DE1295505B

DE1295505B - Verfahren zur biochemischen Herstellung von D-Ribose-5-phosphat

Info

Publication number: DE1295505B
Application number: DEK60434A
Authority: DE
Inventors: Mizuhara Kunizo; Kinoshita Shukuo; Suzuki Takeo
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1963-03-08
Filing date: 1964-07-14
Publication date: 1969-05-22
Also published as: BR6461184D0; FR1411111A; DE1261468B; ES302471A1; ES307168A1; US3303101A; CH476025A; BE651090A; NL6408606A; GB1067840A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel- angeimpft und sodann zur weiteren Züchtung bei lung von D-Ribose-5-phosphat durch Züchtung von 30° C geschüttelt. Mikroorganismen in geeigneten Medien. Glucose 10 %

Bei den bisher in Gebrauch befindlichen Verfahren zur Herstellung von D-Ribose-5-phosphat 5 Harnstoff 1,0%

(z.B. aus Inosinsäure) wird eine Zersetzung von KH₂PO₄ 1,0%

Ribonucleinsäurehaltigen Substanzen durchgeführt. ^. „_pn ι no/

Diese Verfahren sind daher ziemlich kostspielig. K₂WfU₄ I₅U /o

Über die Herstellung von D-Ribose-5-phosphat MgSO₄ · 7H₂O 1,0%

durch direkte Fermentation mit Mikroorganismen io Biotin 30 u/1

ist bisher noch nichts berichtet worden.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren CaCl₂ · 2H₂O 0,01 %

zur biochemischen Herstellung von D-Ribose-5-phos- (_Im Anschluß an die Sterilisation wird der pH-Wert

phat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Mi- _auf g q eingestellt.) krococcus glutamicus ATCC Nr. 15455 oder Brevi- 15

bacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 in einem Nachdem auf diese Weise in dieser Fermentationsüblichen Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen und flüssigkeit 100 Stunden gezüchtet worden ist, haben Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, das einen sich in der Flüssigkeit 13,5 mg/ccm D-Ribose-5-phos-Gehalt von 0,2 bis 2,0 Gew./Volumprozent Phospha- _phat angesammelt. In den Zellen selbst hat sich die tionen, 0,01 bis 0,2 Gew./Volumprozent Magne- 20 Verbindung ebenfalls angesammelt, siumionen und 0,1 bis 1,5 Gew./Volumprozent Aus der Fermentationsflüssigkeit werden die

Kaliumionen aufweist, züchtet. _Zeu_en entfernt, wonach zu 11 des Filtrats Calcium-

Das erfindungsgemäß verwendete Nährmedium hydroxyd gegeben und das abgeschiedene anorgaenthält geeignete Mengen an Kohlenhydraten und o^e phosphat durch Zentrifugieren entfernt wird, anderen Kohlenstoffquellen, wie z. B. Glucose, ₂₅ £>i_e überstehende Flüssigkeit wird durch eine Säule Stärke, Stärkehydrolysate und Melassen, Stickstoff- geschickt, die mit »Dia-ion SA Nr. 21A« (stark quellen, wie z.B. Harnstoff, Ammoniumchlorid und _saUres Polystyrolsulfonsäure-Kationenaustauscher-Ammoniumnitrat, anorganischen Verbindungen, wie _harZ) Mitsubishi Chemicals Co., Ltd., Japan) in der z. B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat und CaI- ci-Form gefüllt ist, um das D-Ribose-5-phosphat zu ciumchlond, und stickstoffhaltigen Naturprodukten, _3o adsorbieren. Die Säule wird sodann mit lnormaler wie z.B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleisch- wäßriger NaOH eluiert und die D-Ribose-5-phosextrakt, Pepton, Proteinhydrolysate und Fischmehl. phat-Fraktion durch eine mit »Dia-ion SK Nr. 1« Zur Bildung von D-Ribose-5-Phosphat müssen in den (_stark basisches Anionenaustauscherharz auf der Medien Phosphationen in einer Menge von 0,2 bis _{Basis von} p_oiy_Styroi _mi_t quaternären Ammonium-2,0 Gew./Volumprozent, Magnesiumionen in einer _{35 grup}pen, Mitsubishi Chemicals Co., Ltd., Japan) in Menge von 0,01 bis 0,2 Gew./Volumprozent und _{der H}-Form gefüllte Säule gegeben, auf pH = 6,5 Kaliumionen in einer Menge von 0,1 bis 1,5 Gew./ eingestellt und sodann unter vermindertem Druck Volumprozent vorhanden sein. eingeengt. Die eingeengte Lösung wird mit Hilfe

Erfindungsgemäß wird die Fermentation aerob, einer kleinen Menge Aktivkohlepulver entfärbt und wie z. B. mit einer Schüttel- oder Belüftungs-Fennen- _{40 m}j_t wäßriger Natronlauge auf pH = 8,0 eingestellt, tationsvorrichtung, bei einer Züchtungstemperatur Sodann wird eine berechnete Menge Bariumacetat von 20 bis 40° C durchgeführt. Nach einer Züch- _un(j sodann Alkohol zugegeben, und das entstehende tungsdauer von 2 bis 8 Tagen hat sich eine bemer- Bariumsalz des D-Ribose-5-phosphats wird absetzen kenswert große Menge an D-Ribose-5-phosphat in gelassen. Nach dem Trocknen des Niederschlags der Kulturflüssigkeit und in den Zellen gebildet. ₄₅ ii_egen 18,4 g des Bariumsalzes von D-Ribose-5-phos-

Nach Beendigung der Fermentation kann das phat (BaC₅H₉O₈P · 5 V2 H₂O) in Form einer weißen D-Ribose-5-phosphat durch Behandlung mit Ionen- Festsubstanz vor. austauscherharzen, Adsorption und Extraktion isoliert werden, wie es in den folgenden Beispielen beschrieben wird. 50 Beispiel 2

In den folgenden Beispielen beziehen sich — wenn

nicht anders angegeben — sämtliche Prozentzahlen Es werden ein wäßriges Impfkulturmedium, das

auf das Gewicht. 2% Glucose, 1«/» Pepton, 1% Hefeextrakt und

0,25% NaCl enthält, und ein wäßriges Fermenta-

Beispiel 1 55 tionsmedium verwendet, das 10% Glucose, 0,3%

Harnstoff, 0,2% KH₂PO₄, 0,1% K₂HPO₄ und 0,01 %

Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC CaCl₂ · 2H₂O enthält. Mikrococcus glutamicus Nr. 6872 verwendet. Zur Herstellung der Impfkultur ATCC Nr. 15455 wird in genau der gleichen Weise werden 30 ecm eines wäßrigen Nährmediums, das wie im Beispiel 1 gezüchtet, jedoch mit der Abände-2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 60 rung, daß 48 Stunden nach Beginn der Fermentation 0,25% Natriumchlorid enthält, in einen Erlenmeyer- 0,8% KH₂PO₄ und 0,3% K₂HPO₄ zugegeben wer-Kolben gegossen und sterilisiert, und der obige den. Nach 120 Stunden haben sich 8,9 mg D-Ribose-Stamm wird unter Schütteln in diesem Medium bei 5-phosphat je Kubikzentimeter der Fermentations-30° C 24 Stunden gezüchtet. Sodann wird ein Fer- flüssigkeit angesammelt. Nach Entfernung der mentationsmedium mit der im folgenden angegebe- 65 Zellen aus der Fermentationsflüssigkeit wird 11 des nen Zusammensetzung hergestellt, in Anteilen von Filtrats der gleichen Behandlung wie im Beispiel 1 20 ecm in 250-ccm-Kolben gefüllt, sterilisiert, mit unterworfen, wobei 11,2 g kristallines Bariumsalz der wie oben beschrieben hergestellten Impfkultur von D-Ribose-5-phosphat erhalten werden.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 verwendet. 300 ecm des gleichen Impfkulturmediums wie im Beispiel 1 werden in einen 2-1-Kolben gegeben und sterilisiert. Sodann wird der obige Stamm in diesem Medium unter Schütteln 21 Stunden bei 30° C gezüchtet. Ein gesondert hergestelltes Fermentationsmedium wird mit etwa 10 Volumprozent der wie oben hergestellten Impfkultur angeimpft. 31 des gleichen Fermentationsmediums wie im Beispiel 1 werden in einen 5-1-Fermentationsbehälter gegeben und sterilisiert. Nach 72 Stunden Züchtung unter Rühren und Belüftung haben sich 20,5 mg D-Ribose-5-phosphat je Kubikzentimeter der Fermentationsflüssigkeit angesammelt. In den Zellen läßt sich ebenfalls eine Ansammlung der Verbindung feststellen.

Nach der Entfernung der Zellen aus der Fermentationsflüssigkeit wird 11 des Filtrats der gleichen Behandlung wie im Beispiel 1 unterworfen, wobei 27,5 g des Bariumsalzes von D-Ribose-5-phosphat erhalten werden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biochemischen Herstellung von D-Ribose-5-phosphat, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikrococcus glutamicus ATCC Nr. 15455 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 in einem übliche Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen und Mineralsalz enthaltendem Nährmedium, das einen Gehalt von 0,20 bis 2,0 Gew./Volumprozent Phosphationen, 0,01 bis 0,2 Gew./Volumprozent Magnesiumionen und 0,1 bis 1,5 Gew./Volumprozent Kaliumionen aufweist, züchtet.