DE2037988A1 - Verfahren zur Herstellung von Cytidin 5 diphospho chohn und seiner Salze - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Cytidin 5 diphospho chohn und seiner SalzeInfo
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Description
11 Verfahren zur Herstellung von Cytidin-S'-diphospho-cholin und
seiner Salze "
Priorität: 4. August 1969, Japan, Ir. 60999/69
Bekanntlich ist Cytidin-S'-diphospho-eholin (CDP-Öholin) ein
Coenzym des Pettstoffwachsels. Es wird nicht nur für die Biosynthese des Lecithins benötigt, sondern es spielt auch beim Aufbau
von Plasmalogen in Leber und Gehirn eine Rolle. Der bei Kopfverletzungen
beobachtete erniedrigte Phospholipidgehalt und erniedrigte Ascorbinsäuregehalt wird durch intracarotiale Injektion
von CDP-Cholin normalisiert. Diese Verbindung weist die folgende
Strukturformel auf:
109808/22S1
N5is
II
O .0
|_oji
5 /
Cytidin/dipliospho-Gholin kann a.Be aus Hefe (Science, Band 124
(1956), Seite 81) oder synthetisch (Journal of Biological -
Chemistry, Band 222 (1956),, Seiten 185 - 191? Chemopharmac. BuIl0
(Tokyo) 10 (1962), S. 231? Japan Patent 6540/640* zitiert nach
CA. 61 (I964)s 13406) gewonnen v/erdenο- Die Herstellung von
CDB-Cholisa im GraBmaßstab "bereitet jedoch Schwierigkeiten, da
die bekannten Yerfahren zu seiner Herstellung nur geringe Ausbeuten
ergeben und deshalb zu unerwünscht hohen Herstellungskosten führen. Aus diesem Grunde hat CDP^Cholin trotz seines
unbestrittenen. Wertes in-der Praxis nur geringe Bedeutung,,. Aufgäbe
der Erfindung war deshalb^ ein Yerfahren zur Herstellung
von reinem GDP-Cholin zu sehaf£ens das gute Ausbeuten ergibt,.
™ billig ist und"in industriellem Maßstab durchführbar ist· Diese
Aufgabe wird durch die Erfindung gelöste
Gegenstand, der Erfindung ist.somit ein Yerfahren zur Herstellung
von Cytidin-5'-diph.osph.o--cho.lin,_ das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man ein wässriges Reaktionsmedium vergärt, das
a) Cholin und/oder Phosphoryleholin,
b) Cytidin9 C3rtidin-5s™monophosphat (im Folgenden, als "CIiP" bezeichnet),
Cytidin™5'™diphosphat (im Folgenden als "CDP" bezeichnet)
und/oder Cytidin~58-triphosphat ( im Folgenden als
t!CTP" bezeichnet)p
c).-.Enzyme aus Hefen,Bakterien, z.B. der Ordnung Aotinomycetes,
oder Pilzen, ■
d) J'hosphationen und
e) Magnesium- und/oder Hanganionen enthält, und das Cytidin-51-diphospho-cholin
aus der Gäriaaische nach bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in ein Basensalz überführt.
Die Vergärung kann in üblichen Vorrichtungen bei Atmosphärendruck und Xormaltenperatur durchgeführt werden.
Die Ausgancsniaterialien Cytidin, CMP, CDP oder CTP sind handeis- A
übliche Verbindungen und können synthetisch hergestellt werden. Ausserdem kann Cytidin oder CMP durch enzymatischen Abbau von
Kibonucleinsäuren hergestellt werden CDP oder CTP können auch
durch Phosphorylierung von CnY hergestellt werden. Diese Verbindunjen
können entweder in freier Form oder in Form ihrer pharmakolagisch verträglichen Salze, z.B. als llatriumsalz, verwendet
werden.
Cholin wird industriell hergestellt und ist im'Handel leicht erhältlich.
Bs kann in Form seiner pharnakologisch verträglichen "
Salze, z.B. als Chlorid, Bronid, Citrat oder Gluconat,- verwendet
werden. Phosphorylcholin (Cholinphcsphat) kann durch Phosphorylierung von Cholinchlorid hergestellt v;erden und ist in
Handel wie Cholin als Chlorid erhältlich. Alle virgenannten Formen
können im Verfahren der Erfindung verwendet werden. Ausserdem
können auch funktioneile Derivate anstelle von Cholin und Phosphorylcholin verwendet werden.
109808/2251
Die Konzentrationen von ChOUn9 CMP9 CDP, CTP, Cytidin oder
Phosphorylcholin sind nicht besonders kritisch, abgesehen davon, dass wirksame Mengen davon erforderlich sind, d.h. Mengen,
die die Herstellung der gewünschten Menge an CDP-Cholin erlauben.
Im allgemeinen wird Cytidin, CMP, CDP und/oder CTP in Mengen von 1 g/Liter bis 1000 g/Liter, vorzugsweise 5 g/Liter bis
30 g/Liter, als freie Säuren eingesetzt. Die Cholin- und/oder Phosphorylcholinkonzentration beträgt vorzugsweise 0,5 g/Liter
bis 50 g/Liter.
Die erforderlichen Phosphationen können in Form von anorganischen
Phosphaten, z.B. KH2PO^, K2HPO., K5PO., Na2HPO4, NaH2PO. und
Na-zPOi, zugegeben werden. Ebenso kann man auch die freie Säure,
z.B. Phosphorsäure, zusetzen, die bei der Neutralisation mit einer geeigneten Base, z.B. ITaOH, KOH oder NH.OH, zur Phosphatbildung
führt. In bestimmten Fällen, z.B. wenn CTP und Phosphorylcholin verwendet werden, ist es nicht notwendig, Phosphationen
zuzugeben, da die erforderlichen Phosphationen vom CTP
oder Phosphorylcholin geliefert werden.
Die Phosphationenkonzentration ist ebenfalls nicht besonders kritisch und kann je nach den Erfordernissen über einen weiten
Bereich variiert werden. Zur Erreichung optimaler Ergebnisse wird eine Phosphationenkonzentration von 2 g/Liter bis 200 g/Liter,
vorzugsweise 10 g/Liter bis 40 g/Liter, empfohlen. Die Konzentration
der Magnesium- und/oder Manganionen, die vorzugsweise als anorganische Salze, z.B. Magnesiumsulfat oder Mangansulfat,
zugesetzt werden, liegt vorzugsweise im Bereich von 0,001 g/Liter bis 3 g/Liter. Wird das Enzym oder Enzymsystem nicht in ge-
109808/22 51
reir^igtem Zustand zugesetzt, so kann man auf gesonderte.Zugabe
von Magnesium- oder Manganionen verzichten, da diese im Enzympräparat
enthalten sind.
Hefen, Bakterien und/oder Pilze werden im Verfahren der Erfindung
in einer solchen Form verwendet, dass deren Enzymsysteme v
unter den Vergärungsbedingungen leicht in das wässrige Hährmedium
abgegeben .werden können. Geeignete Hefen, Bakterien oder
Pilze erhält man z.B. durch Trocknen, Plasmolyse, Behandlung mit einem Lösungsmittel, wie Aceton, Extraktion, Behandlung mit
einer grenzflächenaktiven Verbindung oder Ultraschallbehandlung. Vorzugsweise werden Hefen-, Bakterien- oder Pilzzellen verwendet, die bei industriellen Fermentationsprozessen als Nebenprodukte
anfallen und als Acetontrockenpulver gewonnen werden. Hatürlich
können auch flüssige Extrakte aus Hefen, Bakterien oder
Pilzen verwendet werden, deren Zellen mechanisch, durch Ultraschall,
oder durch Behandlung mit bakteriolytisch wirkenden Enzymen
zerstört wurden. Beispiele für Bakterien, Pilze und Hefen,
die im Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind (J
Brevibaeterium ammoniagenes JLT.C.C, 6872
Escherichia coli A.T.C.C. 21148
Serratia marcescens A.T.CC. 2123
Serratia marcescens A.T.CC. 2123
Aerobacter aerogenes A.T.CC. 21217 .
Corynebacterium glutamincum A.T.CC 13287
Arthrobacter simplex A.T.CC 1577
Micrococcus sodonensis A.T.CC 11880
Pseudomonas fluorescens A.iP.C.C. 21256 Bacillus subtilis A.iP.CC 15512
Nocarclia globerula A.T.CC, 21022
Micrococcus sodonensis A.T.CC 11880
Pseudomonas fluorescens A.iP.C.C. 21256 Bacillus subtilis A.iP.CC 15512
Nocarclia globerula A.T.CC, 21022
. 1098.08/2251 . ..■■■■
Streptomyces ambofaciens A.1a C0C 15154
Penicillium ehrysogenusa A.T.C.C. 15241
Aspergillus terreus AcT8CC 1012
Aspergillus flaws A. T8C0C0 13698
Gibberella fujlkuroi A.T.C.C. 20136
Bhizopus delemar A.T.C.C. 20134
Mucor javanicus A.T.C.C. 15242
Sacoharomyoes eerevisiae A0T0C0C0 15248
Saccliaromyces lactis A0T0C0C0 12425
Torulopsis sphaerica A0S0CC0 8549
Zygosacch&romyces major (Synonym Saccharomyees rouxii)
A.T.CC 15249
Kloeokera afrieaaa A0T0C0C0 16512
Candida guillieraondii A0T0CoC0 9058
Bei einer beirorsugten Burcliftilirungsform dea Terfahrens der Erfindung
wird aas wässrige Seaktionemedium mit einem oder mehreren
verwertbaren Zuckern, E0B0 GlueosSj, FructoseB Saccharose oder
Maltose, versetzt. Dadurch wird die Herstellmig eon CDP-Cholin
.in grössereil Ausbeuten ermöglichte Der verwertbare Zucker wird
vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 5 g/Liter "bis
100 g/Liter dem wässrigen Heaktionsmedium zugesetzt«
Nach der Zugab© der vorgenannten Bestandteile zum Keaktionsmedium
wird der pCT-Wert mit einer Säure oder lauge; auf 5,0 - 9,0,
vorzugsweise ?s0 - 7» 2, eingestellt o Die Vergärung kann bei llor-'
maltemperatur oter bei massig erhöhten Temperaturen,- Z0B,' 20 bis
55 C, durchgeführt werden, Ms sieh eine wesentliche Menge von CDP-Cholin gebildet hato Di© Vergärungsze-it hängt γοη der Yer--
gärungstemperatur und dem p„-Wert: ab, beträgt aber im allgemeinen
etwa 0,5 bis 10 Stunden. Die Bildung von CDP-Chοlin kann durch
Dünnschichtchronatographie oder durch andere geeignete Analysenverfahren verfolgt werden. '
Nach der Beendigung der Vergärung werden die Bakterien, lilze
oder Peststoffe aus der Gärmaische entfernt, und das CDP-Cholin
wird nithilfe eines Ionenaustauscherharzes in bekannter Weise
abgetrennt und gewonnen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
30 ml eines Reaktionsraediums vom p„-Wert 7,0 enthielten
7,38 Ec/ml des Dinatriumsalzes von CMP, 24 mg/ral Cholin,
10 mß/ml Glucose, 100 ntg/ml acetongetrocknete Zellen von Brevibacterium
amraoniagenes A.T.C.C. 6872, .11,6 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat,
20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 2,96 mg/ml
Magnesiumsulfat (MgSO/.? H2O). Dieses Gemisch befand sich in ■
einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben und wurde 4 Stunden bei
ο
30 C inkubiert. In der Gärmaische bildeten sich 3,8 mg/ml CDP-Cholin.
30 C inkubiert. In der Gärmaische bildeten sich 3,8 mg/ml CDP-Cholin.
Aus der entstandenen Gärmaische wurden die Feststoffe abfiltriert.
1,2 Liter des Piltrats wurden mit 0,5 η KOH-Lösung auf den
powert 8,5 eingestellt. Das Pil trat wurde an einer Säule, die
mit dem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x2
(Ameisensäure-Form) beschickt war, chromatographiert. liach dem
Waschen des Harzes mit Yiasser wurde die Säule mit einem Ameisensäure-Gradienten
eluiert, wobei die Ameisensäurekonzentration
V098O8/2251
bis 0,04- η anstieg. Die mithilfe dieses Gradienten eluierte
CDP-Cholin enthaltende Fraktion wurde mit Aktivkohle behandelt.
Dann wurde mit Aceton eluiert. Das Eluat wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 1,3 g CDP-Cholin als weisses Pulver.
Beispiel 1 wurde ohne Glucosezusatz wiederholt. Man erhielt nur 0,3 mg/ml CDP-Cholin. Züchtete man in einem Reaktionsmedium, das
ausserdem kein Dinatriumsalz von CMP und kein Cholin enthielt, so konnte keine Bildung von CDP-Cholin festgestellt werden
(weniger als 0,05 mg/ml).
Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass anstelle des Dinatriumsalze"s von CIIP 4 mg/ml Cytidin verwendet wurden. Man erhielt
0,5 bis 0,6 mg/ml CDP-Cholin.
Beispiel 1 wurde wiederholt, aber anstelle der Zellkörper von Brevibacterium ammoniagenes wurden Zellkörper der in Tabelle I
angeführten Mikroorganismen verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
109808/2251
3?abelle I
Stamm
4 Escherichia coli A.T.C.C. 21148
5 Serratia marceseens A.T.CC. 21213
6 Aerobaeter aerogenes A.T.C.C. 21217
7 Corynebacterium glmtamicuia
A.T.C.C. 13287
8 Arthrobacter simplex A.T.CC. 15799
9 Micrococeus sodonensis A.T.G.C. 11880
10 Pseudomonas fluorescens A.f.C.C. 21256
11 Bacillus subtilis A.Ο?. C. C. 15512
12 Nocardia globerula A,3?,(J.C# 21022
13 Stremtomyces ambofaciens A.T.C.O. 15154
14 Penicillium chrysogenum A.T.G.G. 15241
15 Aspergillus terreus A.T.G.G. 1012
16 , Aspergillus flavus A.T.G.G. 13698
17 Gibberella fujikuroi A.T.G.C, 20136
18 Rhizopus delemar A.T.G.C* 20134
19 Mucor javanicus A.a?.C,G· 15242
Menge an gebildetem CDP-Cholin
(mg/ml)
2,5 0,7 0,6
0,9
0,7 0,5 0,7 0,6 0,8 0,8
0,9 0,6
0,5 1,2
0,5 0,5
B e i a ρ i e 1 20
Beispiel 1 wurde wiederholt, aber anstelle des Dinatriumsalzes
von CMP wurden 8,1 mg/ml CDP verwendet. Man erhielt 4,1 mg/ml
CDP-Cholin.
- Beispiel 21
Beispiel 1 wurde wiederholt, aber anstelle des Dinatriumsalzes von CMP wurden 9,7 rag/ml CTP verwendet· Man erhielt 4,1 mg/ml
CDP-Cholin.
109808/2251
Es bildeten sich fast gleiche Mengen an CDP-Cholin wie in den
Beispielen 4 bis 19 mit den dort beschriebenen Stämmen, wenn die
Züchtung in 5 ml Reaktionsmedium in einem Reagenzglas unter Schütteln auf ähnliche Weise, wie in den Beispielen 4 bis 19
beschrieben, durchgeführt wurde, wobei aber anstelle von CMP 8,1 mg/ml CDP oder 9f7 mg/ml GTP verwendet wurden.
B e i s ρ i e 1 38
In einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben befanden sich 30 ml eines Reaktionsmediums vom Pg-Wert 7,C Es enthielt 8,1 mg/ml
CDPf 24 mg/ml Cholin, 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml getrocknete
Bäckerhefe, 11,6 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat
und 2,96 mg/ml MgSO^.2 H2O. Man züchtete
4 Stunden bei 300C. In der Gärmaische bildeten sich 4,2 mg/ml
CDP-Cholin.
Die Feststoffe wurden von der Gärmaische abfiltriert. 1,2 Liter
Filtrat wurden mit 0,5 η KOH-lÖsung auf den pH~Wert 8,5 eingestellt.
Das Filtrat wurde an einer mit dem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x2 (Ameisensäure-Form) beschickten
Säule chromatographiert. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser
wurde die Säule mit einem Ameisensäure-Gradienten bis zu einer maximalen Ameisensäurekonzentration von 0,04 η eluiert.
Die mithilfe dieses Gradienten eluierte, CDP-Cholin enthaltende
Fraktion wurde gesammelt und zur Absorption des CDP-Cholins mit
Aktivkohle versetzt. Dann wurde mit Aceton eluiert und das Eluat
wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 1,8 g CDP-Cholin als Pulver. .
109808/2251
Beispiel 39
Beispiel 38 wurde ohne Glucosezusatz wiederholt. Man erhielt
nur 0,4 mg/ml CDP-Cholin. Wurde die Züchtung in einem Mährmedium
durchgeführt, das ausserdem kein CDP und kein Cholin enthielt,
konnte koine .Bildung von CDP-Cholin festgestellt werden (weniger
als 0,05 rag/ml).
B e i s ρ i e 1 40
Beispiel 38 wurde wiederholt, aber anstelle von CUP wurden
9,7 mg/ml CTP verwendet. Kan erhielt 4,3 rag/ml CDP-Cholin.
Beispiel 38 wurde wiederholt, aber anstelle der getrockneten
Bäckerhefe wurden acetongetrocknete Zellkörper der in Tabelle II
aufgeführten HikrοOrganismen verwendet. Man erhielt folgende Ergebnisse:
Beisüiel Nr*
41 42 43 44
45 46
Stamm
Sacchar^myees cerevisiae A. T.C. C. 15248
Saccharorayces lactis A.T.C.G. 12425
Torulopsis sphaerica A.T.C.C. 8549
Zygosaccharcmyces major
(Synonym Saccharomvces rouxii)
A.T.C.Cr 15249
Kloeckera africana A.T.C.C. 16512
Candida guilliermondii A.T.C.C. 9058
Menge an gebildetem CDP-Cholin (cir/ml)
3,7 2,3 2,8 2,1
1,2 1,1
Die Beispiele 41 bis 46 wurden wiederholt, aber anstelle von CDP wurden 9,7 mg/ml CTP verwendet. Man erhielt folgende Ergeb-
109808/2251
nisse:
Beispiel Kr.
47 48 49 50
51 52
Tabelle III Stamm
Saccharomyces cerevisiae A.T..C.C. 15248
Saccharomycee lactis A.T.C.C. 12425
Torulopsis sphaerica A.T.C.C. 8549
Zygosaccharomyces major A.T.C.G, 15249
(Synonym Saccharomyces rouxii)
Kloeckera africana A.T.C.C. 16512
Candida guilliermondii A.T.C.C. 9058
Menge an gebildetem CDP-Cholin
(mg/ml)
3,6 3,3 3,1 1,7
1,2 1,3
In einem 250 ml .fassenden Erlenraeyerkolben befanden sich 30 ml
eines flüssigen Reaktionsgemisches vom p„-V/ert 7,0. Es enthielt
7,38 mg/ml des Dinatriunsalzes von CIiP, 24 mg/ml Cholin, 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml getrocknete Bäckerhefe, 11/6 mg/ml
Kaliuindihydrogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und
2,96 mg/ml KgSO4.2 H2O. Man züchtete 4 Stunden bei 3O0C. In der
Gärmaische entstanden 4,0 mg/ml CDP-Cholin.
Die in der Gärmaische enthaltenen Peststoffe wurden abfiltriert. Der Pjj-Wert von 1,2 Liter der Gärmaische wurde mit 0,5 η KOH-Lösung
auf 8,5 eingestellt. Das Piltrat wurde an einer mit dem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x2 (Ameisensäure-Form)
beschickten Säule chromatographyert. Nach dem Waschen des
Harzes mit V/asser wurde mit einem Ameisensäure-Gradienten eluiert,
wobei die Ameisönsäurekonzentration bis maximal 0,04 η anstieg.
Die mithilfe des Gradienten eluierte, CDP-Cholin enthaltende
Fraktion wurde gesammelt und zur Absorption des CDP-Cholins
109808/2251
mit Aktivkohle versetzt. Da*:n wurde mit Aceton eluiert und das
Eluat wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 1,8 g- CDP-Cholin
als Pulver.
Beispiel 53 wurde ohne Glueosezusatz wiederholt. Man erhielt nur
0,4 mg/ml CDP-Cholin. Wurden bei der Züchtung ausserdem CMP und Cholin weggelassen, so konnte keine Bildung con CDP-Cholin festgestellt
werden (weniger als 0,05 mg/ml).
Beispiel 53 wurde wiederholt, anstelle der getrockneten Bäckerhefe
wurden jedoch die'in Tabelle IY aufgeführten Mikroorganismen
verwendet. Man erhielt folgende Ergebnisse:
Ir.
57 58,
Tabelle Stamm
Saccharomyces cerevisiae A.T.C.C. 15248
Saccharomyces lactis A.T.C.C. 12425
Torulopsis sphaerica A.T.C.C. 8549
Zygosaccharomyces major A.T.C.C. 15249
(Synonym. Saccharomyces rouxii) Kloeckera africana A.T.C.c. 16512
Candida guilliermondii A.T.C.C. 9058
Menge an gebildetem CDP-Cholin (mg/ml)
3,6 2,2 2,8 2,1
1,3
Ein 250 ml fassender Erlenmeyerkolben enthielt 30 ml eines Reaktionsmediums
vom PjT-Wert 7,0. Es enthielt 7»38 mg/ml des Dinatriumsalzes
von CMP, 72,4 mg/ml Phosphorylcholin, 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml getrocknete Bäckerhefe, 11,6 mg/ml Kaliumdihy-
109808/2251
und drogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat/ 2,96 mg/ml
MgSO/.2 H2O. Man züchtete 4 Stunden "bei 30 G. In der Gäraaische
entstanden 3,8 mg/ml CDP-Cholin.
Die in der Gärmaische enthaltenen Feststoffe wurden abfiltriert,
und der pH-Wert von 1,2 Liter des PiItrats wurde mit 0,5 η KOH-Lösung
auf 8,5 eingestellt» Das Filtrat wurde an einer mit dein
stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x2 (Ameisensäure-Form)
beschickten Säule chromatographiert, Nach dem Waschen des
Harzes mit Wasser wurde mit einem Ameisensäure-Gradienten eluiert,
wobei die Ameisensäurekonzentration bis maximal 0,04 η
anstieg. Die mit diesem Gradienten eluie^te CDP-Cholin enthaltende
Fraktion wurde gesammelt und zur Adsorption des CDP-Cholins mit Aktivkohle versetzt» Dann wurde mit Aceton eluiert.
Das Eluat wurde eingedampft und getrocknet,, Man erhielt 1,7 g
CDP-Cholin als Pulver.
ORIGINAL Mit
109808/22S1
Claims (13)
- . ... - 15 -.■.■■■■.... Patent a na prü ehe»1.. Verfahren zur Herstellung von Cytidin-5'-diphospho-cholin, d a d u r c h g e k e η η ζ e i c h η e t, dass man ein wässriges Heakti onsiaedium vergärt, dasa) Cholan und/oder Phosphorylcholin,b) Cytidin, Cytidin-5'-monophosphat, Cytidin-5'-diphosphat und/ oder Cytidin-5'-triphosphat,c) linzyne aus Hefen, Bakterien oder Pilzen,d) Phosphationen und ·e).Magnesium- und/oder Hancanionen enthält, und das Cytidin-51-diphospho-cholin aus der Gärmaische nach bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in ein Basensalz überführt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenwart mindestens eines verwertbaren Zuckers durchführt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,dass nan die Vergärung bei Temperaturen von etwa 20 bis 55 C Λ durchführt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass n:an die Vergärung bei einem Pjj-'rfert des wässrigen Real:- tionsnedius von etwa 5,0 bis 9,C durchführt.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenwart von a) Cholin undb) Cytidin-5'-monophosphat durchführt.109806/2251
- 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4S dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenwart von a) Cholin und b) Cytid'in durchführt.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenv/art von a) Cholin. undb) Cytidin-5'-diphosphat durchführt.
- 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenwart von a) Cholin undb) Cytidin-5'-triphosphat durchführt.
- 9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Phosphationen in Form eines Gemisches aus Kaliumdihydrogenphosphat und Dikaliumhydrogenphοsphat zusetzt»
- 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man e) Magnesiumsulfat verwendet.
- 11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als verwertbaren Zucker Glucose verwendet.
- 12. Verfahren nach Anspruch .1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cytidin-5'-diphospho-cholin durch Chromatographie des Piltrats der wässrigen Gärmaische an einer mit einem Ionenäustauscherharz beschickten Säule durchführt.
- 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung mit Hilfe mindestens eines der folgenden Mikroorganismen durchführt:1098 08/2251ν , ■·.-.■ - 17 - : ■ ■■■'■ ' -Brevibacterium ammoniagenes A.T,C.C. 6872Escherichia coli A.T.C.C. 21148 · ·Serratia maicescens A. T.C,C. 2123Aerobacter aerogenes A.T.C.C. 21217 ■Corynebacterium glutamicum A.T.C.G. 13287 Arthrobacter simplex A«T.0.C. 15799 Micrococcus sodonensis A.T.C.C. 11880 Pseudomonas fluorescent A.T.C.C. 21256 Bacillus subtilis A.T.C.C. 15512 Nocardia globerula A.T.C.C. 21022 Streptomyces ambofaciens A.T.C.C. 15154 Penicillium chrysogenum A.T.C.C. 15241 Aspergillus terreus A.T.C.C. 1012 Aspergillusflavus A.T.C.C. 13698 Gibberella fujikuroi A.T.C.C. 20136 Rhizopus delemar A.T.C.C, 20134 Mucor ^avonicus A.T.C.C. 15242 Saccharomyces cerevisiae A.T.C.C. 15248 Saccharomyces lactis A.T.C.C. 12425 Torulopsis spliaerica A.T.C.C. 8549Zygosaccharomyces major (Synonym Saccharomyces rouxii) A.T.C.C. 15249Kloeckera africana A.T.C.C. 16512 Candida guilliermondii A.T.C.C. 9058.109108/2211
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