DE1695318A1

DE1695318A1 - Verfahren zur Herstellung eines Ribonucleotids durch Fermentation

Info

Publication number: DE1695318A1
Application number: DE19641695318
Authority: DE
Inventors: Kioshi Nakayama; Zenroku Sato; Haruo Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1963-11-27
Filing date: 1964-11-24
Publication date: 1972-04-20
Also published as: DE1695318B2; US3308036A; DE1695318C3

Description

Verfahren zur Herstellung eines Ribonucleotids durch Fermentation Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Ribonucleotids' d.h. 5'-Ribosylphosphats ( (Monophosphats) von Purinbasenverbindungen. Bei den Purinbasenverbindungen, von denen sich das erfindungsgemäss hergestellte 5'-Ribosylphosphat ableitet, handelt es sich um eine Verbindung der allgemeinen Formel: worin worin R1 Wasserstoff und R2 - SH bedeuten, Dem nach dem erfindungsgemässen ?erfahren hergestellten 5'-Ribosylphosphaten der Purinbasenverbindung kommt die allgemeine Pormel zu, worin @ bedeutet und R1 und R2 die gleiche Bedeutung wie in Pormel (I) haben.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren lässt sich das 5'-Ribonucieotid der Purinbasenverbindung in wirtschaftlicher Weise und in industriellem Ma#stabe herstellen.
Purinbasen Purinbasen der obigen Formel, (I) wie z.B. das 6-Mercaptopurin, haben in letzter Zeit bei Untersuchungen im Hinblick auf die Behandlung von Leukämie Bedeutung gewonnen. Die Ribosylphosphate dieser Purinbasen sind kürzlich ebenfalls Gegenstand ähnlicher Untersuchungen geworden.
Im Rahmen vorliegender Erfindung wurden die verschiedensten Untersuchungen über die Möglichkeit durchgeführt, Nucleotide mit Hilfe von Mikroorganismen herzustellen. Als Ergebnis wurde nun gefunden, das beim Züchten eines Mikroorganismus der Art Brevibacterium ammoniagenes in einem Medium, das zu irgendeiner Zeit während des Züchtens eine Purine basenverbindung der Formel (I) oder ein Derivat einer solchen Verbindung, wie z.B. ihr PLibosidg enthält, bemerkenswerte Nennen eines 5'-Ribosylphosphats der Purinbasenverbindung gebildet wird und sich in dem Medium ansammelt.
Dae erfinduiigsgemäse Verfahren beruht auf der Auffindung dieser bisher unbeannten Gatsache.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass (1) eine Purinbasenverbindung der obigen Formel (I) oder ein Ribosid einer solchen Ver@indung in dem verwendeten Permentationsmedium medium enthalten ist und dass (2) ein Stamm der Gattung Brevibacterium ammoniagenes verwendet wird.
Als Nährmedium kann erfindungsgemäss jedes Medium verwendet werden, das eine Kohlenstoffquelle, wie z.B. Kohlenhydrate und dgl. ( wie z. B Ghcose, Stärkehydrelyseprodukte und Melassen), eine Stickstoffquelle (wie z.B. Harnstoff, Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat), anorganische Substanzen (wie z.B. Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid) und stickstoffhaltige Naturprodukte (wie z.B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Pepton und Fischmehl) in geeignetem Mengenverhältnis enthält. Derartige Nährmedien sind für die Bakterienzüchtung bekannt. Wenn ein Stamm von Brevibacterium ammoniagenes verwendet wird, der von einem bestimmten Nährstoff abhängig ist, so Inliss natürlich dieser Nährstoff in dam Medium enthalten sein.
Erfindungsgemäss kann die Purinbasenverbindung bzw. ihr Ribosid vom Anfang der Fermenation an in dem Medium enthalten sein oder dem Fermenta@ tionsmedium während des Verlaufs der Fermentation zugesetzt werden .Wenn sie während des Verlaufs der Fermentation zugesetzt wird, kann die Zugabe auf einmal oder in mehreren Anteilen erfolgen. Ausserdem kann sich die als Ausgangsmaterial dienende Purinbasen-Verbindung verbindung in dem Medium selbst während der Fermentation infolge der Eigenschaften des verwendeten Stammes von Brevibacteriun ammoniagenes gebildet haben, Weiterhin kann es sich bei der. als Ausgangsmaterial dienenden Purinbasenverbindung - w-ie durch die obige Definition des Begriffes @Purinbasenverbindunga angedeutet - um eine solche handeln, die in situ in dem Medium aus einem Derivat der Purinbase - wie einem Salz, wie z.B. einem Sulfat -, das man dem Medium zu Beginn der Permentation oder während ihres Verlaufs ugesetzt hat, gebildet wird.
Die erfindungsgemäss verwendete und dem Medium zugesetzte Menge an Purinbassenverbindung kann innerhalb eines breiten Bereichs variieren. Sie ist etwas von dem speziell verwendeten Bakterienstamm abhängig. Im allgemeinen wird sie innerhalb des Bereichs von etwa 0,1 bis etwa 10 g je Liter Medium liegen. Vorzugsweise beträgt die verwendete Menge 1 bis 5 g je Liter Fermentationsmedium. Bei Verwendung einer Verbindung, die die Purinbasenverbindung unter den Bedingungen der Fermentation liefert, wird die Menge dieser Yerbindung so gewählt' dass in dem Medium während der Fermentation die geeignete Menge an Purinbasenverbindung enthalten ist.
Die Die Permentation wird unter aeroben Bedingungen, wie z.B. in einer Schütelkultur oder einer Submerskultur unter Belüften und Rühren, bei einer Temperatur von 20 bis 400 a und bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0 durchgeführt. Die Züchtungsdauer beträgt im allgemeinen 2 bis 8 Tage. Bei der Züchtung bilden sich erhebliche Mengen des 5t-Ribosylphosphats der Purinbasenverbindung und sammeln sich in dem Medium undin den Zellen an.
Das 5'-Ribosylphosphat der Purinbasenverbindung kann nach Beendigung der Züchtung nach an sich bekannten Verfahren, wie z.B. durch Behandlung mit Hilfe von Ionenaustauscherharzen, durch AdsorptionS durch Fällung, durch Extraktion und dgl., aus dem Medium isoliert werden Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, sind jedoch nicht als Begrenzung des Erfindungsbereiches aufzufassen. Prozentangaben beziehen sich @ wenn nicht anders angegeben - auf ias Gewicht.
Beispiel 1 Es wird eine Impfkultur hergestellt, indem Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 in einem Medium, Medium, das 2 % Glucose, 1 % Pepton, 1 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCl und 30. µg/Liter Biotin enthält, 24 Stunden bei 30t C angezüchtet wird. Das Permentationsmedium wird mit 10 Vol.-% dieser Impfkultur angeimpft, Beide Medium wurden verwendet, nachdem 20-ccm-Anteile in 250-ccm-Erlenmeyerkolben gebracht und sodann sterilisiert worden waren. Die Züchtung wird bei 300 a in einer Schüttelkultur durchgeführt. Das Permentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung: Glucose 100 g Harnstoff 6 g KH2PO4 10 g K2HPO4 10 g MgSO4.7H2O 10 g CaCl2.2H2O 0,1 g Hefeextrakt 10 g Biotin 30 µg Die obigen Bestandteile werden in Wasser unter Auffüllen auf 1 Liter gelöst. Sodann werden die obengenannten Anteile der hergestellten Lösung nach Einstellen des pH-Wertes auf 8,0 = was mit Hilfe von NaOH erfolgt - in die kolben gegeben und in einem Autoklaven unter einem Druck von 1 kg/cm2 10 Minuten sterilisiert.
Wenn Wenn nach 72-stündiger Zuchtung dem Fermentationsmedium 6-Mercaptopurinsulfat in einer Menge von 2mg/ml Fermentationsmeidum zugesetzt, und weitere 24 Stunden gezüchtet wird, haben sich 3,3 mg/ ml 6-Mercaptopurin-ribosyl-5'-monophosphat gebildet und in dem Permentationsmedium angesammelt.
Das gebildete 5'-Ribosylphosphat des 6-Mercaptopurins wird durch Behandlung mit Hilfe von Ionenaustauscherharzen in der folgenden Weise isoliert : Das durch Entfernen der Zellen aus der Züchtungsflüssigkeit erhaltene Filtrat ( 1,2 Liter ) wird mit Aktivkohle behandelt, und das an der Aktivkohle adsorbierte 5'-Ribosylphosphat des 6-Mercaptopurins wird mit 50 %igem wässrigem Äthanol, das 3 , Ammoniak enthält, eluiert. Das im Eluat enthaltene Ammoniak wird durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Die erhaltene Lösung wird durch eine Säule gegeben, die mit tDowex 1 x 2" (Cl-Form), einem stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscherharz, beschickt ist.
Die Harzsäule, die das 51-Ribosylphosphat des 6-Mercaptopurins adsorbiert enthält, wird mit Wasser gewaschen und sodann gradienten mässig in der angegebenen Reihenfolge mit 0,01 n HCl, 0,05 n HC1, 0,1 n HCl und 0,5 n HCl eluiert. Die Eluatfraktionen, die das 6-Mercaptopurin-ribosyl-5'-phosphat enthalten, werden werden eingeengt und nach der Zugabe von äthanol gekühlt. Das abgeschiedens 5'-Ribosylphosphat des 6-Mercaptopurins wird durch Abzentrifugieren gewonnen und getrocknet. Die Ausbeute an 6-Mercaptopurin-5'-monophosphat beträgt 1,6 g Beispiel 2 Es wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet, mit der Abwandlung dass die in Tabelle 1 aufgefübrten Stämme verwendet werden, wobei die in der Tabelle angegebenen Mengen an 6-Mercaptopurin-ribosyl-5'-phosphat gebildet und im Zuchtungsmedium angereichert werden.
Tabelle 1 Mikroorganismen 6-Mercaptopurin-ribosyl 5'-phosphat (mg/ml) Brevibacterium ammoniag@nes ATCC Er 6871 Q6 Brevibacterium ammoniagenes KY 3464 (ATCC Nr. 15750) 2,1 Brevibacterium ammoniagenes KY 3465 (ATCC Nr. 15751) 3,4 Patentansrüche

Claims

Patentanspruche: 1. Verfahren zur Herstellung eines 5'-Ribosylphosphats von Purinbasenverbindungen der allgemeinen Formel worin R1 Wasserstoff und R2 -SH bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dasc; man einen Stamm von Brevibacterium ammoniagenes in einem Permentationsmedium ztichtet, das ausser den üblichen Bestandteilen eine Purinbasenverbindung der Formel (I) oder ein Ribosid einer solchen Verbindung enthält.
2. Verfahren 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Purinbasenverbindung während der Züchtung der Bakterien dem Fermentationsmedium zugegeben wird.
3. Verfahren zur Herstellung eines 5'-Ribosylphosphats von Purinbasenverbindungen der allgemeinen Formel worin R1 Wasserstoff und R2 -SH bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Bakterienstamm von Brevibacterium ammoniagenes in einem Fermetationsmedium, das ausser den üblichen Bestandteilen eine Purinbasenverbindung der Formel (I) in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 g je Liter Medium enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 400 C und bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9 züchtet
4. Verfahren nach Anspruch 39 dadurch gekennzeichnet, kennzeichnet, dass als Purinbasenverbindung 6-Mercaptopurinsulfat eingesetzt wird0
5. Verfahren zur Herstellung eines 5'-Ribosylphosphats von Purinbasenverbindungen der allgemeinen Formel dadurch gekennzeichnet, dass man Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 in einem Kulturmedium züchtet, das ausser den üblichen Bestandteilen eine Purinbasenverbindung der Formel (I) enthält0
6. Verfahren zur Herstellung eines 5'-Ribosylphosphats des 6-Mercaptopurins, dadurch gekennzeichnet, dass man Brevibacterium ammoniagenes ATCC lDrO 6872 in einem Kulturmedium züchtet, das ausser den üblichen Bestandteilen 6-Mercaptopurin enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, kennzeichnet, dass als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 verwendet wird.
8u Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6871 verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes KY 3464 (ATCC Nr. 15 750) verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes KY3465 (ATCC Nr. 15 751) verwendet wird.