DE1442256C3 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure - Google Patents

Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure

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DE1442256C3
DE1442256C3 DE19651442256 DE1442256A DE1442256C3 DE 1442256 C3 DE1442256 C3 DE 1442256C3 DE 19651442256 DE19651442256 DE 19651442256 DE 1442256 A DE1442256 A DE 1442256A DE 1442256 C3 DE1442256 C3 DE 1442256C3
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Katsunobu;Kimura Kazuo; Machida; Yamaguchi Ken. Tokio; Tanaka (Japan)
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure aus Kohlenwasserstoffen durch aerobe Fermentation eines wäßrigen Nährmediums, das einen paraffinischen Kohlenwasserstoff, Thiamin und einen Mikroorganismus enthält, der zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in L-Glutaminsäure befähigt ist.
L-Glutaminsäure wird biotechnisch bereits nach mehreren Verfahren gewonnen, die als Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate, wie Stärkehydrolysate, Glukose, Melassen usw., verwenden (siehe z. B. FR-PS 12 66 757, BE-PS 6 35 600).
Die Gewinnung von Mikroorganismen, die zur fermentativen Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in Aminosäuren, auch in L-Glutaminsäure, befähigt sind, ist bekannt (J. Gen. Appl. Microbiol. 9 [1963], S. 23 bis 30). Die bisher berichteten L-Glutaminsäure-Mengen, die aus Kohlenwasserstoffen gebildet wurden, sind jedoch so gering, daß die bisherigen Ansätze zur Herstellung von L-Glutaminsäure auf mikrobiologischem Wege aus Kohlenwasserstoffen keine wirtschaftliche Bedeutung erlangten. In J. Gen. Appl. Microbiol. 9 (1963), S. 23 bis 30, wird ferner berichtet, daß bei Mikroorganismen, die in einem bestimmten flüssigen Kerosin-Medium nicht wachsen, bestimmte Vitamine diesem Kerosin-Medium zugesetzt werden, unter anderem Thiaminchlorid in einer Menge von 100 μg pro Liter Medium, und daß die auf ihre Fähigkeit zur Bildung von L-Glutaminsäure zu testenden Mikroorganismen in flüssigem Kerosin-Medium gezüchtet werden.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein wirtschaftliches Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen bzw. KohlenwasserstofTgemischen zu entwickeln, d. h. ein fermentativ arbeitendes Verfahren, nach welchem bedeutend höhere Ausbeuten der Aminosäure erzielbar sind.
Diese Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure aus Kohlenwasserstoffen durch aerobe Fermentation eines wäßrigen Nährmediums, das einen paraffinischen Kohlenwasserstoff, Thiamin und einen Mikroorganismus enthält, der zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in L-Glutaminsäure befähigt ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Nährmedium verwendet wird, das bis zu 10 μg Thiamin pro Liter enthält.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann eine Optimierung des fermentativen Verfahrens im Hinblick auf die L-Glutaminsäure-Ausbeute erreicht werden. Bei höheren Gehalten kommt es unter Umständen zu einem übermäßigen Wachstum des Mikroorganismus auf Kosten der angestrebten Bildung von L-Glutaminsäure. Dies wird durch die noch folgende Tabelle II erläutert.
Die Wirkungen des Thiamingehaltes in dem angegebenen Mengenbereich auf das Wachstum der Kohlenwasserstoff-umwandelnden Mikroorganismen und die gleichzeitige L-Glutaminsäure-Bildung in einem n-Undecan als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium sind der folgenden Tabelle I zu entnehmen.
Tabelle I
Name der
Mikroorganismenstämme
Wachstum
Angesammelte Mengen an L-Glutaminsäure
(mg/ccm) (mg/ccm)
Nährmedium A
ao Corynebacterium 2,4 0,5
hydrocarboclastus
ATCC 15 592
Arthrobacter simplex 2,0 0,4
ATCC 15 799
Micrococcus roseus 2,1 0,3
Nr. 401
Brevibacterium maris 1,9 0,4
Nr. 477
' Nährmedium B
Corynebacterium 9,8 5,1
hydrocarboclastus
ATCC 15 592
Arthrobacter simplex 2,1 0,5
ATCC 15 799
Micrococcus roseus 9,5 5,2
Nr. 401
Brevibacterium maris 8,3 5,5
Nr. 477
Nährmedium C
Corynebacterium 10,1 5,2
hydrocarboclastus
ATCC 15 592
Arthrobacter simplex 10,3 6,0
ATCC 15 799
Micrococcus roseus 10,2 8,1
Nr. 401
Brevibacterium maris 8,6 10,5
Nr. 477
Diese Nährmedien besaßen die folgenden Zusammensetzungen :
Nährmedium A Gewichtsprozent
KH2PO4 0,1
Na2HPO4 · 12H2O 0,1
60 MgSO4-7H2O 0,1
MnSO4 · 4H2O 0,002
FeSO4-7H2O 0,02
(NH4)2SO4 2,0
n-Undecan 5,0
65 Phenolrot 0,001
CaCO3 2,0
Rest Wasser; es wurde auf pH = 7,0 eingestellt.
Nährmedium B
Zu dem Nährmedium A werden 5 μg Thiamin/Liter gegeben.
Nährmedium C
Zu dem Nährmedium A werden 5 μ-g Thiamin/Liter, 0,1 μg Vitamin B12/Liter, 5μg p-Aminobenzoesäure/ ecm und 0,3 μg Biotin/Liter gegeben.
Die Kulturbedingungen waren: 3O0C, 220 Umdrehungen pro Minute, 72 Stunden.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind sämtliche Mikroorganismen geeignet, welche Kohlenwasserstoffe fermentativ in L-Glutaminsäure umwandeln können. Insbesondere können Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium und Arthrobacter verwendet werden, obgleich, wie in Tabelle I gezeigt, auch andere Kohlenwasserstoffe umwandelnde Mikroorganismen geeignet sind.
Als assimilierbare Kohlenstoffquelle zu verwentf.·, dende Kohlenwasserstoffe können aliphatische Koh- * ·■' lenwasserstoffe mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen eingesetzt werden. Die besten Ausbeuten an L-Glutaminsäure werden jedoch mit η-Paraffinen erhalten, die 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen. Zu brauchbaren Kohlenwasserstoffen gehören daher Decon, Undecan, Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Pentadecan, Hexadecan, Heptadecan, Octadecan, Nonadecan und Eikosan, sowohl deren η-Paraffine als auch deren Isoparaffine, einzeln oder in Form von Gemischen, wie sie in der Praxis häufig erhalten werden. Die n-Paraffine n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan, n-Heptadecan und n-Octadecan, einzeln oder in Form von Gemischen, liefern jedoch die besten Ergebnisse. Kohlenwasserstoffe mit 11 oder 12 Kohlenstoffatomen werden bevorzugt.
Auf Grund der bisherigen Erfahrungen konnte angenommen werden, daß sich die L-Glutaminsäure-Bildung durch ansteigende Thiamingehalte hatte anheben lassen müssen. Bei Verwendung üblicher Kohlenhydrate als Kohlenstoffquelle steigt die Aminosäure-Produktion mit der zugefügten Thiaminmenge. Überraschend wurde gefunden, daß die Bedingungen hinsichtlich der dem Nährmedium zuzufügenden Thiaminmengen bei Verwendung von Kohlenwasserstoffen andere sind und die gebildete L-Glutaminsäure-Menge nicht dem Thiamingehalt des Nährmediums proportional ist.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Kohlenwasserstoffe sind billiger als Kohlenhydratausgangsmaterialien, so daß bei einem Vergleich der biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure aus Kohlehydraten und Kohlenwasserstoffen die Wirtschaftlichkeit zugunsten des erfindungsgemäßen Verfahrens spricht. Außerdem bleibt die Gefahr der bei Verwendung von z. B. Melassen für Glutaminsäure-Herstellung auftretenden erheblichen Infektionen aus. Es ist auch bekannt, daß die Qualität von Melassen starken Schwankungen unterliegt, was bei Kohlenwasserstoffen nicht der Fall ist. Schließlich sind die Kohlenwasserstoffe als solche bedeutend weniger anfällig gegen Infektionen als Melassen.
In der folgenden Tabelle II sind die Wirkungen bei variierenden Thiaminmengen gegenübergestellt.
Tabelle II
Menge an
Thiamin
im Nährmedium
fcg/Liter)
Wachstum
(mg/ccm)
Angesammelte Mengen an Glutaminsäure
(mg/ccm)
0 2,0 7,0
5 6,6 15,0
10 10,1 14,3
20 15,0 8,5
50 20,9 2,0
Verwendeter Mikroorganismenstamm: Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592. Zusammensetzung des Nährmediums
Gewichtsprozent
KH2PO4 0,1
Na2HPO4 · 12H8O 0,1
ao MgSO4-7H2O 0,1
MnSO4 · 4H2O 0,002
FeSO4 · 7H2O 0,002
(NH4)SO4 2,0
n-Undecan 5
a5 Phenolrot 0,001
CaCOa 2,0
Thiamin (wie in Tabelle II angegeben)
Rest Wasser; es wurde auf pH = 7,0 eingestellt.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Sämtliche Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht.
Beispiel 1
20 ecm eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung:
0,1% KH8PO4,
0,1% Na2HPO4-12H2O,
0,1% MgSO4-7H2O,
0,002% FeSO4-7H2O,
0,002% MnSO4-4H2O,
5μg/Liter Thiamin,
20% (NHJ2SO4,
5% n-Undecan,
0,001% Phenolrot,
Rest Wasser (es wurde auf pH = 7,0 eingestellt)
wurden in einem Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 250 ecm hergestellt. Das Kultur-
so medium wurde mit Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592 beimpft und aerob bei 3O0C 72 Stunden unter Schütteln mit 220 Schüttelbewegungen pro Minute bebrütet. Nach Ablauf der angegebenen Zeit betrug die in der Kulturflüssigkeit angesammelte Menge an L-Glutaminsäure 15,5 mg/ccm. Die L-Glutaminsäure wurde an einem Kationenaustauschharz adsorbiert und mit Hilfe von verdünntem wäßrigem Ammoniak eluiert. Aus dem erhaltenen Eluat wurden nach dem üblichen Verfahren etwa 220 mg L-Glutaminsäurehydrochlorid erhalten.
Wird in gleicher Weise wie oben ohne den Zusatz von Thiamin gezüchtet, beträgt die in dem Kulturmedium angesammelte Menge an L-Glutaminsäure nur 0,2 mg/ccm.
6S B e i s ρ i e 1 2
Das gleiche Kulturmedium wie im Beispiel 1, in dem jedoch 5% Kerosin als Kohlenstoffquelle verwendet
wurden, wurde mit Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592 beimpft und aerob bei 2O0C unter Schütteln mit 220 Schüttelbewegungen pro Minute 72 Stunden bebrütet. Nach Ablauf dieser Zeit hatten sich in dem Kulturmedium 3,0 mg/ccm L-Glutaminsäure angesammelt. Bei Aufarbeitung nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 wurden etwa 35 mg L-Glutaminsäurehydrochlorid erhalten.
Wird in gleicher Weise ohne Zusatz an Thiamin gezüchtet, werden weniger als 0,1 mg/ccm L-Glutaminsäure erhalten.
Beispiel 3
In einem Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 250 ecm wurden 20 ecm eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
0,1% KH2PO4,
0,1% Na2HPO1 · 12H8O,
0,1% MgSO4-7 H2O,
0,002% FeSO1-7H2O,
0,002% MnSO1-4 H2O,
5 μg/LiteΓ Thiamin,
0,1 n^g/Liter Vitamin B12,
20% (NHJ2SO4,
5% n-Undecan,
0,001% Phenolrot,
Rest Wasser (es wurde auf pH = 7,0 eingestellt).
ίο Das Kulturmedium wurde mit Arthrobacter simplex ATCC 15 799 beimpft und bei 3O0C unter Schütteln mit 220 Schüttelbewegungen 72 Stunden bebrütet. Nach Ablauf dieser Zeit hatten sich 5,4 mg/ccm L-Glutaminsäure angesammelt. Bei Aufarbeitung nach dem Verfahren von Beispiel 1 wurden etwa 67 mg L-Glutaminsäurehydrochlorid erhalten.
Wenn das gleiche Kulturmedium ohne Zusatz an Thiamin, Vitamin B12 bzw. beide dieser Verbindungen verwendet wird, beträgt die angesammelte Menge an
ao L-Glutaminsäure weniger als 0,1 mg/ccm.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure aus Kohlenwasserstoffen durch aerobe Fermentation eines wäßrigen Nährmediums, das einen paraffinischen Kohlenwasserstoff, Thiamin und einen Mikroorganismus enthält, der zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in L-Glutaminsäure befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährmedium verwendet wird, das bis zu 10 [Ag Thiamin pro Liter enthält.
DE19651442256 1964-03-23 1965-03-22 Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure Expired DE1442256C3 (de)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1557464 1964-03-23
JP1557464 1964-03-23
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Publication Number Publication Date
DE1442256A1 DE1442256A1 (de) 1969-05-22
DE1442256B2 DE1442256B2 (de) 1976-02-12
DE1442256C3 true DE1442256C3 (de) 1976-09-30

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