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Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 5'-Uridylsäure - Ausscheidungsanmeldung
aus K 55 378 IVd/12p -Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung
von 5'-Uridylsäure:
die ein wichtiges Zwischenprodukt bei der Herstellung von Nucleinsäuren und deren
Derivaten ist.
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Hauptziel der Erfindung ist die Entwicklung eines wirtschaftlich
brauchbaran, d.h. billigen, Verfahrens zur Herstellung von 5'-Uridylsäure, das hohe
Ausbeuten liefert.
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung
von 5'-Uridylsäure vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Brevibacterium
anmoniagenes ATOO Nr. 6871, ATOO Nr. 6872, ATCC Nr. 15750 oder ATCC Nr.
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15751 unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium züchtet,
das Orotsäurej ein Salz derselben oder Orotidin, sowie Phosphat als PO4 m einer
Menge von etwa 0,5 bis 2,5 Gew.-% und Magnesiumsulfat in einer Menge von etwa 1
bis 2 Gew.-% enthält, wobei eine fermentative Umwandlung zu 5'-Uridylsäure stattfindet;
daß man diese Umwandlung fortsetzt, bis sich wesentliche Mengen 51-Uridylsäure gebildet
haben; und daß man die gebildete 5'-Uridylsäure gewinnt. Die Orotsäure kann als
solche oder in Form eines ihrer Salze oder als Orotidin dem Kulturmedium in jedem
Stadium der Fermentierung zugesetzt werden, d. h. zu Beginn oder im Verlauf derselben.
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Das Medium selbst mu# - abgesehen von dem Zusatz von Orotsäure, eines
Orotsäuresalzes oder von Orotidin -Phosphat in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa
2,5 Gew.-% als P04 und Magnesiumsulfat in einer Menge von etwa 1 bis etwa 2 Gew.-%
enthalten. Beispiele für Phosphate, die verwendet werden können, sind Kaliumphosphat
und Natriumphosphat. Ansonsten kann die Zusammensetzung des Mediums so sein, wie
sie normalerweise zum Züchten von Brevibacterium ammoniagenes verwendet wird. Es
können also Medien
verwendet werden, die angemessene Mengen an Kohlehydraten
oder anderen Kohlenstoffguellen (Glucose, Stärkehydrolysate, Melassen usw.), Stickstoffquellen
(Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat usw.), anorganischen Verbindungen (wie
z.B. Calciumchlorid) und Stickstoff enthaltenden Naturstoffen (Maisfiquellflüssigkeit,
Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl usw.) in üblichen Mengen enthalten.
Itenn ein Stamm von Brevibacterium ammoniagenes verwendet wird, der bestimmte Nährstoffe
erfordert,-wird der hierfür erforderliche Nährstoff dem Kulturmedium zugesetzt.
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Die Orotsäure bzw. ein Salz derselben oder das Orotidin, werden dem
wie oben zusammengesetzten Medium alle gleichzeitig zu Beginn oder im Verlauf der
Züchtung oder portionsweise während derselben zugesetzt.
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Die Fermentation verläuft in einer zum Züchten von Brevibacterium
ammoniagenes an sich bekannten Weise, d.h. aerob, durch Submers- oder Schüttelkultur
bei 20 bis 400 c und einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0 w bis sich die größtmögliche
Menge an 5'-Uridylsäure in der Fermentierungsflüssigkeit und in den Bakterienzellen,
gewöhnlich innerhalb von etwa 2 bis 8 Tagen, angesammelt hat.
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Nach Beendigung der fermentativen Umwandlung der Orotsäure bzw. ihres
Salzes oder des Orotidins in 5'-Uridylsäure wird die letztere aus der Fermentierungsflüssigkeit
in an sich bekannter Weise, d.h. durch Adsorption an einem Ionenaustauscher, Ausfällen,
Extrahieren usa gewonnen.
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Die Ergebnisse der Versuche über die Wirkung der Konzentration von
P04 und Magnesiumsulfat, die dem Medium zugesetzt werden, und die Menge der erzeugten
5'-Uridylsäure beeinflussen, sind in Tabelle 1 zusammengefa#t. Die Versuche wurden
in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Es wurden aber
die Konzentrationen des zugesetzten PO4 und Magnesiumsulfats variiert und Brevibacterium
ammonfagenes ATCC f5 750 wurde als Einsaat-Stamm verwendet: Tabelle 1
| Im Medium vorliegende Konzentration in Gew.-% |
| in KSHP04 Menge der |
| K2HPO4 KH2PO4 und MgSo4@7 H2O entstandenen |
| KH2PO4 5'-Uridyl- |
| vorliegen- säure |
| des PO4 (mg/ml) |
| 2,0 2,0 2,46 2,0 3,1 |
| 1,5 5 1,5 1,84 2,0 4,2 |
| 1,5 1,5 1,84 1,2 4,0 |
| 1,0 1,0 1,23 2,0 2,5 |
| 1,0 1,0 1,23 1,5 3,3 |
| 1,0 1,0 1,23 1,2 2,9 |
| 0,5 0,5 0,61 0,5 0,8 |
| 0,5 0,5 0,61 1,0 2,0 |
In den folgenden Beispielen stehen Gewichtsteile im gleichen Verhältnis zu Volumenteilen
wie Gramm zu Kubikzentimetern; alle Prozentzahlen sind Gewichtsprozente, wenn nicht
anders augegeben.
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Bespiel 1 Mit Brevibacterium ammoniagenes (ATCC-6872) wird ein Kulturmedium
beimpft, das aus den folgenden Bestandteilen besteht: Glucose 2 % Pepton 1 % Hefe
extrakt 1 % NaCl 0,3 % Biotin 30 µg Wasser bis zu 1 Liter und 24 Stunden bei 300C
bebrütet.
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10 Vol.-% des erhaltenen Inoculums werden zum Beimpfen eines Fermentierungsmediums
der folgenden Zusammensetzung je 1 Liter Wasser verwendet: Glucose 100 g Harnstoff
6 g K2HP04 10 g KH2PO4 10 g MgSO4 . 7 H20 10 g CaCl2 2 H20 0,1 g Hefeextrakt 10
g Biotin 30 µg Der pH-Wert des Mediums wird mit NaOH auf 8,0 eingestellt.
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(Anmerkung: Das Fermentierungsmedium wurde zuvor unter 1 kg/cm2 Druck
10 Minuten sterilisiert.
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Eine aerobe Submerszüchtung wird bei 30°C durchgeführt.
Dies
kann gegebenenfalls in 250 ml fassenden Kolben erfolgen, die je 20 ml des wie oben
beschrieben beimpftem Fermentierungsmediums enthalten. Die-Züchtung kann auch im
größeren Maßstabe erfolgen, wobei z.B. 1 Liter oder mehr des-beimpften Fermentierungsmediums
der aeroben Submerskultur in einem entsprechend großen Behälter unterworfen wird,
der mit Rühr- und Heizvorrichtungen usw. versehen ist.
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Nach 48 stündiger Züchtung wird der Fermentierungsflüssigkeit so
viel Orotsäure zugesetzt, daß diese in einer Konzentration von 2 mg je ml (2 (g/Liter)
vorliegt. Es wird unter den gleichen Bedingungen noch weitere 24 Stunden gezüchtet.
Danach haben sich 2,5 mg 5'-Uridylsäure je ml (2,4 g/Liter-) in der Fermentierungsflüssigkeit
angesammelt.
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In diesem-Beispiel beträgt die Konzentration an K2HPO4 , KH2P04 und
Magnesiumsulfat im Medium jeweils 1 Gew.-, und die Konzentration des Phosphats als
PO4 1,23 Gew.-%.
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Die so erzeugte 5'-Uridylsäure wird aus dem Reaktionsgemisch in geeigneter
und an sich bekannter Weise isoliert, wobei die jeweilige Isolierung nicht Gegenstand
der Erfindung ist. 5'-Uridylsäure ist bekannt und wurde bereits aus Reaktionsgemischen
isoliert, die diese enthalten.
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Praktisch die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man die Orotsäure
durch eine äquivalente Menge eines ihrer Salze, z.B. Ammoniumorotat usw. ersetzt.
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Beispiel 2 Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wird durchgeführt,
nur wird Orotidin an Stelle von Orotsäure dem Kulturmedium zugesetzt. Das Orotidin
wird unmittelbar zu Beginn der Züchtung in solcher Menge zugefügt, daß es in dem
Fermentierungsmedium in einer Konzentration von 4 mg je ml (4 g/Liter) vorliegt.
Nach 72 stündiger Züchtung haben sich 2,4 mg je ml (2,4 g/Liter) 5'-Uridylsäure
in der Fermentierungsflüssigkeit angesammelt.
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Beispiel 3 Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wird durchgeführt,
und zwar mit der Abwandlung, daß als Mikroorganismen Brevibacterium ammoniagenes
ATCC-6871, 15750 und 15751 an Stelle von Brevibacterium ammoniagenes ATCO-6872 verwendet
werden. Die Menge der nach 72 stündiger Züchtung angesammelten 5'-Uridylsäure ist
in Tabelk2 angegeben: Tabelle 2 verwendete angereicherte Mikroorganismen 5'-Uridylsäure
(mg/ml) Brevibacterium ammoniagenes ATCO-6871 2,6 " ATCC-15750 2,9 "ATCC-15751 2,3
Beispiel
4 Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wird durchgeführt mit der Abwandlung,
daß anstelle des in Beispiel 1 verwendeten das folgende Fermentationsmedium benutzt
wird: Glucose 100 g/l Harnstoff 6 Na2RPO4 14 NaH2PO4 6 " MgSO4 7 H20 20 1l CaCl2
2 H20 Hefeextrakt 10 " Biotin 30 µ Die Menge der nach 72 ständiger Züchtung angesammelten
5'-Uridylsäure beträgt 2,5 mg/ml der Fermentationsflüssigkeit.
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- Patentanspruch -