums wurden durch Zentrifugieren entfernt, wobei etwa 271 klares Filtrat erhalten wurden. 11 des Filtrats wurde mit 50 g Aktivkohle entfärbt und über Ionenaustauschharz »Amberlite IR-120« geleitet und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Die Ausbeute an kristalliner 2-Keto-L-gulonsäure betrug etwa 5,3 g/1 Filtrat. Beispiel 11 Mit einer von einer Öse aufgenommenen Zellmenge eines Stammes von Pseudomonas sp., ATCC 15165, wurde ein Schüttelkolben beimpft, der 500 cm3 eines wäßrigen Inoculummediums folgender Zusammensetzung enthielt:

Sorbit ........................... 2,0°/o

Glucose ......................... 0,5°/o

Hefeextrakt ...................... 0,50/0

Die Bebrütung wurde 18 Stunden bei 30°C unter Schütteln durchgeführt.

Für die Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure wurde ein Grundmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

Sorbit ....... . ................... 5,0°/o

Glucose ......................... 0,5°/0

Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5010

CaC03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/0

500 cm3 des bebrüteten Inoculums wurden zu 301 des obengenannten Mediums in einem nichtrostenden Gefäß gegeben, das ein Fassungsvermögen von 501 hatte. Die Bebrütung wurde bei 28 bis 29°C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 280 UpM unter Zuführung von 15 bis 241 Luft je Minute bei einem Innendruck von 1,05 bis 1,4 kg/cm2 durchgeführt. Nach einer Bebrütungsdauer von 150 Stunden hatte die 2-Keto-L-gulonsäure eine Konzentration von etwa 120 mg/100 cm3 Kulturmedium erreicht. Die Zellen und Feststoffe wurden durch Zentrifugieren aus dem Kulturmedium entfernt, wobei 271 klares Filtrat erhalten wurden. 11 des Filtrats wurde mit 50 g Aktivkohle entfärbt, über Ionenaustauschharz »Amberlite IR-120« geleitet und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Die Ausbeute an kristalliner 2-Keto-L-gulonsäure betrug etwa 0,97 g/1 Filtrat.

Beispiel 12 Mit einer von einer Öse aufgenommenen Zellmenge eines ausgewählten Stamms von Acetobacter sp. (ATCC 15164) wurde ein Schüttelkolben beimpft, der 500 cm3 eines Inoculummediums folgender Zusammensetzung enthielt:

Sorbit ........................... 2,00/0

Glucose ......................... 0,50/0

Hefeextrakt ...................... 0,50/0

Die Bebrütung wurde 18 Stunden bei 30°C unter Schütteln durchgeführt.

Für die eigentliche Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure wurde ein Grundmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

Sorbit ........................... 5,00/0

Glucose ......................... 0,50/0

Hefeextrakt ...................... 0,50/0

CaC03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/0

500 cm3 des bebrüteten Inoculums wurden zu 301 des obengenannten Mediums in einem Gefäß gegeben, das ein Fassungsvermögen von 501 hatte. Die Bebrü tung wurde bei 28 bis 29°C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 280 UpM unter Zuführung einer Luftmenge von 15 bis 241 je Minute und bei einem Innendruck von 1,05 bis 1,4 kg/cm2 durchgeführt. Nach einer Bebrütungsdauer von 150 Stunden wurde die Hälfte des Kulturmediums über ein Ionenaustauschharz »Amberlite IR-120« (H-Typ) geleitet, mit Aktivkohle entfärbt und dann eingeengt. Das erhaltene Produkt wurde abfiltriert und mit Aceton gewaschen. Hierbei wurden 60 g kristallines Produkt erhalten, das in an sich bekannter Weise in L-Ascorbinsäure umgewandelt werden konnte.

Beispiel 13 Zellen eines ausgewählten Stamms von Acetobacter cerinus, der 2 Tage bei 28°C auf einem Sorbit-Hefeextrakt-Agar-Nährboden bebrütet worden war, wurden in 10 cm3 sterilem Wasser suspendiert. Mit 5 cm3 dieser Suspension wurden 150 cm3 eines wäßrigen Mediums beimpft, das vorher in einem Autoklav bei einem Dampfdruck von 1,05 atü sterilisiert worden war, sich in einem 1-1-Schüttelkolben befand und folgende Zusammensetzung hatte:

Sorbit ........................... 5,00/0

Glucose ......................... 0,50/0

Hefeextrakt ...................... 0,50/0

CaCO3 .......................... 2,00/0

Die Bebrütung wurde 10 Tage bei 28°C unter Schütteln bei einer Tourenzahl von 225 UpM durchgeführt. Nach Entfernung der Feststoffe wurde das Kulturmedium mit Ionenaustauschharz IRA-400 behandelt, eingeengt und gekühlt. Die erhaltenen Kristalle wurden mit Aceton gewaschen und dann getrocknet, und konnten in an sich bekannter Weise in 5,2 g reine L-Ascorbinsäure umgewandelt werden.

Beispiel 14 Mit Zellen eines mutierten Stamms von Pseudomonas striafaciens wurde 500 cm3 eines 20/0 Sorbit und 0,5 0/0 Hefeextrakt enthaltenden wäßrigen Inoculummediums beimpft, das sich in einem 2-1-Schüttelkolben befand. Die Bebrütung wurde 24 Stunden bei 28°C auf einer Schüttelvorrichtung, die mit 200 UpM rotierte, durchgeführt. Für die eigentliche Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure wurde ein Medium folgender Zusammensetzung hergestellt:

Sorbit . ...............-.......... 5,00/0

Hefeextrakt ........... ......... 0,50/0

Polypepton ...........:.......... 0,20/0

K2HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10/a

MgSO& - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05010

500 cm3 des bebrüteten Inoculums wurden zu 301 des genannten Mediums in einem Gärgefäß gegeben, das ein Fassungsvermögen von 501 hatte. Die Bebrütung wurde bei 28°C, 260 UpM und unter Zuführung von 301 Luft je Minute 7 Tage durchgeführt, wobei 27 g Kulturmedium erhalten wurden. Das Medium wurde filtriert und das Filtrat mit dem lonenaustausch harz »Amberlite IR-120« unter vermindertem Druck behandelt, wobei 425 g eingeengtes Kulturmedium erhalten wurden. Aus 250 g des eingeengten Kulturmediums konnten 37,2 g des Natriumsalzes von L-Ascorbinsäure erhalten werden. Aus 175 g der obengenannten eingeengten Nährlösung wurden 7 g reine L-Ascorbinsäure erhalten.

Beispiel 15 Mit Zellen eines mutierten Stammes von Pseudomonas coronafaciens wurden auf die im. Beispiel 14 beschriebene Weise 261 Kulturmedium hergestellt. Die Behandlung dieses Mediums ergab 58,5 g L-Ascorbinsäure.
Beispiel 16 Auf die im Beispiel 13 beschriebene Weise wurden Zellen der nachstehend aufgeführten Stämme bebrätet. Durch Behandlung des Kulturmediums konnte L-Ascorbinsäure erhalten werden. Acetobacter suboxydans NRRL B-72 Acetobacter gluconicum ATCC 9324 Acetobacter xylinum ATCC 10245 Acetobacter albidum IFO 3250 Acetobacter albidum IFO 3251 Acetobacter albidum IFO 3253 Acetobacter suboxydans. IFO 3255 Acetobaeter industrium IFO 3260 Bacterium orleanense IFO 3259 Acetobaeter cerinus IFO 3263 Acetobacter cerinus IFO 3264 Acetobacter cerinus IFO 3265 Acetobacter cerinus bar.
ammoniacus IFO 3267 Acetobacter cerinus bar. ammoniacus IFO 3269 Acetobacter cerinus IFO 3268

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, d a d u r c h g e k e n nz e i c h n e t, daB man Sorbit mit Mikroorganismen der Familie Pseudomonadaceae, insbesondere vom Genus Pseudomonas oder Acetobacter oder deren Enzymsystemen nach an sich bekannten Methoden irrkubiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daB man als Mikroorganismus einen Stamm vom Pseudomonas sp. ATCC 15165, Acetobacter melanogenum ATCC 15163, Acetobacter sp. ATCC 15164, Acetobacter cerinus IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3267, IFO 3268 oder IFO 3269, Acetobacter suboxydans NRRL B-72 oder IFO 3255, Acetobacter Gluconicum ATCC 9324, Acetobacter xylinum ATCC 10245, Acetobacter albidus IFO 3250, IFO 3251 oder IFO 3253 oder Acetobacter industrium IFO 3260 verwendet.