DE2037988A1

DE2037988A1 - Verfahren zur Herstellung von Cytidin 5 diphospho chohn und seiner Salze

Info

Publication number: DE2037988A1
Application number: DE19702037988
Authority: DE
Inventors: Kryoshi Sagamihara Kana gawa Hagmo Hiroshi Tokio Nakayama, (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-08-04
Filing date: 1970-07-30
Publication date: 1971-02-18
Also published as: CA934312A; FR2060327B1; FR2060327A1; ES382365A1; DE2037988C3; US3684652A; JPS4841555B1; DE2037988B2; GB1300798A

Description

¹¹ Verfahren zur Herstellung von Cytidin-S'-diphospho-cholin und seiner Salze "

Priorität: 4. August 1969, Japan, Ir. 60999/69

Bekanntlich ist Cytidin-S'-diphospho-eholin (CDP-Öholin) ein Coenzym des Pettstoffwachsels. Es wird nicht nur für die Biosynthese des Lecithins benötigt, sondern es spielt auch beim Aufbau von Plasmalogen in Leber und Gehirn eine Rolle. Der bei Kopfverletzungen beobachtete erniedrigte Phospholipidgehalt und erniedrigte Ascorbinsäuregehalt wird durch intracarotiale Injektion von CDP-Cholin normalisiert. Diese Verbindung weist die folgende Strukturformel auf:

109808/22S1

N5i_s

II

O .0

|__oji

5 _/

Cytidin/dipliospho-Gholin kann a.B_e aus Hefe (Science, Band 124

(1956), Seite 81) oder synthetisch (Journal of Biological - Chemistry, Band 222 (1956),, Seiten 185 - 191? Chem_opharmac. BuIl₀ (Tokyo) 10 (1962), S. 231? Japan Patent 6540/640* zitiert nach CA. 61 (I964)s 13406) gewonnen v/erdenο- Die Herstellung von CDB-Cholisa im GraBmaßstab "bereitet jedoch Schwierigkeiten, da die bekannten Yerfahren zu seiner Herstellung nur geringe Ausbeuten ergeben und deshalb zu unerwünscht hohen Herstellungskosten führen. Aus diesem Grunde hat CDP^Cholin trotz seines unbestrittenen. Wertes in-der Praxis nur geringe Bedeutung,,. Aufgäbe der Erfindung war deshalb^ ein Yerfahren zur Herstellung von reinem GDP-Cholin zu sehaf£en_s das gute Ausbeuten ergibt,. ™ billig ist und"in industriellem Maßstab durchführbar ist· Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöste

Gegenstand, der Erfindung ist.somit ein Yerfahren zur Herstellung von Cytidin-5'-diph.osph.o--cho.lin,_ das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein wässriges Reaktionsmedium vergärt, das

a) Cholin und/oder Phosphoryleholin,

b) Cytidin₉ C3rtidin-5^s™monophosphat (im Folgenden, als "CIiP" bezeichnet), Cytidin™5'™diphosphat (im Folgenden als "CDP" bezeichnet) und/oder Cytidin~5⁸-triphosphat ( im Folgenden als ^t!CTP" bezeichnet)_p

c).-.Enzyme aus Hefen,Bakterien, z.B. der Ordnung Aotinomycetes, oder Pilzen, ■

d) J'hosphationen und

e) Magnesium- und/oder Hanganionen enthält, und das Cytidin-5¹-diphospho-cholin aus der Gäriaaische nach bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in ein Basensalz überführt.

Die Vergärung kann in üblichen Vorrichtungen bei Atmosphärendruck und Xormaltenperatur durchgeführt werden.

Die Ausgancsniaterialien Cytidin, CMP, CDP oder CTP sind handeis- A übliche Verbindungen und können synthetisch hergestellt werden. Ausserdem kann Cytidin oder CMP durch enzymatischen Abbau von Kibonucleinsäuren hergestellt werden CDP oder CTP können auch durch Phosphorylierung von CnY hergestellt werden. Diese Verbindunjen können entweder in freier Form oder in Form ihrer pharmakolagisch verträglichen Salze, z.B. als llatriumsalz, verwendet werden.

Cholin wird industriell hergestellt und ist im'Handel leicht erhältlich. Bs kann in Form seiner pharnakologisch verträglichen " Salze, z.B. als Chlorid, Bronid, Citrat oder Gluconat,- verwendet werden. Phosphorylcholin (Cholinphcsphat) kann durch Phosphorylierung von Cholinchlorid hergestellt v;erden und ist in Handel wie Cholin als Chlorid erhältlich. Alle virgenannten Formen können im Verfahren der Erfindung verwendet werden. Ausserdem können auch funktioneile Derivate anstelle von Cholin und Phosphorylcholin verwendet werden.

109808/2251

Die Konzentrationen von ChOUn₉ CMP₉ CDP, CTP, Cytidin oder Phosphorylcholin sind nicht besonders kritisch, abgesehen davon, dass wirksame Mengen davon erforderlich sind, d.h. Mengen, die die Herstellung der gewünschten Menge an CDP-Cholin erlauben. Im allgemeinen wird Cytidin, CMP, CDP und/oder CTP in Mengen von 1 g/Liter bis 1000 g/Liter, vorzugsweise 5 g/Liter bis 30 g/Liter, als freie Säuren eingesetzt. Die Cholin- und/oder Phosphorylcholinkonzentration beträgt vorzugsweise 0,5 g/Liter bis 50 g/Liter.

Die erforderlichen Phosphationen können in Form von anorganischen Phosphaten, z.B. KH₂PO^, K₂HPO., K₅PO., Na₂HPO₄, NaH₂PO. und Na-zPOi, zugegeben werden. Ebenso kann man auch die freie Säure, z.B. Phosphorsäure, zusetzen, die bei der Neutralisation mit einer geeigneten Base, z.B. ITaOH, KOH oder NH.OH, zur Phosphatbildung führt. In bestimmten Fällen, z.B. wenn CTP und Phosphorylcholin verwendet werden, ist es nicht notwendig, Phosphationen zuzugeben, da die erforderlichen Phosphationen vom CTP oder Phosphorylcholin geliefert werden.

Die Phosphationenkonzentration ist ebenfalls nicht besonders kritisch und kann je nach den Erfordernissen über einen weiten Bereich variiert werden. Zur Erreichung optimaler Ergebnisse wird eine Phosphationenkonzentration von 2 g/Liter bis 200 g/Liter, vorzugsweise 10 g/Liter bis 40 g/Liter, empfohlen. Die Konzentration der Magnesium- und/oder Manganionen, die vorzugsweise als anorganische Salze, z.B. Magnesiumsulfat oder Mangansulfat, zugesetzt werden, liegt vorzugsweise im Bereich von 0,001 g/Liter bis 3 g/Liter. Wird das Enzym oder Enzymsystem nicht in ge-

109808/22 51

reir^igtem Zustand zugesetzt, so kann man auf gesonderte.Zugabe von Magnesium- oder Manganionen verzichten, da diese im Enzympräparat enthalten sind.

Hefen, Bakterien und/oder Pilze werden im Verfahren der Erfindung in einer solchen Form verwendet, dass deren Enzymsysteme ^v unter den Vergärungsbedingungen leicht in das wässrige Hährmedium abgegeben .werden können. Geeignete Hefen, Bakterien oder Pilze erhält man z.B. durch Trocknen, Plasmolyse, Behandlung mit einem Lösungsmittel, wie Aceton, Extraktion, Behandlung mit einer grenzflächenaktiven Verbindung oder Ultraschallbehandlung. Vorzugsweise werden Hefen-, Bakterien- oder Pilzzellen verwendet, die bei industriellen Fermentationsprozessen als Nebenprodukte anfallen und als Acetontrockenpulver gewonnen werden. Hatürlich können auch flüssige Extrakte aus Hefen, Bakterien oder Pilzen verwendet werden, deren Zellen mechanisch, durch Ultraschall, oder durch Behandlung mit bakteriolytisch wirkenden Enzymen zerstört wurden. Beispiele für Bakterien, Pilze und Hefen, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind (J Brevibaeterium ammoniagenes JLT.C.C, 6872 Escherichia coli A.T.C.C. 21148
Serratia marcescens A.T.CC. 2123

Aerobacter aerogenes A.T.CC. 21217 .

Corynebacterium glutamincum A.T.CC 13287 Arthrobacter simplex A.T.CC 1577
Micrococcus sodonensis A.T.CC 11880
Pseudomonas fluorescens A.iP.C.C. 21256 Bacillus subtilis A.iP.CC 15512
Nocarclia globerula A.T.CC, 21022

. 1098.08/2251 . ..■■■■

Streptomyces ambofaciens A.1_a C₀C 15154 Penicillium ehrysogenusa A.T.C.C. 15241 Aspergillus terreus AcT₈CC 1012

Aspergillus flaws A. T₈C₀C₀ 13698

Gibberella fujlkuroi A.T.C.C. 20136

Bhizopus delemar A.T.C.C. 20134

Mucor javanicus A.T.C.C. 15242

Sacoharomyoes eerevisiae A₀T₀C₀C₀ 15248 Saccliaromyces lactis A₀T₀C₀C₀ 12425

Torulopsis sphaerica A₀S₀CC₀ 8549

Zygosacch&romyces major (Synonym Saccharomyees rouxii) A.T.CC 15249

Kloeokera afrieaaa A₀T₀C₀C₀ 16512

Candida guillieraondii A₀T₀CoC₀ 9058

Bei einer beirorsugten Burcliftilirungsform dea Terfahrens der Erfindung wird aas wässrige Seaktionemedium mit einem oder mehreren verwertbaren Zuckern, E₀B₀ GlueosSj, Fructose_B Saccharose oder Maltose, versetzt. Dadurch wird die Herstellmig eon CDP-Cholin .in grössereil Ausbeuten ermöglichte Der verwertbare Zucker wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 5 g/Liter "bis 100 g/Liter dem wässrigen Heaktionsmedium zugesetzt«

Nach der Zugab© der vorgenannten Bestandteile zum Keaktionsmedium wird der p_CT-Wert mit einer Säure oder lauge; auf 5,0 - 9,0, vorzugsweise ?_s0 - 7» 2, eingestellt _o Die Vergärung kann bei llor-' maltemperatur oter bei massig erhöhten Temperaturen,- Z₀B,' 20 bis 55 C, durchgeführt werden, Ms sieh eine wesentliche Menge von CDP-Cholin gebildet hat_o Di© Vergärungsze-it hängt γοη der Yer--

gärungstemperatur und dem p„-Wert^: ab, beträgt aber im allgemeinen etwa 0,5 bis 10 Stunden. Die Bildung von CDP-Chοlin kann durch Dünnschichtchronatographie oder durch andere geeignete Analysenverfahren verfolgt werden. '

Nach der Beendigung der Vergärung werden die Bakterien, lilze oder Peststoffe aus der Gärmaische entfernt, und das CDP-Cholin wird nithilfe eines Ionenaustauscherharzes in bekannter Weise abgetrennt und gewonnen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

30 ml eines Reaktionsraediums vom p„-Wert 7,0 enthielten 7,38 Ec/ml des Dinatriumsalzes von CMP, 24 mg/ral Cholin, 10 mß/ml Glucose, 100 ntg/ml acetongetrocknete Zellen von Brevibacterium amraoniagenes A.T.C.C. 6872, .11,6 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 2,96 mg/ml Magnesiumsulfat (MgSO/.? H₂O). Dieses Gemisch befand sich in ■ einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben und wurde 4 Stunden bei

ο
30 C inkubiert. In der Gärmaische bildeten sich 3,8 mg/ml CDP-Cholin.

Aus der entstandenen Gärmaische wurden die Feststoffe abfiltriert. 1,2 Liter des Piltrats wurden mit 0,5 η KOH-Lösung auf den powert 8,5 eingestellt. Das Pil trat wurde an einer Säule, die mit dem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x2 (Ameisensäure-Form) beschickt war, chromatographiert. liach dem Waschen des Harzes mit Yiasser wurde die Säule mit einem Ameisensäure-Gradienten eluiert, wobei die Ameisensäurekonzentration

V098O8/2251

bis 0,04- η anstieg. Die mithilfe dieses Gradienten eluierte CDP-Cholin enthaltende Fraktion wurde mit Aktivkohle behandelt. Dann wurde mit Aceton eluiert. Das Eluat wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 1,3 g CDP-Cholin als weisses Pulver.

Beispiel. 2

Beispiel 1 wurde ohne Glucosezusatz wiederholt. Man erhielt nur 0,3 mg/ml CDP-Cholin. Züchtete man in einem Reaktionsmedium, das ausserdem kein Dinatriumsalz von CMP und kein Cholin enthielt, so konnte keine Bildung von CDP-Cholin festgestellt werden (weniger als 0,05 mg/ml).

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass anstelle des Dinatriumsalze"s von CIIP 4 mg/ml Cytidin verwendet wurden. Man erhielt 0,5 bis 0,6 mg/ml CDP-Cholin.

Beispiele 4 bis 19

Beispiel 1 wurde wiederholt, aber anstelle der Zellkörper von Brevibacterium ammoniagenes wurden Zellkörper der in Tabelle I angeführten Mikroorganismen verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

109808/2251

3?abelle I

Beispiel

Stamm

4 Escherichia coli A.T.C.C. 21148

5 Serratia marceseens A.T.CC. 21213

6 Aerobaeter aerogenes A.T.C.C. 21217

7 Corynebacterium glmtamicuia A.T.C.C. 13287

8 Arthrobacter simplex A.T.CC. 15799

9 Micrococeus sodonensis A.T.G.C. 11880

10 Pseudomonas fluorescens A.f.C.C. 21256

11 Bacillus subtilis A.Ο?. C. C. 15512

12 Nocardia globerula A,3?,(J.C_# 21022

13 Stremtomyces ambofaciens A.T.C.O. 15154

14 Penicillium chrysogenum A.T.G.G. 15241

15 Aspergillus terreus A.T.G.G. 1012

16 , Aspergillus flavus A.T.G.G. 13698

17 Gibberella fujikuroi A.T.G.C, 20136

18 Rhizopus delemar A.T.G.C* 20134

19 Mucor javanicus A.a?.C,G· 15242

Menge an gebildetem CDP-Cholin (mg/ml)

2,5 0,7 0,6 0,9

0,7 0,5 0,7 0,6 0,8 0,8

0,9 0,6

0,5 1,2

0,5 0,5

B e i a ρ i e 1 20

Beispiel 1 wurde wiederholt, aber anstelle des Dinatriumsalzes von CMP wurden 8,1 mg/ml CDP verwendet. Man erhielt 4,1 mg/ml CDP-Cholin.

- Beispiel 21

Beispiel 1 wurde wiederholt, aber anstelle des Dinatriumsalzes von CMP wurden 9,7 rag/ml CTP verwendet· Man erhielt 4,1 mg/ml CDP-Cholin.

109808/2251

Beispiele 22 bis 37

Es bildeten sich fast gleiche Mengen an CDP-Cholin wie in den Beispielen 4 bis 19 mit den dort beschriebenen Stämmen, wenn die Züchtung in 5 ml Reaktionsmedium in einem Reagenzglas unter Schütteln auf ähnliche Weise, wie in den Beispielen 4 bis 19 beschrieben, durchgeführt wurde, wobei aber anstelle von CMP 8,1 mg/ml CDP oder 9_f7 mg/ml GTP verwendet wurden.

B e i s ρ i e 1 38

In einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben befanden sich 30 ml eines Reaktionsmediums vom Pg-Wert 7,C Es enthielt 8,1 mg/ml CDP_f 24 mg/ml Cholin, 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml getrocknete Bäckerhefe, 11,6 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 2,96 mg/ml MgSO^.2 H₂O. Man züchtete 4 Stunden bei 30⁰C. In der Gärmaische bildeten sich 4,2 mg/ml CDP-Cholin.

Die Feststoffe wurden von der Gärmaische abfiltriert. 1,2 Liter Filtrat wurden mit 0,5 η KOH-lÖsung auf den p_H~Wert 8,5 eingestellt. Das Filtrat wurde an einer mit dem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x2 (Ameisensäure-Form) beschickten Säule chromatographiert. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser wurde die Säule mit einem Ameisensäure-Gradienten bis zu einer maximalen Ameisensäurekonzentration von 0,04 η eluiert. Die mithilfe dieses Gradienten eluierte, CDP-Cholin enthaltende Fraktion wurde gesammelt und zur Absorption des CDP-Cholins mit Aktivkohle versetzt. Dann wurde mit Aceton eluiert und das Eluat wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 1,8 g CDP-Cholin als Pulver. .

109808/2251

Beispiel 39

Beispiel 38 wurde ohne Glucosezusatz wiederholt. Man erhielt nur 0,4 mg/ml CDP-Cholin. Wurde die Züchtung in einem Mährmedium durchgeführt, das ausserdem kein CDP und kein Cholin enthielt, konnte koine .Bildung von CDP-Cholin festgestellt werden (weniger als 0,05 rag/ml).

B e i s ρ i e 1 40

Beispiel 38 wurde wiederholt, aber anstelle von CUP wurden 9,7 mg/ml CTP verwendet. Kan erhielt 4,3 rag/ml CDP-Cholin.

Beispiele 41 bis 46

Beispiel 38 wurde wiederholt, aber anstelle der getrockneten Bäckerhefe wurden acetongetrocknete Zellkörper der in Tabelle II aufgeführten HikrοOrganismen verwendet. Man erhielt folgende Ergebnisse:

Tabelle II

Beisüiel Nr*

41 42 43 44

45 46

Stamm

Sacchar^myees cerevisiae A. T.C. C. 15248 Saccharorayces lactis A.T.C.G. 12425 Torulopsis sphaerica A.T.C.C. 8549

Zygosaccharcmyces major (Synonym Saccharomvces rouxii) A.T.C.Cr 15249

Kloeckera africana A.T.C.C. 16512 Candida guilliermondii A.T.C.C. 9058

Menge an gebildetem CDP-Cholin (cir/ml)

3,7 2,3 2,8 2,1

1,2 1,1

Beispiele 47 bis 52

Die Beispiele 41 bis 46 wurden wiederholt, aber anstelle von CDP wurden 9,7 mg/ml CTP verwendet. Man erhielt folgende Ergeb-

109808/2251

nisse:

Beispiel Kr.

47 48 49 50

51 52

Tabelle III Stamm

Saccharomyces cerevisiae A.T..C.C. 15248 Saccharomycee lactis A.T.C.C. 12425 Torulopsis sphaerica A.T.C.C. 8549 Zygosaccharomyces major A.T.C.G, 15249 (Synonym Saccharomyces rouxii)

Kloeckera africana A.T.C.C. 16512 Candida guilliermondii A.T.C.C. 9058

Menge an gebildetem CDP-Cholin (mg/ml)

3,6 3,3 3,1 1,7

1,2 1,3

Beispiel 53

In einem 250 ml .fassenden Erlenraeyerkolben befanden sich 30 ml eines flüssigen Reaktionsgemisches vom p„-V/ert 7,0. Es enthielt 7,38 mg/ml des Dinatriunsalzes von CIiP, 24 mg/ml Cholin, 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml getrocknete Bäckerhefe, 11/6 mg/ml Kaliuindihydrogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 2,96 mg/ml KgSO₄.2 H₂O. Man züchtete 4 Stunden bei 3O⁰C. In der Gärmaische entstanden 4,0 mg/ml CDP-Cholin.

Die in der Gärmaische enthaltenen Peststoffe wurden abfiltriert. Der Pjj-Wert von 1,2 Liter der Gärmaische wurde mit 0,5 η KOH-Lösung auf 8,5 eingestellt. Das Piltrat wurde an einer mit dem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x2 (Ameisensäure-Form) beschickten Säule chromatographyert. Nach dem Waschen des Harzes mit V/asser wurde mit einem Ameisensäure-Gradienten eluiert, wobei die Ameisönsäurekonzentration bis maximal 0,04 η anstieg. Die mithilfe des Gradienten eluierte, CDP-Cholin enthaltende Fraktion wurde gesammelt und zur Absorption des CDP-Cholins

109808/2251

mit Aktivkohle versetzt. Da*:n wurde mit Aceton eluiert und das Eluat wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 1,8 g- CDP-Cholin als Pulver.

Beispiel 54

Beispiel 53 wurde ohne Glueosezusatz wiederholt. Man erhielt nur 0,4 mg/ml CDP-Cholin. Wurden bei der Züchtung ausserdem CMP und Cholin weggelassen, so konnte keine Bildung con CDP-Cholin festgestellt werden (weniger als 0,05 mg/ml).

Beispiele 55 "bis 60

Beispiel 53 wurde wiederholt, anstelle der getrockneten Bäckerhefe wurden jedoch die'in Tabelle IY aufgeführten Mikroorganismen verwendet. Man erhielt folgende Ergebnisse:

Beispiel

Ir.

57 58,

Tabelle Stamm

Saccharomyces cerevisiae A.T.C.C. 15248 Saccharomyces lactis A.T.C.C. 12425 Torulopsis sphaerica A.T.C.C. 8549 Zygosaccharomyces major A.T.C.C. 15249 (Synonym. Saccharomyces rouxii) Kloeckera africana A.T.C.c. 16512 Candida guilliermondii A.T.C.C. 9058

Menge an gebildetem CDP-Cholin (mg/ml)

3,6 2,2 2,8 2,1

1,3

Beispiel 61

Ein 250 ml fassender Erlenmeyerkolben enthielt 30 ml eines Reaktionsmediums vom PjT-Wert 7,0. Es enthielt 7»38 mg/ml des Dinatriumsalzes von CMP, 72,4 mg/ml Phosphorylcholin, 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml getrocknete Bäckerhefe, 11,6 mg/ml Kaliumdihy-

109808/2251

und drogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat/ 2,96 mg/ml

MgSO/.2 H₂O. Man züchtete 4 Stunden "bei 30 G. In der Gäraaische entstanden 3,8 mg/ml CDP-Cholin.

Die in der Gärmaische enthaltenen Feststoffe wurden abfiltriert, und der p_H-Wert von 1,2 Liter des PiItrats wurde mit 0,5 η KOH-Lösung auf 8,5 eingestellt» Das Filtrat wurde an einer mit dein stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x2 (Ameisensäure-Form) beschickten Säule chromatographiert, Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser wurde mit einem Ameisensäure-Gradienten eluiert, wobei die Ameisensäurekonzentration bis maximal 0,04 η anstieg. Die mit diesem Gradienten eluie^te CDP-Cholin enthaltende Fraktion wurde gesammelt und zur Adsorption des CDP-Cholins mit Aktivkohle versetzt» Dann wurde mit Aceton eluiert. Das Eluat wurde eingedampft und getrocknet,, Man erhielt 1,7 g CDP-Cholin als Pulver.

ORIGINAL Mit

109808/22S1

Claims

. ... - 15 -.■.■■■■.... Patent a na prü ehe

»1.. Verfahren zur Herstellung von Cytidin-5'-diphospho-cholin, d a d u r c h g e k e η η ζ e i c h η e t, dass man ein wässriges Heakti onsiaedium vergärt, das

a) Cholan und/oder Phosphorylcholin,

b) Cytidin, Cytidin-5'-monophosphat, Cytidin-5'-diphosphat und/ oder Cytidin-5'-triphosphat,

c) linzyne aus Hefen, Bakterien oder Pilzen,

d) Phosphationen und ·

e).Magnesium- und/oder Hancanionen enthält, und das Cytidin-5¹-diphospho-cholin aus der Gärmaische nach bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in ein Basensalz überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenwart mindestens eines verwertbaren Zuckers durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,

dass nan die Vergärung bei Temperaturen von etwa 20 bis 55 C Λ durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass n:an die Vergärung bei einem Pjj-'rfert des wässrigen Real:- tionsnedius von etwa 5,0 bis 9,C durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenwart von a) Cholin und

b) Cytidin-5'-monophosphat durchführt.

109806/2251
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4_S dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenwart von a) Cholin und b) Cytid'in durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenv/art von a) Cholin. und

b) Cytidin-5'-diphosphat durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung in Gegenwart von a) Cholin und

b) Cytidin-5'-triphosphat durchführt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Phosphationen in Form eines Gemisches aus Kaliumdihydrogenphosphat und Dikaliumhydrogenphοsphat zusetzt»
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man e) Magnesiumsulfat verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als verwertbaren Zucker Glucose verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch .1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cytidin-5'-diphospho-cholin durch Chromatographie des Piltrats der wässrigen Gärmaische an einer mit einem Ionenäustauscherharz beschickten Säule durchführt.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vergärung mit Hilfe mindestens eines der folgenden Mikroorganismen durchführt:

1098 08/2251

ν , ■·.-.■ - 17 - ^: ■ ■■■'■ ' -

Brevibacterium ammoniagenes A.T,C.C. 6872

Escherichia coli A.T.C.C. 21148 · ·

Serratia maicescens A. T.C,C. 2123

Aerobacter aerogenes A.T.C.C. 21217 ■

Corynebacterium glutamicum A.T.C.G. 13287 Arthrobacter simplex A«T.0.C. 15799 Micrococcus sodonensis A.T.C.C. 11880 Pseudomonas fluorescent A.T.C.C. 21256 Bacillus subtilis A.T.C.C. 15512 Nocardia globerula A.T.C.C. 21022 Streptomyces ambofaciens A.T.C.C. 15154 Penicillium chrysogenum A.T.C.C. 15241 Aspergillus terreus A.T.C.C. 1012 Aspergillusflavus A.T.C.C. 13698 Gibberella fujikuroi A.T.C.C. 20136 Rhizopus delemar A.T.C.C, 20134 Mucor ^avonicus A.T.C.C. 15242 Saccharomyces cerevisiae A.T.C.C. 15248 Saccharomyces lactis A.T.C.C. 12425 Torulopsis spliaerica A.T.C.C. 8549

Zygosaccharomyces major (Synonym Saccharomyces rouxii) A.T.C.C. 15249

Kloeckera africana A.T.C.C. 16512 Candida guilliermondii A.T.C.C. 9058.

109108/2211