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Verfahren zur Herstellung von 7-Chlortetracyclin
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 7-Chlortetracyclin.
Es wurden bisher viele Versuche unternommen, die Ausbeute an 7-Chlortetracyclin zu steigern ; diese Verbindung wird durch Fermentation mittels Nährmedien erhalten, die bestimmte Stämme von S. aureo- faciens enthalten. Diese Stämme erzeugen im allgemeinen sehr geringe Ausbeuten an 7-Chlortetracyclin.
Es wurde versucht, die Ausbeute zu erhöhen, indem man den Nährmedien verschiedene sogenannte Zusätze zugibt.
Erfindungsgemäss wird ein Verfahren zur Herstellung von 7-Chlortetracyclin entwickelt, wobei ein 7-Chlor-5a (lla)-dehydrotetracyclin erzeugender Stamm von Streptomyces aureofaciens in einem wässe- rigenNährmedium gezüchtet wird, das Chloridionen in Gegenwart einer hydroxylhaltigen Verbindung aus folgender Gruppe : Alkanole, vielwertige Verbindungen und Oxime enthält.
Es wurden 21 Verbindungen gefunden, die alle eine starke Zusatzwirkung ausüben, wenn man sie einem Gärmedium hinzugibt, das mit S. aureofaciens Stamm S1308, Stamm 1308-29, Stamm S1308-V146 oder Stamm S1308-V237 beimpft wurde. Wenn man eine solche Kultur unter Standard-aeroben Bedingungen züchtet. wird die erzeugte 7 -Chlortetracyclinmenge von 100 bis 700 r /ml auf etwa 5000 y tril erhöht.
Lebenskraftige Kulturen von S. aureofaciens Stamm S1308, Stamm S13u8-29, Stamm S13u8-V146 und Stamm S1308-V237 wurden bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C. hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 12748 für Stamm S1308, ATCC Nr. 12749 für Stamm S1308-29, ATCC Nr. 12750 für Stamm S1308-V146 und ATCC Nr. 12751 für Stamm S1308-V237.
In einem geeigneten, Chloridionen enthaltenden Gärmedium erzeugen diese Mutanten von S. aureofaciens weitgehend 7-Chlor-5a (lla)-dehydrotetracyclin und nur 100-700 y/ml 7-Chlortetracyclin. Wenn man die erfindungsgemäss verwendeten Zusätze einem solchen Gärmedium zusetzt, wird die 7-Chlortetracy- clin-Erzeugung überraschenderweise auf etwa 5000 y/mlauf Kosten der Erzeugung von 7-Chlor-5a (lla)-de- hydrotetracyclin gesteigert.
Die Zusätze der vorliegenden Erfindung werden anschliessend mit ihrer chemischen Formel wiedergegeben und sind mit 1 - 21 beziffert.
EMI1.1
EMI1.2
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EMI2.1
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Die Wirkungsweise der Zusätze der vorliegenden Erfindung ist nicht bekannt. Sie unterscheiden sich chemisch so stark, dass verschiedene Zusätze auch einen verschiedenen Wirkungsmechanismus haben können. Ihre chemischen Unterschiede sind so gross, dass sie in keiner Weise chemisch äquivalent sind. Die einzige Äquivalenz ist in der Tatsache zu sehen, dass alle wirksame Zusätze sind, obwohl es nicht bekannt ist, ob sie in der gleichen Weise wirken.
Es wird keine Theorie über die Wirkungsweise dieser verschiedenen Zusätze vorgebracht und die Erfindung soll durch keine Theorie über den Wirkungsmechanismus beschränkt sein.
Einige Zusätze der Erfindung sind wirksamer als andere und die Zusätze werden daher je nach ihrer Aktivität in verschiedenen Mengen dem Gärmedium zugesetzt. Sie werden jedoch im allgemeinen in Konzentrationen von etwa 0,001 bis etwa 200,0 mg/ml Gärmaische verwendet.In der folgenden Tabelle I sind die 21 Zusätze der vorliegenden Erfindung in der Reihenfolge abnehmender Wirksamkeit aufgezählt.
Die Aktivität wird, wie klarer aus den folgenden Beispielen hervorgeht, in Mikrogramm erzeugtem
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Tabelle I
EMI4.2
<tb>
<tb> Nr. <SEP> Zusatzverbindung <SEP> Aktivität <SEP> Bevorzugte <SEP> Menge <SEP> der <SEP> hinzuyjmg <SEP> gegebenen <SEP> Zusatzverbindung <SEP> in
<tb> mg/ml <SEP> Maische
<tb> 1 <SEP> Riboflavin <SEP> 508. <SEP> 000 <SEP> 0. <SEP> 001-0. <SEP> 005 <SEP>
<tb> 13 <SEP> 1, <SEP> 2-Naphthochinon-l-oxim <SEP> 14. <SEP> 800 <SEP> 0. <SEP> 01-0. <SEP> 10 <SEP>
<tb> 15 <SEP> 2-Butanonoxim <SEP> 6. <SEP> 250 <SEP> 0. <SEP> 1-0. <SEP> 5 <SEP>
<tb> 18 <SEP> Furildioxim <SEP> 5. <SEP> 400 <SEP> 0. <SEP> 01-0. <SEP> 10 <SEP>
<tb> 16 <SEP> Acetonoxim <SEP> 5. <SEP> 375 <SEP> 0. <SEP> 1-0. <SEP> 5 <SEP>
<tb> 19 <SEP> 2-Furaldoxim <SEP> 4. <SEP> 200 <SEP> 0. <SEP> 01-0. <SEP> 10 <SEP>
<tb> 14 <SEP> iso-Butyraldoxim <SEP> 3. <SEP> 220 <SEP> 0.
<SEP> 1-1. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 17 <SEP> 2-Hydroxybenzochinon-
<tb> - <SEP> 1-oxim <SEP> 2. <SEP> 850 <SEP> 0. <SEP> 1-0. <SEP> 5 <SEP>
<tb> 20 <SEP> n-Butyraldoxim <SEP> 2. <SEP> 160 <SEP> 0. <SEP> 1-1. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 12 <SEP> iso-Butylalkohol <SEP> 1. <SEP> 986 <SEP> 1. <SEP> 0-5. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 21 <SEP> 2-Nitroso-5-hydroxybenzochinon-4-oxim <SEP> 980 <SEP> 0. <SEP> 1-1. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 4 <SEP> Barbaloin <SEP> 877 <SEP> 1. <SEP> 0-5. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 7 <SEP> Propylalkohol <SEP> 591 <SEP> 1. <SEP> 0-10. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 6 <SEP> Äthylalkohol <SEP> 337 <SEP> 5. <SEP> 0-20. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> sec. <SEP> Butylalkohol <SEP> 252 <SEP> 5. <SEP> 0-15. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 8 <SEP> iso-Propylalkohol <SEP> 196 <SEP> 10. <SEP> 0-40. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 5 <SEP> Methylalkohol <SEP> 189 <SEP> 10. <SEP> 0-30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 2 <SEP> Glycerin <SEP> 119 <SEP> 15.
<SEP> 0-40. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 9 <SEP> n-Butylalkohol <SEP> 97 <SEP> 15. <SEP> 0-25. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 3 <SEP> Sorbit <SEP> 31 <SEP> 25. <SEP> 0-75. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 11 <SEP> tert. <SEP> Butylalkohol <SEP> 27 <SEP> 25. <SEP> 0-200. <SEP> 0 <SEP>
<tb>
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Die Fermentationen unter Verwendung der Zusatzverbindungen der vorliegenden Erfindung werden in üblicher Weise ausgeführt. Das Gärmedium enthält also die üblichen Nährstoffe und Mineralsubstanzen.
Als Nährstoffe können z. B. Stärke, Dextrose, Saccharose, Glukose, Melassen, Sojamehl, Erdnussöl, Hefe, Fleischextrakte, Pepton, Harnstoff, Maisquellwasser, distillers solubles, Fischmehl und andere übliche Substanzen verwendet werden. Als anorganische Salze können z. B. Kalziumkarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Salze verschiedener Spurenelemente, wie z. B. Mangan, Kobalt, Zink, Kupfer, Eisen u. dgl. Anwendung finden.
Ein geeigneter S. aureofaciens -Stamm wie z.B. die Mutante S1308 (ATCC Nr.12748) wird aerob in einem geeignetenimpfmedium gezüchtet. Ein typisches, zur Züchtung des ersten Impfstoffes verwendetes Nährmedium wird folgendermassen hergestellt :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> Mengen
<tb> Saccharose <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> Gramm
<tb> Maisquellwasser <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP> Milliliter <SEP>
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> Gramm
<tb> Kalziumkarbonat <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> Gramm
<tb> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> Milliliter <SEP>
<tb>
Ein aliquoter Teil (100 ml) dieses Mediums wird in einen 500 ml Erlenmeyerkolben gebracht und im Autoklaven 20 min bei 1 atü (15 p. s. i) sterilisiert.
Sporen der Mutante S. aureofaciens Stamm S1308 (ATCC Nr. 12748) werden von einem Schrägagar in den Kolben mit sterilem destilliertem Wasser hineingewaschen, so dass sich eine etwa 108 Sporen/ml enthaltende Suspension bildet.
1, 0 ml dieser Suspension wird in den folgenden Beispielen zur Beimpfung des Gärmediums verwendet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschranken.
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EMI5.3
<tb>
<tb> l <SEP> : <SEP> Es(NHSO <SEP> 5. <SEP> 0 <SEP> g
<tb> CaCO3 <SEP> 9,0 <SEP> g
<tb> NHCl <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> MgC12. <SEP> 6H2O <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> FeSo4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,06 <SEP> g
<tb> MnSO. <SEP> 4H2O <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> CoCL,. <SEP> 6H <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g <SEP>
<tb> ZnS0. <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Maisstärke <SEP> 55, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Je 25 ml dieses Gärmediums wurden in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben gebracht und mit je 0, 5 ml Specköl versetzt. Dann wurden in den einen Kolben 0,002 mg/ml Riboflavin gegeben und der andere Kolben zum Vergleich aufbewahrt. Die Kolben wurden in einem Autoklaven 20 min bei 1 atü (15 p. s. i.) sterilisiert und dann auf Zimmertemperatur (25 5 C) abgekühlt.
Dann wurde jeder der beiden Kolben mit 1, 0 ml Impfstoff der Mutante S. aureofaciens S1308 (ATCC Nr. 12748) versetzt. Die Kolben wurden 120 h bei 250C auf einer rotierenden Schüttelapparatur (180 Umdr/min) bebrütet. Nach der Beendigung der Fermentationszeit wurden die Maischen auf 7-Chlortetracyclingehalt geprüft.
Das obige Verfahren wurde in genau der gleichen Weise mit allen weiteren acht in der Tabelle II aufgezählten Zusätzen wiederholt ; es wurde jedoch die angegebene Menge von jeder Zusatzverbindung bei jedem Versuch an Stelle von Riboflavin verwendet.
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In der Tabelle II ist die "Leistung" der Zusatzverbindung die Steigerung der 7-Chlortetracyclin-Erzeugung gegenüber dem Vergleichsversuch infolge der Zugabe der Zusatzverbindung. Die Aktivität jeder Zusatzverbindung ist in y von erzeugtem 7-Chlortetracyclin/mg zugegebener Zusatzverbindung ausgedrückt.
Tabelle II
Untersuchung der Maische
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<tb>
<tb> Nr. <SEP> Zusatzverbindung <SEP> Konzentration <SEP> Untersuchung <SEP> Untersuchung <SEP> Leistung <SEP> Aktivität
<tb> der <SEP> Zusatz-d. <SEP> Maische <SEP> m. <SEP> d.Vergleichs- <SEP> d.Zusatz- <SEP> #/ml
<tb> verbindung <SEP> Zusatzverbindg. <SEP> maische <SEP> verbindg. <SEP>
<tb> mg/l <SEP> #/ml <SEP> #/ml <SEP> #/ml
<tb> 1. <SEP> Riboflavin <SEP> 0. <SEP> 002 <SEP> 1100 <SEP> 84 <SEP> 1016 <SEP> 508. <SEP> 000 <SEP>
<tb> 2. <SEP> Glycerin <SEP> 26. <SEP> 0 <SEP> 3350 <SEP> 255 <SEP> 3095 <SEP> 119
<tb> 3. <SEP> Sorbit <SEP> 51. <SEP> 0 <SEP> 1900 <SEP> 313 <SEP> 1587 <SEP> 31
<tb> 4. <SEP> Barbaloin <SEP> 1. <SEP> 3 <SEP> 1370 <SEP> 230 <SEP> 1140 <SEP> 877
<tb> 8. <SEP> iso-Propylalkohol <SEP> 20. <SEP> 0 <SEP> 4360 <SEP> 448 <SEP> 3912 <SEP> 196 <SEP>
<tb> 9. <SEP> n-Butylalkohol <SEP> 20.
<SEP> 0 <SEP> 2380 <SEP> 448 <SEP> 1932 <SEP> 97
<tb> 10.-sec. <SEP> Butylalkohol <SEP> 10. <SEP> 0 <SEP> 2970 <SEP> 448 <SEP> 2522 <SEP> 252
<tb> 11. <SEP> tert. <SEP> Butylalkohol <SEP> 160. <SEP> 0 <SEP> 4720 <SEP> 355 <SEP> 4365 <SEP> 27
<tb> 12. <SEP> iso-Butylalkohol <SEP> 2. <SEP> 6 <SEP> 5395 <SEP> 231 <SEP> 5164 <SEP> 1986
<tb>
Beispiel 2:
Es wurde ein Gärmedium aus folgenden Bestandteilen hergestellt :
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<tb>
<tb> (NH4)2So4 <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb> CaCo3 <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> NH4Cl <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb> MgCl2 <SEP> . <SEP> 6H2O <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> FeSO4 <SEP> . <SEP> 7H2O <SEP> 0,06 <SEP> g
<tb> MnSO4 <SEP> . <SEP> 4H2O <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> CoCl. <SEP> 6H2O <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g <SEP>
<tb> ZnSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Maisstärke <SEP> 55, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> mit <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Je 25 ml dieses Gärmediums wurden in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben gebracht und jeder Kolben wurde mit 0, 5 ml Specköl versetzt. Die Kolben wurden in einem Autoklaven 20 min bei 1 atü (15 p. s. i.) Druck sterilisiert und dann auf Zimmertemperatur (25 : 5 C) abgekühlt. Zu diesem Zeitpunkt wurden 15, 0 mg/ml Methylalkohol aseptisch zu jedem Kolben zugegeben und der andere Kolben als Vergleichsversuch. behalten. Dann wurden l, 0 ml Impfstoff von der Mutante S.aureofaciens S1308 (ATCC Nr.12748) zu jedem der beiden Kolben hinzugegeben.
Die Kolben wurden 120 h bei 250C auf einer mit 180 Umdr/min
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<tb>
<tb> Nr. <SEP> Zusatzver-Konzentration <SEP> Untersuchung <SEP> Untersuchung <SEP> Leistung <SEP> Aktivität
<tb> bindung <SEP> der <SEP> Zusatz-d. <SEP> Maische <SEP> m. <SEP> d. <SEP> Vergleichs-d. <SEP> Zusatz-Y/ml <SEP>
<tb> verbindung <SEP> Zusatzverbindg. <SEP> maische <SEP> verbindung
<tb> mg/ml <SEP> 7/mol <SEP> Y/ml <SEP> Y/ml
<tb> 5 <SEP> Methylalkohol <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> 3310 <SEP> 270 <SEP> 2840 <SEP> 189
<tb> 6 <SEP> Äthylalkohol <SEP> 12, <SEP> 6 <SEP> 4490 <SEP> 243 <SEP> 4247 <SEP> 377
<tb> 7 <SEP> Propylalkohol <SEP> 5, <SEP> 1 <SEP> 3245 <SEP> 231 <SEP> 3014 <SEP> 591
<tb>
EMI7.3
EMI7.4
<tb>
<tb> 3 <SEP> :
(NHJzSO <SEP> 5. <SEP> 75 <SEP> g
<tb> CACAOS <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> NHCl <SEP> 1. <SEP> 75 <SEP> g
<tb> MnSO. <SEP> 4H20 <SEP> 0,076 <SEP> g
<tb> CoCl2. <SEP> 6HP <SEP> 0, <SEP> 0057 <SEP> g <SEP>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 30,0 <SEP> g
<tb> Maisstärke <SEP> 57,0 <SEP> g
<tb> mit <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Je 25 ml dieses Gärmediums wurden in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben gegeben und jeder der Kolben mit 0, 5 ml Specköl versetzt. Dann wurden zu jedem Kolben 0, 05 mg/ml 1, 2-Naphthochinon-l-oxim zu- gegeben und der andere Kolben als Vergleichskolben behalten. Die Kolben wurden in einem Autoklaven
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s. i.)Nr. 12748) zugegeben. DieKolben wurden 120 h bei 250C auf einer mit 180 Umdr/min rotierenden Schüttelvorrichtung bebrütet. Nach der Beendigung der Fermentationsperioden wurden die Maischen auf 7-Chlortetracyclingehalt geprüft.
Das obige Verfahren wurde in genau der gleichen Weise mit allen weiteren acht in der Tabelle IV wiedergegebenen Zusatzverbindungen wiederholt, jedoch wurde an Stelle von 1, 2-Naphthochinon-l-oxim die angegebene Menge jeder Zusatzverbindung bei jedem Versuch verwendet.
In der Tabelle IV ist die Leistung der Zusatzverbindung die Steigerung der 7-Chlortetracyclin-Erzeu- gung gegenüber dem Vergleichsversuch infolge der Zugabe der Zusatzverbindung. Die Aktivität jeder Zusatzverbindung ist in y von erzeugtem 7-Chlortetracyclin pro mg zugegebener Zusatzverbindung ausgedrückt.
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Tabelle IV Untersuchung der Maische
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<tb>
<tb> Nr. <SEP> Zusatzverbindung <SEP> Konzentration <SEP> Untersuchung <SEP> Untersuchung <SEP> Leistung
<tb> der <SEP> Zusatzverbindung <SEP> der <SEP> Maische <SEP> mit <SEP> der <SEP> Vergleichs-der <SEP> Zusatz-Aktivität <SEP>
<tb> mg/ml <SEP> Zusatzverbindung <SEP> maische <SEP> verbindung <SEP> #/ml
<tb> #/ml <SEP> #/ml <SEP> #/ml
<tb> 13. <SEP> 1, <SEP> 2-Naphthochinon-l-oxim <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 1400 <SEP> 660 <SEP> 740 <SEP> 14. <SEP> 800 <SEP>
<tb> 14. <SEP> iso-Butyraldoxim <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 2250 <SEP> 640 <SEP> 1610'3. <SEP> 220 <SEP>
<tb> 15. <SEP> 2-Butanonoxim <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 1890 <SEP> 640 <SEP> 1250 <SEP> 6. <SEP> 250 <SEP>
<tb> 16. <SEP> Acetonoxim <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 1715 <SEP> 640 <SEP> 1075 <SEP> 5. <SEP> 375 <SEP>
<tb> 17.
<SEP> 2-Hydroxybenzochinon-1-oxim <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 1230 <SEP> 660 <SEP> 570 <SEP> 2. <SEP> 850 <SEP>
<tb> 18. <SEP> Furildioxim <SEP> 0,05 <SEP> 760 <SEP> 490 <SEP> 270 <SEP> 5. <SEP> 400 <SEP>
<tb> 19. <SEP> 2-Furaldoxim <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 850 <SEP> 640 <SEP> 210 <SEP> 4. <SEP> 200 <SEP>
<tb> 20. <SEP> n-Butyraldoxim <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 1740 <SEP> 660 <SEP> 1080 <SEP> 2. <SEP> 160 <SEP>
<tb> 21. <SEP> 2-Nitroso-5-hydroxybenzochinon-4-oxim <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 985 <SEP> 490 <SEP> 495 <SEP> 980
<tb>