DE1269127B - Fermentatives Verfahren zur Herstellung von 5-Fluoruracilribotid - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES '/WWW? PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

Deutsche Kl.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C07d

A 61k

12 ρ-7/01

30 h-2/36

1269 127
P 12 69 127.9-44
23. Februar 1965
30. Mai 1968

Die Erfindung betrifft ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von 5-Fluoruracilribotid der Formel

OH

OH OH

Dieses Nucleotid ist als ein antagonistisches Mittel des Nucleinsäurestoffwechsels von Bedeutung und wird auch in der biochemischen Forschung gebraucht. Es wurde bisher auf synthetischem Weg durch Umsetzung von 5-Fluoruracil-N-ribosid mit Phosphorsäuremono- oder -dichlorid oder durch Isolierung aus sie enthaltenden Reaktionsgemischen erhalten.

Das Hauptziel dieser Erfindung ist die Entwicklung eines technisch tragbaren, wirtschaftlich günstigen und hohe Ausbeuten liefernden enzymatischen Verfahrens zur Erzeugung von 5-Fluoruracilribotid direkt aus dem 5-Fluoruracil. Dieses Ziel wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, 6871, 15750 oder 15751 unter aeroben Bedingungen in einem fermentierbaren, d. h. fermentierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Verbindungen und Phosphate enthaltenden wäßrigen Nährmedium, das 5-Fluoruracil enthält, züchtet, wobei das 5-Fluoruracil in das 5-Fluoruracilribotid umgewandelt wird. Das 5-Fluoruracil kann dem Kulturmedium zu Beginn oder während des Züchtungsverfahrens, gegebenenfalls in kleinen Anteilen, zugesetzt werden.

Das Nährmedium entspricht, abgesehen von dem als Ausgangsstoff zugesetzten 5-Fluoruracil, der Zusammensetzung solcher Medien, wie sie normalerweise für die Züchtung von Brevibacterium ammoniagenes verwendet werden. Man kann also Medien verwenden, die geeignete Mengen Kohlehydrate oder andere Kohlenstoffquellen (Glucose, Stärkehydrolysale, Melassen), Stickstoffquellen (Harnstoff, Ammoniumchlorid. Ammoniumnitrat), anorganische Verbindungen (Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, CaI-Fermentatives Verfahren zur Herstellung von 5-Fluoruracilribotid

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke und Dipl.-Ing. H. Agular, Patentanwälte,

8000 München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt: Kiyoshi Nakayama, Sagamihara-shi, Haruo Tanaka, Tokio (Japan) Beanspruchte Priorität: Japan vom 24. Februar 1964 (9265)

ciumchlorid) und natürliche stickstoffhaltige Substanzen (Maiseinweichwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl) enthalten.

Die Fermentation selbst verläuft in einer für die Züchtung von Brevibacterium ammoniagenes an sich üblichen Weise, d.h. wird aerob in einer Eintauch- oder Schüttelkultur bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0 vorgenommen, bis die höchstmögliche Ansammlung von gewünschtem Endprodukt in der Fermentationsflüssigkeit erreicht ist, wozu gewöhnlich etwa 2 bis 8 Tage benötigt werden.

Nach Beendigung der fermentativen Umwandlung von 5-Fluoruracil in 5-Fluoruracilribotid, wird das letztere aus der Fermentierungsflüssigkeit in an sich bekannter Weise nach üblichen Verfahren, d. h. durch Ausfällen, Extrahieren usw., gewonnen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung durch zur Zeit bevorzugte Durchführungsformen derselben. Gewichtsteile stehen im gleichen Verhältnis zu Volumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter. Alle Prozentzahlen sind Gewichtsprozente, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wird 24 Stunden bei 30'C in einem Kulturmedium bebrütet, das aus den folgenden Bestandteilen besteht: Glucose 2%, Pepton 1 %, Hefeextrakt 1 %, NaCl 0.3° „. Biotin 30 ;xg und Wasser, aufgefüllt auf 1 Liter.

8111 «J 48'<

10 Volumprozent des so erhaltenen Inoculums werden einem Fermentierungsmedium eingeimpft, das je Liter Wasser folgende Stoffe enthält: Glucose 100 g, Harnstoff 6 g, Dikaliumphosphat 10 g, Monokaliumphosphat 10 g, Magnesiumsulfat-heptahydrat 10 g, Calciumchlorid-dihydrat 0,1 g, Hefeextrakt 10 g und Biotin 30 μg. Der pH-Wert des Mediums wird mit Natronlauge auf 8,0 eingestellt. (Anmerkung: Das Fermentierungsmedium wird zuvor unter einem Druck von 1 kg/cm² 10 Minuten sterilisiert.) ro

Nach 72stündiger Züchtung wird zu der Fermentationsflüssigkeit 2 g 5-FluoruraciI je Liter gegeben. Die Züchtung wird dann weitere 24 Stunden oder langer fortgesetzt. Dann haben sich 4,6 g 5-Fluoruracilribotid je Liter in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt.

Das so hergestellte 5-Fluoruracilribotid wird aus dem Reaktionsgemisch nach irgendeinem geeigneten und an sich bekannten Verfahren (z. B. durch Adsorption an ein Ionenaustauschharz, von dem es nachher eluiert wird) isoliert. Die Art der Isolierung als solche ist nicht Teil der Erfindung.

Beispiel 2

Es wurde das gleiche Verfahren wie im Beispiel 1 durchgeführt, nur daß an Stelle von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 bzw. ATCC 15750 bzw. ATCC 15751 benutzt wurde. In der folgenden Tabelle ist die jeweilige Menge an 5-Fluoruracilribotid angegeben, die sich nach 96stündiger Züchtung angesammelt hatte.

Brevibacterium ammoniagenes-Stamm	5-Fluoruracilribotid
ATCC 6871 ATCC 15750 ATCC 15751	4,5 4,7 4,9

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Fermentatives Verfahren zur Herstellung von 5 - Fluoruracilribotid, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, 6871, 15750 oder ATCC-15751 unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen, 5-FIuoruracil enthaltenden fermentierbaren Nährmedium züchtet, bis sich wesentliche Mengen 5-Fluoruracil in 5-Fluoruracilribotid umgewandelt haben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Züchten in einer aeroben Eintauchkultur durchführt.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 132 558.

809 557/485 5.68 © Bundesdruckerei Berlin