DE1442256C3 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure - Google Patents
Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-GlutaminsäureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure aus Kohlenwasserstoffen durch
aerobe Fermentation eines wäßrigen Nährmediums, das einen paraffinischen Kohlenwasserstoff, Thiamin
und einen Mikroorganismus enthält, der zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in L-Glutaminsäure befähigt
ist.
L-Glutaminsäure wird biotechnisch bereits nach mehreren Verfahren gewonnen, die als Kohlenstoffquellen
Kohlenhydrate, wie Stärkehydrolysate, Glukose, Melassen usw., verwenden (siehe z. B. FR-PS
12 66 757, BE-PS 6 35 600).
Die Gewinnung von Mikroorganismen, die zur fermentativen Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in
Aminosäuren, auch in L-Glutaminsäure, befähigt sind, ist bekannt (J. Gen. Appl. Microbiol. 9 [1963], S. 23
bis 30). Die bisher berichteten L-Glutaminsäure-Mengen, die aus Kohlenwasserstoffen gebildet wurden,
sind jedoch so gering, daß die bisherigen Ansätze zur Herstellung von L-Glutaminsäure auf mikrobiologischem
Wege aus Kohlenwasserstoffen keine wirtschaftliche Bedeutung erlangten. In J. Gen. Appl.
Microbiol. 9 (1963), S. 23 bis 30, wird ferner berichtet, daß bei Mikroorganismen, die in einem bestimmten
flüssigen Kerosin-Medium nicht wachsen, bestimmte Vitamine diesem Kerosin-Medium zugesetzt werden,
unter anderem Thiaminchlorid in einer Menge von 100 μg pro Liter Medium, und daß die auf ihre Fähigkeit
zur Bildung von L-Glutaminsäure zu testenden Mikroorganismen in flüssigem Kerosin-Medium gezüchtet
werden.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein wirtschaftliches Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung
von L-Glutaminsäure unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen bzw. KohlenwasserstofTgemischen
zu entwickeln, d. h. ein fermentativ arbeitendes Verfahren, nach welchem bedeutend höhere Ausbeuten
der Aminosäure erzielbar sind.
Diese Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure aus Kohlenwasserstoffen
durch aerobe Fermentation eines wäßrigen Nährmediums, das einen paraffinischen Kohlenwasserstoff,
Thiamin und einen Mikroorganismus enthält, der zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in
L-Glutaminsäure befähigt ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Nährmedium verwendet wird, das
bis zu 10 μg Thiamin pro Liter enthält.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann eine Optimierung des fermentativen Verfahrens im Hinblick
auf die L-Glutaminsäure-Ausbeute erreicht werden. Bei höheren Gehalten kommt es unter Umständen
zu einem übermäßigen Wachstum des Mikroorganismus auf Kosten der angestrebten Bildung von L-Glutaminsäure.
Dies wird durch die noch folgende Tabelle II erläutert.
Die Wirkungen des Thiamingehaltes in dem angegebenen Mengenbereich auf das Wachstum der Kohlenwasserstoff-umwandelnden
Mikroorganismen und die gleichzeitige L-Glutaminsäure-Bildung in einem
n-Undecan als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium sind der folgenden Tabelle I zu entnehmen.
Name der
Mikroorganismenstämme
Mikroorganismenstämme
Wachstum
Angesammelte Mengen an L-Glutaminsäure
(mg/ccm) (mg/ccm)
Nährmedium A
ao Corynebacterium 2,4 0,5
hydrocarboclastus
ATCC 15 592
Arthrobacter simplex 2,0 0,4
ATCC 15 799
Micrococcus roseus 2,1 0,3
Nr. 401
Brevibacterium maris 1,9 0,4
Nr. 477
' Nährmedium B
' Nährmedium B
Corynebacterium 9,8 5,1
hydrocarboclastus
ATCC 15 592
Arthrobacter simplex 2,1 0,5
ATCC 15 799
Micrococcus roseus 9,5 5,2
Nr. 401
Brevibacterium maris 8,3 5,5
Nr. 477
Nährmedium C
Corynebacterium 10,1 5,2
hydrocarboclastus
ATCC 15 592
Arthrobacter simplex 10,3 6,0
ATCC 15 799
Micrococcus roseus 10,2 8,1
Nr. 401
Brevibacterium maris 8,6 10,5
Nr. 477
Diese Nährmedien besaßen die folgenden Zusammensetzungen :
| Nährmedium A | Gewichtsprozent |
| KH2PO4 | 0,1 |
| Na2HPO4 · 12H2O | 0,1 |
| 60 MgSO4-7H2O | 0,1 |
| MnSO4 · 4H2O | 0,002 |
| FeSO4-7H2O | 0,02 |
| (NH4)2SO4 | 2,0 |
| n-Undecan | 5,0 |
| 65 Phenolrot | 0,001 |
| CaCO3 | 2,0 |
Rest Wasser; es wurde auf pH = 7,0 eingestellt.
Nährmedium B
Zu dem Nährmedium A werden 5 μg Thiamin/Liter
gegeben.
Nährmedium C
Zu dem Nährmedium A werden 5 μ-g Thiamin/Liter,
0,1 μg Vitamin B12/Liter, 5μg p-Aminobenzoesäure/
ecm und 0,3 μg Biotin/Liter gegeben.
Die Kulturbedingungen waren: 3O0C, 220 Umdrehungen
pro Minute, 72 Stunden.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind sämtliche Mikroorganismen geeignet,
welche Kohlenwasserstoffe fermentativ in L-Glutaminsäure
umwandeln können. Insbesondere können Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium
und Arthrobacter verwendet werden, obgleich, wie in Tabelle I gezeigt, auch andere Kohlenwasserstoffe
umwandelnde Mikroorganismen geeignet sind.
Als assimilierbare Kohlenstoffquelle zu verwentf.·,
dende Kohlenwasserstoffe können aliphatische Koh- * ·■' lenwasserstoffe mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen eingesetzt
werden. Die besten Ausbeuten an L-Glutaminsäure werden jedoch mit η-Paraffinen erhalten, die
10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen. Zu brauchbaren Kohlenwasserstoffen gehören daher Decon, Undecan,
Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Pentadecan, Hexadecan, Heptadecan, Octadecan, Nonadecan und
Eikosan, sowohl deren η-Paraffine als auch deren Isoparaffine, einzeln oder in Form von Gemischen, wie
sie in der Praxis häufig erhalten werden. Die n-Paraffine n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan,
n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan, n-Heptadecan und n-Octadecan, einzeln oder in Form von Gemischen,
liefern jedoch die besten Ergebnisse. Kohlenwasserstoffe mit 11 oder 12 Kohlenstoffatomen werden
bevorzugt.
Auf Grund der bisherigen Erfahrungen konnte angenommen werden, daß sich die L-Glutaminsäure-Bildung
durch ansteigende Thiamingehalte hatte anheben lassen müssen. Bei Verwendung üblicher Kohlenhydrate
als Kohlenstoffquelle steigt die Aminosäure-Produktion mit der zugefügten Thiaminmenge.
Überraschend wurde gefunden, daß die Bedingungen hinsichtlich der dem Nährmedium zuzufügenden
Thiaminmengen bei Verwendung von Kohlenwasserstoffen andere sind und die gebildete L-Glutaminsäure-Menge
nicht dem Thiamingehalt des Nährmediums proportional ist.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Kohlenwasserstoffe sind billiger als Kohlenhydratausgangsmaterialien,
so daß bei einem Vergleich der biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure aus Kohlehydraten
und Kohlenwasserstoffen die Wirtschaftlichkeit zugunsten des erfindungsgemäßen Verfahrens spricht.
Außerdem bleibt die Gefahr der bei Verwendung von z. B. Melassen für Glutaminsäure-Herstellung auftretenden
erheblichen Infektionen aus. Es ist auch bekannt, daß die Qualität von Melassen starken Schwankungen
unterliegt, was bei Kohlenwasserstoffen nicht der Fall ist. Schließlich sind die Kohlenwasserstoffe als
solche bedeutend weniger anfällig gegen Infektionen als Melassen.
In der folgenden Tabelle II sind die Wirkungen bei variierenden Thiaminmengen gegenübergestellt.
Menge an
Thiamin
im Nährmedium
fcg/Liter)
Wachstum
(mg/ccm)
Angesammelte Mengen an Glutaminsäure
(mg/ccm)
| 0 | 2,0 | 7,0 |
| 5 | 6,6 | 15,0 |
| 10 | 10,1 | 14,3 |
| 20 | 15,0 | 8,5 |
| 50 | 20,9 | 2,0 |
Verwendeter Mikroorganismenstamm: Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592.
Zusammensetzung des Nährmediums
Gewichtsprozent
KH2PO4 0,1
Na2HPO4 · 12H8O 0,1
ao MgSO4-7H2O 0,1
MnSO4 · 4H2O 0,002
FeSO4 · 7H2O 0,002
(NH4)SO4 2,0
n-Undecan 5
a5 Phenolrot 0,001
CaCOa 2,0
Thiamin (wie in Tabelle II angegeben)
Rest Wasser; es wurde auf pH = 7,0 eingestellt.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Sämtliche Prozentangaben beziehen sich
auf das Gewicht.
20 ecm eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung:
0,1% KH8PO4,
0,1% Na2HPO4-12H2O,
0,1% MgSO4-7H2O,
0,002% FeSO4-7H2O,
0,002% FeSO4-7H2O,
0,002% MnSO4-4H2O,
5μg/Liter Thiamin,
20% (NHJ2SO4,
5% n-Undecan,
0,001% Phenolrot,
0,001% Phenolrot,
Rest Wasser (es wurde auf pH = 7,0 eingestellt)
wurden in einem Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 250 ecm hergestellt. Das Kultur-
so medium wurde mit Corynebacterium hydrocarboclastus
ATCC 15 592 beimpft und aerob bei 3O0C 72 Stunden unter Schütteln mit 220 Schüttelbewegungen
pro Minute bebrütet. Nach Ablauf der angegebenen Zeit betrug die in der Kulturflüssigkeit angesammelte
Menge an L-Glutaminsäure 15,5 mg/ccm. Die L-Glutaminsäure wurde an einem Kationenaustauschharz
adsorbiert und mit Hilfe von verdünntem wäßrigem Ammoniak eluiert. Aus dem erhaltenen
Eluat wurden nach dem üblichen Verfahren etwa 220 mg L-Glutaminsäurehydrochlorid erhalten.
Wird in gleicher Weise wie oben ohne den Zusatz von Thiamin gezüchtet, beträgt die in dem Kulturmedium
angesammelte Menge an L-Glutaminsäure nur 0,2 mg/ccm.
6S B e i s ρ i e 1 2
Das gleiche Kulturmedium wie im Beispiel 1, in dem jedoch 5% Kerosin als Kohlenstoffquelle verwendet
wurden, wurde mit Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592 beimpft und aerob bei 2O0C
unter Schütteln mit 220 Schüttelbewegungen pro Minute 72 Stunden bebrütet. Nach Ablauf dieser Zeit
hatten sich in dem Kulturmedium 3,0 mg/ccm L-Glutaminsäure
angesammelt. Bei Aufarbeitung nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 wurden etwa
35 mg L-Glutaminsäurehydrochlorid erhalten.
Wird in gleicher Weise ohne Zusatz an Thiamin gezüchtet,
werden weniger als 0,1 mg/ccm L-Glutaminsäure erhalten.
In einem Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen
von 250 ecm wurden 20 ecm eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
0,1% KH2PO4,
0,1% Na2HPO1 · 12H8O,
0,1% MgSO4-7 H2O,
0,002% FeSO1-7H2O,
0,002% MnSO1-4 H2O,
5 μg/LiteΓ Thiamin,
0,1 n^g/Liter Vitamin B12,
20% (NHJ2SO4,
5% n-Undecan,
0,001% Phenolrot,
Rest Wasser (es wurde auf pH = 7,0 eingestellt).
0,002% MnSO1-4 H2O,
5 μg/LiteΓ Thiamin,
0,1 n^g/Liter Vitamin B12,
20% (NHJ2SO4,
5% n-Undecan,
0,001% Phenolrot,
Rest Wasser (es wurde auf pH = 7,0 eingestellt).
ίο Das Kulturmedium wurde mit Arthrobacter simplex
ATCC 15 799 beimpft und bei 3O0C unter Schütteln mit 220 Schüttelbewegungen 72 Stunden bebrütet.
Nach Ablauf dieser Zeit hatten sich 5,4 mg/ccm L-Glutaminsäure angesammelt. Bei Aufarbeitung nach
dem Verfahren von Beispiel 1 wurden etwa 67 mg L-Glutaminsäurehydrochlorid erhalten.
Wenn das gleiche Kulturmedium ohne Zusatz an Thiamin, Vitamin B12 bzw. beide dieser Verbindungen
verwendet wird, beträgt die angesammelte Menge an
ao L-Glutaminsäure weniger als 0,1 mg/ccm.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure aus Kohlenwasserstoffen durch aerobe Fermentation eines wäßrigen Nährmediums, das einen paraffinischen Kohlenwasserstoff, Thiamin und einen Mikroorganismus enthält, der zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in L-Glutaminsäure befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährmedium verwendet wird, das bis zu 10 [Ag Thiamin pro Liter enthält.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1557464 | 1964-03-23 | ||
| JP1557464 | 1964-03-23 | ||
| DEK0055614 | 1965-03-22 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1442256A1 DE1442256A1 (de) | 1969-05-22 |
| DE1442256B2 DE1442256B2 (de) | 1976-02-12 |
| DE1442256C3 true DE1442256C3 (de) | 1976-09-30 |
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