DE2037988C3

DE2037988C3 - Verfahren zur Herstellung von Cvtidin-S'-diphospho-cholin und seiner Salze

Info

Publication number: DE2037988C3
Application number: DE2037988A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tokio Hagino; Kiyoshi Sagamihara Kanagawa Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-08-04
Filing date: 1970-07-30
Publication date: 1980-01-31
Also published as: GB1300798A; JPS4841555B1; DE2037988B2; ES382365A1; FR2060327A1; DE2037988A1; FR2060327B1; CA934312A; US3684652A

Description

Bekanntlich ist Cytidin-5'-diphospho-cholin (CDP-Cholin) ein Coenzym des Fettstoffwechsels. Es wird nicht nur für die Biosynthese des Lecithins benötigt, sondern es spielt auch beim Aufbau von Plastnalogen in Leber und Gehirn eine Rolle. Der bei Kopfverletzungen

NH₂

beobachtete erniedrigte Phospholipidgehalt und erniedrigte Ascorbinsäurcgehalt wird durch intracarotiale Injektion von CDPChoIin normalisiert. Diese Verbindung weist die folgende Strukturformel auf:

c-

C H

Il

C H

CH₂ O P-OP O CH₂ CH₂

I
OH

C- H H C-

II C C" H

I
HO OH

Cytidin-S'-diphospho-cholin kann z. B. aus Hefe (Science. Band 124 (1956). Seite 81) oder synthetisch (Journal of Biological Chemistry. Band 222 (1956), Seiten 185-191; Chem. pharmac Bull (Tokyo) 10 (1962). S. 231; Japan Patent 6540/64). zitiert nach CA. 61 (1964). 13406) gewonnen werden. Die Herstellung von CDPChoIin im Großmaßstab bereitet jedoch Schwierigkeit ten, da die bekannten Verfahren zu seinef Herstellung nur geringe Ausbeuten ergeben und deshalb zu unerwünscht hohen Herstellungskosten führen. Aus diesem Grunde hai CDP-Chölin trotz seines unbestrittenen Wertes in der Praxis bisher nur geringe Bedeutung. Aufgabe der Erfindung war deshalb, ein Verfahren zur Herstellung von reitteiii CPD-Chöün zu schaffen, das gute Ausbeuten ergibt, billig ist und in industriellem

60

Maßstab durchführbar ist. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Cytidin-S'-diphospho-cholin, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man bei Temperaturen von etwa 20 bis 55°Cund einem pH-Wert von 5,0 bis 9.0 ein wäßriges Reakliönsmediuffi Vefgärtidas

a) Cholin und/oder Phospfiorylcholin,

b) Cytidin, dy(idiii-5'-monophosphat (im folgenden. als »CMP« bezeichnet), Cytidin-5'-diphösphal (int

folgenden als »GDP« bezeichnet) und/odcf 6yiidin-5'-lriphosphal (im folgenden als »CTP« bezeichnet),

c) Enzyme von

Brevibacterium ammoniagenes A.T.CC. 6872
Eseherichia coli AXGC 21148
Serratia marcescens A.T.CC. 2123
Aerobacter aerogenes A.T.CC. 21217 Corynebacteriumgluiamincum A.T.CC. 13287
Arthrobacter simplex AXGG 1577
Micrococcus sodonensis A.T.CC 11880
Pseudomonas fluorescens A.T.CC. 21256
Bacillus subtilis A.T.C.C. 15512 Nocardia globerula A.T.CC. 21022
Streptomyces ambofaciens A.T.CC. 15154
Penicillium chrysogenum A.T.CC 15241
Aspergillus terreus A.T.C.C 1012
Aspergillus FIavus A.T.CC 13698 Gibberella fujikuroi A.T.CC 20136
Rhizopus delemar A.T.CC 20134
Mucor javanicus A.T.C.C. 15242
Saecharom\i.es cerevisiae A.T.C.C. 15248
Saccharomyees iactis A.T.C.C. 12425 Torulopsis sphaerica A.T.C.C. 8549
Zygosaccharomyces major (Synonym Saccharomyees rouxii) A.T.C.C. 15249
Kloeckcrj africana A.T.C.C. I6512oder
Candida guilliermondii A.T.C.C. 1058

d) Phosphationen.

e) Magnesium- und/oder Manganionen und

Γ) mindestens einen vergärbaren Zucker enthält und das Cytidin-S'-diphospho-cholin aus der Gärmaische nach bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in ein Bt äensal/ jberführt.

Die Vergärung kann in üblichen ''Errichtungen bei Atmosphärendruck und Normaltemperatur durchgeführt werden. j·;

Die Ausgangsmaterialien Cylidin. CMP. CDP oder CTP sind handelsübliche Verbindungen und können synthetisch hergestellt werden. Außerdem kann Cytidin oder CMP durch enzymatischen Abbau von Ribonucleinsäuren hergestellt werden. CDP oder CTP können jo auch durch Phosphorylierung von CMP hergestellt werden. Diese Verbindungen können entweder in freier Form oder in Form ihrer pharmakologisch verträglichen Salze. z. B. als Namumsalz. verwendet werden.

Cholm wird industriell hergestellt und ist im Handel leicht erhältlich. Es kann in Form seiner pharmakologisch verträglichen Salze. /.. B. als Chlorid. Bromid. Citrat oder Gluconat, verwendet werden. Phosphorylcholin (Cholinphosphat) kann durch Phosphorylierung von Cholinchlorid hergestellt werden und ist im Handel wie Cholin als Chlorid erhältlich. Alle vorgenannten Formen können im Verfahren der Erfindung verwendet werden. Außerdem können auch funktionell Derivate anstelle von Cholin und Phosphorylcholin verwende! werden «

Die Konzentrationen von Cholin. CMP. CDP. CTP. Cytidin oder Phosphorylcholin sind nicht besonders kritisch, abgesehen davon.daß wirksame Mengen davon erforderlich sind. d. h. Mengen, die die Herstellung der gewünschten Menge an GDP-Cholin erlauben. Im •!!gemeinen wird Cytidin, CMP₁ GDP und/oder GTP in Mengen Vor) 1 g/Litef bis 1000 g/Liter, vorzugsweise 5 g/Liter bis 30 g/Liter, als freie Säuren eingesetzt, Die Cholin' und/oder Phosphorylcholirikonzentration be-Irägt vorzugsweise 0,5 g/Liter bis 50 g/Liter.

Die erforderlichen Phospliattonen können irt Form Von anorganischen Phosphaten, 2, B, KHjPO*, RsHPO₄, R₃PO₄, Na₂HPO₄, NaHiPO₄ und Na₃PO₄, zugegeben werden. Ebenso karn man auch die freie Säure, z. B. Phosphorsäure, zusetzen, die bei der Neutralisation mit einer geeigneten Base, z. B, NaOH, KOH oder NH₄OH, zur Phosphatbildung führt. In bestimmten Fällen, z. B. wenn CTP und Phosphoryleholin verwendet werden, ist es nicht notwendig, Phosphationen zuzugeben, da die erforderlichen Phosphationen vom CTP oder Phrsphorylcholin geliefert werden.

Die Phosphationenkonzentration ist ebenfalls nicht besonders kritisch und kann je nach den Erfordernissen über einen weiten Bereich variiert werden. Zur Erreichung optimaler Ergebnisse wird eine Phosphationenkonzentration von 2 g/Liter bis 200 g/Liter, vorzugsweise 10 g/Liter bis 40 g/Liter, empfohlen. Die Konzentration der Magnesium- und/oder Manganionen, die vorzugsweise als anorganische Salze, z. B. Magnesiumsulfat oder Mangansulfat, zugesetzt werden, liegt vorzugsweise im Bereich von 0,001 g/Liter bis 3 g/Liter. Wird das Enzym oder Enzymsystem nicht in gereinigtem Zustand zugesetzt, so kann man auf gesonderte Zugabe von Magnesium- oder Manganionen verzichten, da diese im Enzympräparat enthalten sind.

Die genannten Hefen. Bakterien und/oder Pilze werden im Verfahren der Erfindung in diner solchen Form verwendet, daß deren Enzymsysteme unter den Vergärungsbedingungen leicht in das wäßrige Nähnnedium abgegeben werden können. Geeignete Formen der Hefen. Bakterien oder Pilze erhält man z. B. durch Trocknen. Plasmolyse, Behandlung mit einem Lösungsmittel, wie Aceton. Extraktion. Behandlung mit einer grenzflächenaktiven Verbindung oder Ultraschallbehandlung. Vorzugsweise werden Hefen-. Bakterienoder Pilzzellen verwendet, die bei industriellen Fermentationsprozessen als Nebenprodukte anfallen und als Acetontrockenpulver gewonnen werden. Natüilich können auch flüssige Extrakte aus den genannten Hefen. Bakterien oder Pilzen verwendet wei-J-rn. deren Zellen mechanisch, durch Ultraschall oder durch Behandlung mit bakteriolytisch wirkenden Enzymen zerstört wur den.

Das wäßrige Reaktionsmedium wird ferner mit einem oder mehreren vergärbaren Zuckern, wie Glucose. Fructose. Saccharose oder Maltose, versetzt. Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in Abwesenheit von vergärbaren Zuckern durchgeführt wird, ist die Ausbeute an CDP-Cholin geringer Der vergärbare Zucker wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 5 g/Liter bis 100 g/l.iter dem wäßrigen Reaktions medium zugesetzt.

Nach der Zugabe der vorgenannten Bestandteile zum Reaktionsmedium wird der pH-Wert mit einer Säure oder Lauge auf 5,0—9,0. vorzugsweise 7,0 — 7,2. einge stellt. Die Vergärung kann bei Normaltemperatur oder bei mäßig erhöhten Temperaturen, z. B. 20 bis 55"C. durchgeführt werden, bis sich eine wesentliche Menge von CDP-Cholin gebildet hat. Die Vergärungszeit hängt von der Vergärungstemperatur und dem pH-Wert ab. beträgt aber im allgemeinen etwa 0,5 bis !Q Stunden; Die Bildung von GDP'Cholin kann dufch Dünnschichtchro* matdgraphie öder durch andere geeignete AnylseriVeffahren verfolgt werden.

Nach der Beendigung der Vergärung werden die Bakterien, Pilze oder Feststoffe aus der Gärrnaische entfernt, und das CDP-Gholiii wifd mit Hilfe eines [öiienaustauschefhäfzes in bekannter Weise abgetrennt und gewonnen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel I

30 ml eines Reaktionsmediums vom pH-Wert 7,0 enthielten 738 mg/ml des Dinatriumsalzes von CMP, 24 mg/ml Cholin, 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml acetongetrocknete Zellen von Brovibacterium ammoniagenes A.T.C.C. 6872, ll,6nig/ml Kaliumdihydrogenphosphat. 20 mg/ττίΙ Dikaliumhydrogenphosphat und 2,96 mg/ml Magnesiumsulfat (MgSÜ4 · 7 HiO). Dieses Gemisch befand sich in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben und wurde 4 Stunden bei 30⁰C inkubiert. Aus 50 Erlenmeyerkolben wurden etwa 1,5 Liter Gärmaische erhalten.

Aus der entstandenen Gärmaische wurden die Feststoffe abfiltriert. 1.2 Liter des Filtrats mit 3,8 mg/ml CDP-Cholin wurden mit 0,5 η KOH-Lösung auf den pH-Wert 8,5 eingestellt. Das Filtrat wurde an einer Säule, die mit dem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1 χ 2 (Ameisensäure-Form) beschickt war. Chromatographien. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser wurde die Säule mit einem Ameisensäure-Gradienten eluiert, wobei die Ameisensänrekonzentration bis 0.04 η anstieg Die mit Hilfe dieses Gradienten eluiertc CDP-Cholin enthaltende Fraktion wurde mit Aktivkohle behandelt. Dann wurde mit Aceton eluien. Das Eluat wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 1.3 g CDP-Cholin als weißes Pulver.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde ohne Glucosezusatz wiederholt. Man erhielt nur 0,3 mg/ml CDP-Cholin. Züchtete man in einem Reaklionsmedium, das außerdem kein Dinatriumsalz von CMP und kein Cholin enthielt, so konnte keine Bildung von CDP-Cholin festgestellt werden (weniger als 0.05 mg/ml).

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß anst'lle des Dinatriumsalzes von CMP 4 mg/ml Cytidin verwendet wurden. Man erhielt 0.5 bis 0.6 mg/ml to CP-Cholin.

Beispiele 4 bis 19

Beispiel I wurde wiederholt, aber ansiellc der Ze!'körper von Brevibacteriim ammoniagenes wurden Zellkörper der in Tabelle I angeführten Mikroorganismen verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle	I	Menge an gebildetem CDP-Cholin
Beispiel Nr.	Stamm	(mg/ml)
		2.5
4	Escherichia coil A.T.C.C. 21148	0,7
5	Serratia marcescens A.T.CC. 21213	0,6
6	Aeröbacler aefogertes A.T.C.C. 21217	0,9
7	Curyiiebacteriüm glutamicüm A.T.C.C. 13287	0,7
8	Arthfobacter simplex A.T.C.C. 15799

50

55

60

65

Beispiel Nr.	Stamm	Menge an gebildetem CDP-Cholin
		(mg/ml)
9	Micrococcus sodonensis A.T.C.C. 11880	0,5
10	Pseudomonas fluorescens A.T.C.C. 21256	0,7
11	Bacillus subtilis A.T.C.C. 15512	0,6
12	Nocardia globerula A.T.C.C. 21022	0,8
13	Stremtomyces ambofaciens A.T.C.C. 15154	0,8
14	Penicillium chrysot,-'.ium A.T.C.C. 15241	0.9
15	Aspergillus terreus A.T.C.C. 1012	0,6
)6	Aspergillus flavus A.T.C.C. 13698	0,5
17	Gibberella fujikuroi A.T.C.C. 20136	1,2
18	Rhizopus delemar A.T.C.C. 20134	0.5
19	Mucor javanicus	0,5

A.T.C.C. 15242

Beispiel

Beispiel I wurde wiederholt, aber anstelle des Dinatriumsalzes von CMP wurden 8.1 mg/ml CDP verwendet. Man erhielt 4.1 mg/ml CDP-Cholin.

Beispiel 21

Beispiel 1 wurde wiederholt, ftber anstelle des Dinatriumsalzes von CMP wurden 9.7 mg/ml CTP verwendet. Man erhielt 4.1 mg/m! CDP-Cholin

Beispiele 22 bis 37

Es bildeten sich fast gleiche Mengen an CDP-Cholin wie in den Beispielen 4 bis 19 mit den dort beschriebenen Stämmen, wenn die Züchtung in 5 ml Reaktionsmedium in einem Reagenzglas untt. Schütteln auf ähnliche Weise, wie in den Beispielen 4 bis 19 öeschrieben. durchgeführt wurde, wobei aber anstelle von CMP 8.1 mg/ml CDP oder 9.7 mg/ml CTP verwendet wurden.

Beispiele 38bis43

In einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben befanden sich 30 ml eines Reaktionsmediums vom pH-Wert 7,0. Es enthielt 8,1 mg/ml CDP, 24 mg/ml Chölin.

10 mg/ml Glucose, 10Ö mg/ml ace'.ongetrocknete Zellkörper der in Tabelle Il aufgeführten Mikroorganismen, 11,6 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrcgenphosphal und 2,96 mg/ml MgSO₄ · 2 H₂O. Man züchtete 4 Stunden bet 3O⁰C. Die Feststoffe wurden Von der Gärmaische abfiltriert. Die Konzentration von CDP-Cholin im Filtrat ist rn Tabelle

11 angegeben.

I

Tabelle

1

38

7

11

¹J JlIkJfJ¹JhIL-J.' WiTTt-'.7!BBWWP";!'
20 >

III

Menge an

37

988

8

Beispiel Stamm

S

Menge an

PMD Oi mn/ml ί

und 2,96 mg/ml f

CDP-Cholin im \

I

gebildetem

Nr.

gebildetem
CDP-Cholin

Cholin, 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml acetongetrockne· J

MgSO₄ · 2 H₂O. Man züchtete 4 Stunden bei 30°C. Die \

I

j

Beispiel
Nr.

39

Stamm

CDP-Cholin

(mg/rill)

te Zellkörper der in Tabelle IV aufgeführten Mikroörga- |

in der Gärmaische enthaltenen Feststoffe wurden |

!

(mg/ml)

hismen, Ii.6 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, \

abfiltriert. Die Konzentration von

40

Menge an
gebildetem

48 Kloeckera africana

'.² :

20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat

Filträl ist in Tabelle IV angegeben.

ι.
Menge an \

CDP-Cholin

5

A.T.C.C. 16512

Tabelle IV

gebildetem \

41

Saccharomyces cerevisiae

(mg/ml)

3,6

49 Candida guillierniondii

'•³ 1

CDP-Cholin ί

A.T.C.C. 15248

A.T.C.C. 9058

1

Beispiel Stamm

Saccharomyces lactis

3J

Saccharomyces cerevisiae

3,3

i

Nr.

(mg/ml) ;

A.T.C.C. 12425

IO

Beispiele 50bis55

42

Torulopsis sphaerica

2,3

Saccharomyces lactis

3,1

Ein 250 ml fassender Erlenmeyerkolben enthielt 30 ml J

3,6 \

A.T.C.C. 8549

A.T.C.C. 12425

1,7

eines Reaktionsmediunis vom pH-Wert 7,0. Es enthielt ί

' " Ί

Zygosaccharomyces major

2,8

Torulopsis sphaerica
A.T.C.C. 8549

7 IR mtr/rnl rlpc Dinplriiimcal-yiic urm

2,2 3

j" I

43

(SynnnVm .S.irxharnmyr.e.s

Zygosaccharomyces major

15

50 Saccharomyces cerevisiae

') ■

rouxii)

2,1

(Synonym Saccharomyces

A.T.C.C. 15248

2,8 i

A.T.C.C. 15249

rouxii)

51 Saccharomyces lactis

Kloeckera africana

A.T.C.C. 15249

A.T.C.C. 12425

2,1 \

;

A.T.C.C. 16512

52 Torulopsis sphaerica

1,2

20

A.T.C.C. S549

ι .

Candida guilliermondii

53 Zygosaccharomyces major

1,3 1

"7

A.T.C.C. 9058

(Synonym Saccharomyces

ψ

1,1

rouxii)
A.T.C.C. 15249

V

Beispiele 44 bis 49

54 Kloeckera africana
A T" f~* f~* KCC11

f
I

» Ι·*

25

A.l.C.C 16512

55 Candida guilliermondii

Die Beispiele 38 bis 43 wurden wiederholt, anstelle

A.T.C.C. 9058

von CDP wurden jedoch 9.7 mg/ml CTP verwendet.

Man erhielt folgende Ergebnisse.

30

!

I

Tabelle

Beispiel

35

Nr.

■i0

44

45

46

47

50

Claims

Patentansprüche:

I. Verfahren zur Herstellung von Cyiidin-5'-diphospho-cholin, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Temperaturen von 20 bis 55° C und einem pH-Wert von 5,0 bis 9,0 ein wäßriges Reaktionsmedium vergärt, das

a) Cholin und/oder Phosphorylcholin,

b) Cytidin, Cytidin-5'-monophosphat, Cytidin-5'-diphosphat und/oder Cytidin-5'-triphosphat,

c) Enzyme von

Brevibacterium ammoniagenes A.T.QC. 6872
Escherichia coli A.T.CC.21148
Serratia marcescens A.T.CC2123
Aerobacter aerogenes A.T.CC 21217
Corynebacterium glutamicum A.T.CC 13287
Arthrobacter simplex A.T.CC. 15799
MicrococciiS sodonensis A.T.C.C.! '.880
Pseudomonas fluorescens A.T.CC. 21256
Bacillus subtilis A.T.CC. 15512
Nocardia globerula A.T.CC. 21022
Streptomyces ambofaciens A.T.CC. 14154
Penicillium chrysogenum A.T.C.C. 15241

Aspergillus terreus AXCC 1012

Aspergillus flavus AXCC 13698

Gibberella fujikuroi A-XCC 20136
Rhizopus delemar AXCC 20134
MucorjavanicusA.T.CC 15242
Saccharomyces cerevisiae A.T.CC. 15248

Saccharomyces lactis AX.CC 12425

Torulopsis sphaerica AX.C.C8549
Zygosaccharomyces major (Synonym
Saccharomyces rouxii) A.T.CC. 15249
Kfoeckera africana A.T.CC 16512 oder

is Candida guilliermondii A.T.CC9058,

d) Phosphationen,

e) Magnesium- und/oder Manganionen und

f) mindestens einen vergärbaren Zucker enthält, und das Cytidin-S'-diphospho-cholin aus der Gärmaische nach bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in ein Basensalz überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als vergärbaren Zucker Glucose 2"i verwendet.