DE1517857A1 - Verfahren zur Herstellung von Inosin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Inosin

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DE1517857A1 DE19661517857 DE1517857A DE1517857A1 DE 1517857 A1 DE1517857 A1 DE 1517857A1 DE 19661517857 DE19661517857 DE 19661517857 DE 1517857 A DE1517857 A DE 1517857A DE 1517857 A1 DE1517857 A1 DE 1517857A1
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inosine
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phosphate
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Tsunemoto Asai
Michio Katsumata
Ikuo Nogami
Takashi Suzuki
Masahiko Yoneda
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Chemical Industries Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
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    • C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
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Description

Die Erfindung besieht «ich auf ein Verfahren zur Herstellung τοη Inoein, das dadurch gekennzeichnet 1st, daß man mit einem Mikroorganismus, der zu Baoillus pumlllus Ctottheil gehört, ein Kulturmedium beimpft, das ein wasserunlösliches Oalciumsals der Phosphorsäure, nämlich sekundäres Oaloiumphosphat, tertiäres Calciumphosphat oder deren Gemische enthält, das Kulturmedium bebrütet, bis Inosin darin angereichert ist, und das Inosin rom Kulturmedium abtrennt·
Xs wurde gefunden, daß eine bemerkenswert grofle Inoein- % menge im Kulturmedium angereichert wird, wenn zu Baoillus pumllus Sottheil gehörende Stämme, die praktisch kein Inosin oder bestenfalls nur eine begrenzte InosinMenge in einem üblichen Kulturmedium bilden, das als Ihosphatajaelle gewöhnliche wasserlösliche Phosphatsalze, wie Kaliumdihydrogenphosphat und Pikaliumhydrogenphosphat, enthält, in einem Medium gezüchtet werden, das wasserunlösliche Oaloiumsalze der Phosphorsäure, nämlich sekundäres Oaloiumphosphat, tertiäres Oalolumphosphat oder deren Gemische, enthält, die bisher nie als Phosphatquelle für die Züchtung τοη Mikroorganismen Terwendet worden sind·
909885/0412 BAD original
Die Erfindung ermöglicht die Herstellung von Inosin im technischen Maßstab in hoher Ausbeute· Als Mikroorganismen eignen sich für die Zwecke der Erfindung Mutanten τοη Bacillus pumilus Gottheil, die wenigstens Adenin zum Wachstum benötigen, z.B. Mutanten, die nur Adenin «um Wachstum benötigen, Mutanten, die gleichzeitig Adenin und Aminosäuren benötigen, Mutanten, die gleichzeitig Adenin und Vitamin benötigen, und Mutanten, die gleichzeitig Adenin, Aminosäure und Vitamine benötigen· Diese Stämme können von Wildstämmen von Bacillus pumllus Gottheil nach üblichen Mutationsmethoden erhalten werden, beispielsweise durch Behandlung mit Ultraviolettlicht oder Röntgenstrahlen oder mit Stickstofflost, salpetriger Säure usw. Natürlich können im Rahmen der Erfindung auch spontan induzierte Stämme, die die vorstehend genannten Eigenschaften haben, von Mikroorganismen der Gattung Bacillus pumilus Gottheil verwendet werden·
Geeignete Stämme von Bacillus pumilus sind beispielsweise Bacillus pumilus Gottheil Hr. 118 (AICO 19547), Ir.138 (AXCC 19546) und Nr. 782 (AICC 19548)· Die Zahl hinter der Abkürzung "AICC* bezeichnet die Zugangsnummer beim American Type OuItür· Collection (AICC), Rookville,Maryland, U.S.A.
Zur großtechnischen Herstellung von Adenin ist im allgemeinen die Verwendung eine« flüssigen Kulturmediums zweokmäfiig, jedooh können auch andere Kulturmedien verwendet werden· Die Züchtung.bein Verfahren gemäß der Erfindung kann entweder stationär oder als Submerskultur unter Belüftung und/oder Bewegung durchgeführt werden, wobei das Kulturmedium eines der genannten wasserunlöslichen Caloiuasalze der Phosphorsäure oder deren Gemische enthalten mufl. Das wasserunlösliche Calciumsalζ der Phosphorsäure kann dem Medium als alleinige Phosphatisuelle zugesetzt oder zusammen mit den gewöhnlichen wasserlöslichen Phoephatquellen verwendet werden· Die optimale Konzentration des sekundären
909885/0A12 bad omc.NAL
Calclunphoephats und/oder tertiären Caloiumphosphats Im Kulturmedium vom Standpunkt der Auebeute dee Im Medium anzureichernden Inoslne beträgt etwa 0,2-5,OJi (Gewicht/ Volumen), vorzugsweise etwa 0,5-3»O#. Zweckmäßig enthält das Medium Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und verwertbarem Stickstoff* Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff eignen sich Stärke, Dextrin, Saccharose, Lactose, Maltose, Glucose, Glycerin usw. Verschiedene organische Stoffe, s.B. organische Ammoniumsalze, organische Nitrate, Harnstoff, Maiequellwasser, Hefeextrakt usw., eignen sich nicht nur als Kohlenstoffquelle, sondern auch als Quellen für verwertbaren Stickstoff mit der gleichen Wirkung wie anorganische Stickstoffquellen, z.B. anorganisohe Ammoniumsalze, wie Ainmoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat oder verschiedene Äxten von Nitraten, wie Natriumnitrat, Kaliumnitrat uew. Ferner kann eine geringe Menge anorganischer Salze, ζ·Β. Natriumchlorid, Metallsalze, z.B. von Zink, Eisen und Mangan, dem Medium zugesetzt werden. Darüber hinaus kann das Medium andere Stoffe enthalten, die für das Wachstum des verwendeten Staimses notwendig sind, z.B. eine Adeninquelle, eine Quelle für Aminosäure und/oder Vitamine.
Die Fermentationsbedingungen, z.B. der Pg-Wert des Mediums und die Bebrütungsdauer, müssen so eingestellt werden, daß Inosin in maximaler Menge angereichert wird. Im allgemeinen wird der Anfangs-pg-Wert des Kulturmediums auf 5,0 bis 9,0 und die Fermentationstemperatur auf 20-500C, vorzugsweise auf 28-370C eingestellt. Unter den genannten Kulturbedingungen wird Inosin im Laufe der Zeit im Kulturmedium gebildet und angereichert.
Die Fermentation wird fortgesetzt, bis die maximale Inosinmenge im Kulturmedium gebildet 1st· Sie zur maximalen Anreicherung von Inosin erforderliehe Zeit ist verschieden Ia Abhängigkeit von den verschiedenen Faktoren, im allgemeinen erreicht jedoch die Inosinmenge im Kulturmedium ihr
90 "S 85/(H 12 BADORlGiNAL
Maximum in 0,5 - 10 Tagen vom Beginn der Fermentation.
Das im Kulturmedium angereicherte Inosin wird entweder in der freien Form oder in Form verschiedener Salze, z.B. des Dinatriumsalzes und des Dikaliumsalzes, nach üblichen und einfachen Methoden, beispielsweise durch Behandlung mit Aktivkohle oder einem Anionenaustauschharz, abgetrennt.
Wie bereits erwähnt, wird mit Stämmen von Bacillus pumilus Gottheil, die in üblichen Kulturmedien nur eine geringe Inosinmenge oder kein Inosin zu bilden vermögen, eine hohe Inosinausbeute erhalten, wenn diese Stämme in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das die genannten waeserunlöslichen Calciumsalze der Phosphorsäure enthält.
Wenn beispielsweise Bacillus pumilus Oottheil Nr. I38 (ATCC Nr. 195^6) in einem Kulturmedium, das unterschiedliche-Mengen von sekundärem Calciumphosphat, tertiärem Calciumphosphat, Kaliumdihydrogenphoephat und/oder DikaliumtiydroV genphosphat enthält (6,0# Glucose, 1,0$ Trockenhefe, ·*" .'. 1,25# (NH^)2SO2, 0,01Ji MgSO4.7 HgO, 2,0# CaCO5), bei JO0C 96 Stunden unter Schütteln bebrütet wird, werden die in der folgenden Tabelle genannten Inosinmengen in der Kulturbrühe angereichert.
c~;'?:NAL [?■:;;■ lcted
909885/0Λ12
Konzentration dee Phosphats
!"engen des angereicherten Inosins (γ/ml)
5* oi H2O 2 H2O 2 H2O 2 H2O CVJ 0 Ο,55δ
K2HPO4 		0,556
KH2PO4 		0,4?S KpHPOΑ
0,6^5 KH2PO4 		2,0?ζ
KH2PO4 		3,Ο?6
KH2PO4 		!
Ul		 cn
oi CaHPO4.2 Spur 365 529 1263 1024 989 1 17857
ο ο,
to		 0* Ca. (PO4), 10752 9899 7689 6997 5291 2130
OO -
OO '»		 0* CaHPO4.2 12288 11264 10193 8704 6315 5120
σι
^ 1,		 0* Ca3(PO4),
ο* CaHP04·2 12800 13060 12702 10060 9727 6827
~3, Oi Ca3(PO4) 10411 10700 11435 9558 8704 5973
3, oi CaHPO4.2 11094 10582 10923 8800 6827 2480
4, Ca3(PO4) 1291 1300 1109 1024 1092 1126
4ι 2048 2130 2800 1398 1297 1331
Beim Verfahren gemäß der Erfindung läßt sich die Abtrtliming des festen Anteils, z.B. der Zellkörper, ron der erhaltenen Kulturbrühe leichter durchführen als bei einem üblichen Kulturmedium, das gewöhnlicheβ wasserlösliches Ihosphateala enthält·
In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozent angaben Auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben·
Beispiel 1
Bacillus pumilus Gottheil Hr, 118 (ATCC Hr. 19547) wird auf 10 ml eines Kulturmediums geimpft, das 6,O* Gluoose, 1,0* Trockenhefe, 1,25* (HH4J2SO4, 0,01* Mg3O4.7 H2O, 2,0* CaCO3, 20 Y/ml Adenin, 10 Y/ml Histidin, 0,25* sekundäres Calciumphoephat und 0,75* tertiäres Calciumphoephat enthält· Das Kulturmedium wird unter Schütteln 96 Stunden bei 370C fermentiert, wobei 9899 Ύ/fel Inoein in der Kulturbrühe angereichert werden.
Bei einem Vergleicheyersueh unter den gleichen Bedingungen mit der Ausnahme, daß ein Kulturmedium verwendet wird, dae 0,5* Dikaliumhydrogenphosphat und 0,5* Kaliumdihydrogenphosphat an Stelle von sekundärem Calciumphoephat und tertiärem Calciumphoephat enthält, werden in der Kulturbrühe nur 200 Y/ml Inosin angereichert.
Beispiel 2
10 1 Impfkultur von Bacillus pumilus Gottheil Hr. 118 (AICC Hr.19547) werden auf 100 1 eines Kulturmediums geimpft, das 10,0* Gluoose, 1,0* Trockenhefe, I9Q* (HH4J2SO4, 0,05* MgSO2.7 H2O, 2,0* OaCO3, 0,25* sekundär·· Galolumphosphat, 0,75* tertiäres Calciumphoepliat und 20 Y/ml Histidin enthält· He Fermentation wird 64 8tunden bei 320O unter Belüftung und Bewegung Torgenommen. Hierbei werden 14300 Y/ml Inoein angereichert. Ton der Kulturbrühe -wtrden in üblicher Weise 1,2 kg Inoein abgetrennt·
909885/0412
Bei einem Vergleichsversuoh unter den gleiohen Bedingungen, wobei jedoch ein Kulturmedium verwendet wird, das 0,5% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,5% Kaliumdihydrogenphoephat an Stelle τοη sekundärem Caloiumphosphat und tertiärem Calciumphosphat enthält, werden nur etwa 110 Y/ml Inosin in der Kulturbrühe angereichert.
Beispiel 3
10 1 Impfkultur von Bacillue pumilue öottheil Nr. 138 (AlOC Hr. 19546) werden auf 100 1 eines Kulturmediums
geimpft, das 10,0% Glucose, 1,0% Trockenhefe, 1,0% ™
(HH+)2SO^, 0,05% HgSO,«7 H2O, 2,0% CaCO-,, 0,3% sekundäres Calciumphosphat und 0,3% tertiäres Oalciumphoephat enthält« Haoh einer Bebrütungsdauer τοη 64 Stunden unter Belüftung und Bewegung bei 320C haben »ich 17800 Y/ml Biosin in der Kulturbrühe angereichert. Aus der nährlösung werden 1,48 kg Inosin in üblicher Weise abgetrennt· Bei einem Yergleichsversuoh unter den gleichen Bedingungen, wobei jedoch ein Kulturmedium verwendet wird, das 0,3% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,3% Kaliumdihydrogenphoephat an Stelle τοη sekundärem und tertiärem Calciumphosphat enthält, werden nur etwa 10 Y/sl Inosin in der Kulturbrühe angereichert.
Beispiel 4
10 1 Impfkultur τοη Bacillus pumilus Gottheil Ir· 782 (AICC Ix. 19548) werden auf 100 1 eines Kulturmediums geimpft, das die gleichen Bestandteile wie das gemäß Beispiel 3 verwendete Kulturmedium, jedoch an Stelle des Histidine 10 T/ml Rienylalanin enthält. Haoh einer Fermentationsdauer τοη 76 Stunden bei 340O unter Belüftung und Bewegung haben sich 17600 Y/ml Inosin angereichert. Tom Kulturmedium werden 1,46 kg Inosin in üblicher Welse abgetrennt.
Bei einem Vergleicheversuch mit einem Medium, das 0,3% Bikaliumhydrogenphosphat und 0,3% Kaliumdihvdrogenphosphat
9 0-PP9S/(H1 2
1517357
an Stelle ron sekundärem und tertiärem Oaloiumphoephat enthält, werden nur etwa 210 T/ml Inoeln in der KuIturlöeung angereichert.
909385/0412

Claims (3)

1) '/erfahren zur Herstellung von Iiiosin auf nik;· 'biologisehen; Weg-i, dadurch gekermzeichnet, daß rr.an einen 3tarrr. Bazillus purilus Gctiheil in eir. Kulturmedium eii;t;*ä/t, -las wasserunlösliche Calciur.-.salze der Phosphorsäure, nän.lich sekundäres Calciuniphosphat und/oder tertians Calciur.phosph-'it enthält, das so beimpfte Kulturmedium bebrütet, bic sich Injsin darin angereichert hat, und dieses schlie31ich daraus gewinnt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekernteicl.net, daß ein Kulturmedium eingesetzt wird, daß etv/a" 0,2 % bin otwa 3*0 J^ (Gewicht/Volumen) der wasserunlöslichen Phoiphorsaure-Caloiumsalze neben einer Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, verwertbaren Stickstoff und andere liährraittoll-estandteile enthält, die für das Wachstum des Mikroorganismus orforderlich sind, und daß man das Verfahren unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von et*a SO bis etwa 40°C und bei Pjj-Werten von etwa6,0 bis 9#0 durchführt,
3) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nit einen der folgenden Mikroorganismen-3tKnme arbeitet ι I Bacillus pumilus Gottheil Nr. 118 (ATCC Nr. 19547), Bacillus pumilus Gottheil Nr. 1^8 (ATCC Nr. 19546) bzw. Bacillus pumilus Gottheil Nr. 782 (ATCC Nr. 19548).
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