DE1445161A1

DE1445161A1 - Verfahren zur Abtrennung von 5'-Inosinsaeure und 5'-Guanylsaeure aus ihren Rohgemischen

Info

Publication number: DE1445161A1
Application number: DE19611445161
Authority: DE
Inventors: Yukihiko Hamuro; Komei Mizuno; Yasushi Sanno; Kuniyoshi Tanaka
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1960-08-05
Filing date: 1961-08-04
Publication date: 1969-01-23
Also published as: US3157635A; FR1303206A; GB959326A; MY6700162A; DK117708B

Description

PATENTANWÄLTE Ή45161 DR.-1NG. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES ^ _ν:^^

KÖLN 1_f DEICHMANNHAUS ^l "^

23o September 1968 Eu/bz

Takeda Ohemloal Industries, Ltd.

27. Doshomaohi 2-oho me, Higashi-ku. Osaka (Japan)

Verfahren zur Abtrennung von 5^f-Inosinsäure und 5¹-Guanylsäure aus ihren Hohgemisehen

Die Erfindung "bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung eines Gemisches von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure aus ihren Eohgemisehen mit anderen Nucleotiden, Nucleosiden, Proteinen und/oder anderen Verunreinigungen, die z. B. als unerwünschte Begleiter "bei der Herstellung dieser 5'-Nucleotide anfallen können. Das neue Trennverfahren arbeitet mit "bestimmten Ionenaustauschharzen und unter Einhaltung "bestimmter Verfahr ens "be dingungen·

Trennverfahren unter Verwendung von Ionenaus tauschharzen weisen gewöhnlioh den großen Vorteil auf, daß sie gegen Störwirkungen anderer Verunreinigungen wenig anfällig sind, in vorher "bestimmbarer Weise quantitativ und reproduzierbar verlaufen und eine Trennung zu chemisch reinen Bestandteilen ermöglichen· Wenn es unmöglich oder schwierig ist, die exakte Trennung in nur einer Verfahrensstufe zu erreichen, dann können die zunächst gewonnenen Fraktionen wiederholt der gleichen oder einer anderen Trennbehandlung unterworfen werden.

Zur Trennung und Aufarbeitung von Nucleotiden unter Verwendung von Ionenaustauschharzen sind in der Regel stark tasisoh· Anionenaustausohharze verwendet worden. Hierbei

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geht die Affinität der Nucleotide zu den Ionenaustauschern hauptsächlich auf die starke Bindung zurück, die zwischen den stark "basischen Gruppen des Austausohharzes und dem !Phosphor säure anteil der Nucleotide auftreten kann. Die Elution von Nucleotiden aus ihrer Bindung mit Harzen von diesem Typ erfordert eine große Lösungsmittelmenge und eine erhebliche Zeit. Der Unterschied in der Affinität verschiedener Nucleotide zu einem gegebenen Ionenaustauscher ist dabei weiterhin sehr gering. Man muß daher viele Arten von Lösungsmitteln unterschiedlicher Acidität oder Ionenstärke verwenden, um die Nucleotide einzeln abtrennen zu können»

Man hat zur Aufarbeitung eines Nucleotide und Nucleoside enthaltenden Gemisches auch schon die Verwendung von Kationenaustauschharzen vorgeschlagen. Hierbei soll nach den Angaben des Standes der Technik im pH-Bereich von 3 bis 4 gearbeitet werden,, Die durch das Ionenaustauschharz adsorbierten Bestandteile sollen dann mit organische Lösungsmittel enthaltenden !Flüssigkeiten eluiert werden. MaH. weiß heute, daß diese Verwendung von Kationen austauschenden Harzen und das Arbeiten im sauren pH-Bereich von 3 bis 4 nicht etwa dazu führt, daß die Nucleotide ionisch an die freien Säurengruppen des Ionenaustauschharzes gebunden werden. Die Nucleotide bilden vielmehr stark saure amphotere Ionen mit iso— elektrischen Punkten im pH-Wert-Bereich von 1,5 bis 2,5· Erst beim Unterschreiten dieses Bereiches kann tatsächlich eine ionische Absorption des Nucleotids erfolgen, ^er Anlaß für die Bindung von Nucleotiden im schwächer sauren pH-Bereich von 3 bis 4 an Kationenaustauschharze können nur zwischenmolekulare Bindungskräfte sein.

Von der Anmelderin durchgeführte Untersuchungen haben nun ergeben, daß es durchaus möglich ist, Nucleotide enthaltende Stoffgemische in einem so stark sauren pH-Bereich aufzuarbeiten, daß tatsächlich das Nucleotidmolekül einer ausreichenden ionischen Dissoziation unterliegt und in dieser ϊοκα von den freien Säuregruppen des Kationen austauschenden Harzes adsorbiert wird. Es war dabei überraschend, daß

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das doch recht IaMIe Molekülgerüst der Nucleotidstruktur derart etark saure pH-Bereiche ohne durchgreifende Strukturveränderungen übersteht. Die Untersuchungen der Anmelderin haben weiterhin gezeigt, daß gerade diese form der ionischen Nuoleotiddissoziation hervorragend für ein Trennverfahren mit Hilfe von Ionenaustauschharzen geeignet ist und dabei bessere Ergebnisse liefert als die bisher bekannten Buoleotid-Trennverfahren mit Hilfe von Ionenaustauschern

Die nucleotide werden in der Regel durch den Abbau von Nucleinsäuren erhalten. Die dabei anfallenden Komponenten die nucleotide und Fremdstoffe - zeigen eine unterschiedliche Affinität zu einem gegebenen SulfoÄsäure-Kationenaustauschharz in freier Form, so daß es möglich ist, unter Ausnutzung dieser unterschie/dlichen Affinitäten die Nucleotide zo. isolieren und aufzuarbeiten· Es wurde darüber hinaus festgestellt, daß Nucleotide auch in neutralen Medien, die gewisse anorganische Salze enthalten, mehr oder weniger stark an einem stark sauren SuIfossäure-Kationenaustauschharz adsorbiert werden können,, Es wird noch gezeigt werden, daß es sich hierbei um eine Variation des Arbeitens unmittelbar im stark sauren Bereich handelt.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Abtrennung eines Gemisches von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure aus ihren Eohgemisohen mit anderen Nucleotiden, fluoleosiden, Proteinen und/oder anderen Verunreinigungen unter Verwendung von Ionenaustauschern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Bohgemisoh als wässrige Lösung bei einem pH-Wert unter 2 durch eine Austauscherkolonne führt, die ein Sulfosäurekationenaustauschharz in freier Form wenigstens in einer solchen Menge enthält, daß seine Ionenaustauschkapazität etwa der 10-faöhen äquivalenten Menge der in der Lösung enthaltenen ionischen Verbindungen entspricht, hierbei das Gemisch von 5'-Inosinsäure und 5¹-Guanylsäure an dem Austauschharz absorbiert und anschließend das absorbierte Gemisch dieser Verbindungen mit Wasser ierfc.

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Als Sulfosäure-Kationenaustausehharze können im Verfahren gemäß der Erfindung sulfonierte Phenolharze, sulfonierte Polystyrolharze oder andere Harze verwendet werden. Weder die Teilchengröße noch der Vernetzungsgrad noch das Ionenaust ausohvermögen spielen eine ausschlaggebende Rolle· Beispielsweise können mit Vorteil die folgenden Harze für den genannten Zweck verwendet werdent

Amberlite IR-120 (Eohm & Haas Co*, Ine*, Philadelphia, Pa₀), Döwex 50 (Dow Chemical Coo, Inc·, Midland, CaIe, USA) und Biaison SE^/1 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan).

Diese Ionenaustauschharze können beispielsweise nach den in "Ion Exchange Resins" von Robert Kunin (Wiley & Sons, Inc., New York), So 82 bis 85 und den dort genannten Literatursteilen beschriebenen Verfahren hergestellt werden«, Der Vernetzungsgrad des Harzes kann zwar beliebig sein, jedoch enthält das Harz vorzugsweise 8-12 öew.-fS eines Vernetzungsmittels, z. Be Divinylbenzolo

Neben der geschilderten Bindung zwischen den nucleotiden in anionisoher Dissoziation und den freien Sulfosäuregruppen des Kationenaustauschharzes kann in .Anbetracht des relativ hohen Molekulargewichts der Nucleotide auch die Möglichkeit einer gewissen intermolekularen Adsorption angenommen werden. Die Affinität der Nucleotide zu den Sulfosäure-Austauschhar- zen ist unterschiedlich und sehr gering· Das erfindungsgemäße Verfahren weist daher den großen Vorteil auf, daß weniger unterschiedliche lösungsmittel und vergleichsweise geringe Lösungsmittelmengen für die Elution der adsorbierten Verbindungen erforderlich sind»

Als nucleotidhaltiges Material kann im erfindungsgemäßen Verfahren z. B· die Lösung eines Gemisches von 5'-Nucleotiden eingesetzt werden, die beispielsweise durch Hydrolyse von Hibonucleinsäure aus lebenden Geweben mit Kulturen gewisser Mikroorganismen oder Enzymsystemen erhalten worden sind, die

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nucleinsäuren zu 5'-Nucleotiden sowie 5 '-Adenylsäuredearainase zu hydrolysieren vermögen. Solche Enzymsysteme können beispielsweise aus Schlangenserum oder aus den Schleimhäuten des Dünndarms oder Mikroorganismenkulturen - z. B, solchen, die zu den Actinömyoeten, Bazillen» Fungi usw₀ gehören - gewonnen werden· Es kann auch ein ähnliches Material eingesetzt werden, "bei dem 5'-Adenylsäure durch Diazotierung in 5'-I_nosinsaure umgewandelt worden ist«

Das Verfahren eignet sich zur Abtrennung eines Gemisches von 5^f-In⁰sinsäure und 5'-Guanylsäure in reiner Porm. Es ermöglicht die Entfernung der verschiedenen Nucleoside, Proteine, Polysaccharide und anderer Verunreinigungen, die aus lebenden Geweben stammen, sowie des Mycels und von Enzymen sowie der anderen Nucleotide aus der Lösung»

Die als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte 5'-Nucleotide enthaltende Lösung hat vorzugsweise einen pH-Wert von 1 bis 2, wobei pH-Werte unter 1,5 besonders bevorzugt sein können,·

Viele der genannten Ausgangsgemisohe, die für die Zwecke der Erfindung verfügbar und brauchbar sind, enthalten anorganische Salze in ziejtinlioh hoher Konzentration, wodurch sie auf vergleichsweise hohe pH-Bereiche gepuffert sein können· Man kann den pH-Wert solcher Lösungen durch Dekationisierung, die z· B· durch Senkung der Konzentration der anorganischen Salze durch Verdünnung vorgenommen werden kann, auf die gewünschten Werte eingestellt werden· Es ist auoh möglich, duroh den Zusatz von bestimmten anorganischen Salzen zu der Lösung in der Behandlungsstufe mit dem KationenaustauBOhharz in den gewünschten pH-Wert-Bereioh zu kommen· Als anorganische Salze eignen sich für diesen Zweck solohe starker Säuren, die in Wasser leicht löslich sind, z. B. die Halogenide von Alkali- und Alkalierdmetallen sowie Ammoniumhalogenide und andere ähnliche Verbindungen, ferner schwefelsäure Alkali- und/oder Ammoniumsalze und dergl.

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Die vorteilhafte Auswirkung dieser Salze geht dabei auf mehrere Ursachen zurück» Beim Zontakt der Lösung mit dem Kationenaustauschharz in freier Form werden durch Ionenaustausch aus den Salzen die entsprechenden Säuren gebildet« Diese Säuren senken zunächst den pH-Wert in den gewünschten Bereich unter 2» Zum anderen unterdrücken sie die Neigung des Phosphorsäureanteils der Nucleotide zur Dissoziation» Insgesamt vergrößern sie den unterschied in der Absorbier-"barkeit swieohen den einzelnen Nucleotiden. Es kann erfindungßgeeäl jedoch zweckmäßig sein, die zu verarbeitende Lösung z· B„ durch Verdünnung oder durch Elektrodialyse unter Verwendung einer IonenaustauschmemTDran teilweise zu entsalzen· Die Anwesenheit von anorganischen Salzen in übermäßig großen Mengen kann nämlioh zu einer zwangsweisen Desorption der vorher absorbierten Nucleotide duroh die duroh Ionenaustausch gebildeten Säuren füehren«

Es kann erfindungsgemäß weiterhin zweckmäßig sein, die ein Gemisch von Nucleotiden enthaltende Lösung auf geeignete Weise zu dekationisieren, bevor sie mit dem Sulfosäure-Kationenaustausoher in Berührung gebracht wird. Dies kann unter anderem dadurch geschehen, daß man die wässrige, ein Gemisch der Abbauprodukte von Nucleinsäuren enthaltende Lösung mit einem Enzymsystem, das Nucleinsäure und Adenylsäuredeaminase abzubauen vermag, durch eine Säule eines stark sauren Sulfonsäureharzes in freier Form laufen läßt» Hierbei werden zunächst die Kationen, die außer den Nucleotiden vorhanden sind, am Ionenaustauschharz absorbiert» Solange das Harz in ausreichend kleiner Menge verwendet wird, werden noch keine Nucleotide absorbiert. Diese treten vielmehr im Kolonnenabfluß aus der Säule wieder aus» Bei Verwendung größerer Harzmengen könnte ein gewisser Anteil der Nucleotide zusammen mit den anderen Kationen absorbiert werden. Erfindungsgemäß soll daher die für diesen Zweck der vorherigen Dekationisierung eingesetzte Harzmenge so gewählt werden, daß sie gerade zur Absorption der Jremdkationen ausreichte

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Mit einer solchen vorgeschalteten Dekationisierung kann darm in der ans anließ end en Trennung mit der geringsten möglichen Harzmenge die größte Wirkung erssielt werden. Die Dekationisierung kann auoh auf andere Weise vorgenommen werden, "beispielsweise durch Verwendung von Aktivkohle oder lonenauetausohmembranen oder durch Anwendung der Fällungemetho de·

Gelegentlich haben wässrige Lösungen, die Gemische der Abbauprodukte von Nucleinsäuren durch Enzymsysteme enthalten, eine ziemlich hohe Salzkonzentration· Sie dekationisierte Lösung besitzt dann gewöhnlich schon einen ausreichend sauren pH-Wert. In Fällen, in denen der pH-Wert des dekationisierten Systems noch nicht ausreicht, also z. B* Über 1,5 liegt, ist es zweckmäßig, durch Zusatz einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure oder eine andere starke Säure, eine Senkung des pH-Wertes auf 1,5 oder weniger zu bewirken, bevor die Lösung zur Adsorption mit dem stark sauren SuI f ο säur e-Kat ionenaustauschharz in Berührung gebracht wird· Solche pH-Werte unter 1,5 werden bevorzugt, weil hier mit Sicherheit praktisch alle gewünschten Uuoleotide adsorbiert werden·

Wenn eine wässrige Lösung gemäß der Erfindung behandelt wirβ, die ein Gemisch der Nuoleinsäureabbauprodukte aus dem Abbau alt den geschilderten Enzymsystemen enthält, dann wird der größte feil der Uridylsäure nicht adsorbiert, sondern tritt mit der ablaufenden flüssigkeit aus. Sie Uridylsäure wird also wirkungsvoll von den anderen Nucleotiden, die vom Harz adsorbiert werden, getrennt» Eine gewisse Inosinsäuremenge kann in der ablaufenden Flüssigkeit erscheinen, insbesondere wenn die Harzmenge zur vollständigen Adsorption der Inosinsäure nicht ausreichend gewählt ist«

Sie Bedingungen, unter denen man die die Nucleotide enthaltende Lösung.und das Kationenaustauschharz zusammenführt, d. h. die Menge des Harzes, bezogen auf die der

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nucleotide, der Verdünnungsgrad der die nucleotide enthaltenden Lösung, die Salzkonzentration und der pH-Wert der Lösung sowie die Berührungszeit (Durchflußmenge) stehen sämtlich in Wechserbeziehung zueinander, so daß der Zweck, zu dem die Lösung mit dem Harz "behandelt wird, die Arten der im Ausgangsmaterial enthaltenen Nucleotide, der erforderliche Reinheitsgrad und andere Faktoren "bei der Wahl der optimalen Bedingungen zu "berücksichtigen sind· Die gleichen Erwägungen gelten auch, wenn die durch das Ionenaustauschharz adsorbierten nucleotide zu eluieren sind.

Die Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung zur Abtrennung eines Gemisches von 5 *-In⁰sinsäure und S'-Guanylsäure aus einem Material, das 5·-nucleotide enthält, ist technisch sehr vorteilhaft, denn im Gegensatz zu andern 5'-nucleotiden weisen 5'-In^osiIi^sä.ure ¹²³¹O 5'-Guanylsäure gewisse Eigenschaften auf, die den Geschmack "bzw* das Aroma von nahrungsmitteln verbessern. Der Würzeffekt ist stärker, wenn die genannten Säuren gemeinsam verwendet werden, als wenn eine von ihnen allein gebraucht wird« Es ist daher technisch gesehen vorteilhafter und zweckmäßiger, in einem Arbeitsgang aus dem Material, das die Mischung von 5'-nucleotiden enthält, eine Mischung herzustellen, die nur 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure enthält*

Im Verfahren gemäß der Erfindung gehen 5 *-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure gemeinsam in das Eluat über«, Sie können damit von den anderen 5'-nucleotiden, die keine oder nur sehr schwache, geschmaoksver"bessernde Eigenschaften aufweisen, und von den Verunreinigungen abgetrennt werden.

Dieses Verfahren kann zwar mehr oder weniger in der gleichen Weise wie die Herstellung der Säuren in getrennten Operationen durchgeführt werden, jedoch muß die Wahl der Bedingungen, unter denen die Lösung, die das nucleotidgemisch enthält, mit der freien Ion eines stark sauren Sulfosäure-Kationenaustauschharzes behandelt wird, mit einer gewissen

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Sorgfalt erfolgen. Wichtig ist "beispielsweise die Harzmenge, "bezogen auf die Hucleotidmenge, und die Berührungszeit "bzw. Durohflußmenge. Bei einer Durchflußmenge von 1 1 Bösung/l Harz/Std. reicht seihst die doppelte Harzmenge, die zur Adsorption einer äquivalenten Menge der in der Hucleotidlösung enthaltenen ionischen Substanzen genügt, zur vollständigen Adsorption der nucleotide nicht aus, und viele nucleotide gehen in den Abfluß über,, Ebenso gehen bei der drei- bis vierfachen äquivalenten Harzmenge die gesamte 5»-tJridylsäure und die Hälfte der 5'-Inosinsäure in den Abfluß über. Bei der 5-fachen äquivalenten Harzmenge treten die gesamte 5'-üridylsäure und ein Drittel der 5^f-Inosinsäure aus, während bei der 10-fachen äquivalenten Harzmenge nur die 5'-Uridylsäure austritt und fast die gesamte 5'-Inosinsäure am Harz bleibt. Man läßt also die Lösung zunächst durch eine Säule in der freien Form eines stark sauren sulfonierten Kationenaustauschharzes fließen, dessen Austauschvermögen etwacfer 10-fachen äquivalenten Menge der in der Lösung enthaltenen austauschbaren ionischen Substanzen entspricht, und führt dann eine Elution mit Wasser durch. Hierduroh ist es möglioh, im Eluat eine gemischte Fraktion zu gewinnen, die 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure enthält, und auf diese Weise das Gemisch von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure herzustellen·

Das in den folgenden Beispielen verwendete perlförmige Kationenaustauschharz auf der Basis von sulfonierten! Polystyrol hatte in jedem Fall eine !Teilchengröße von 0,45 bis 0,60 mm, ein ungefähres lonenaustausohvermögen von 1,9 Milliäquivalent pro car und einen Vernetzungsgrad, der einem Gehalt von 8-12 Gew.-ji Vernetzungsmittel entspricht»

Es können jedöoh auch andere sulfonierte Polystyrol-Kationenaustausohharze und sulfonierte phenolische Kationenaustauschharze für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden·

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht.

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Beispiel 1

2,5 1 einer wässrigen lösung, die durch Ätfbau einer aus Hefe extrahierten Ritxmueleinsäure mit einer Enzymlösung aus einer Kultur eines Actinomyceten-Mikroorganismenstammes und 5'-Adenylsäuredeaminase hergestellt worden ist, wird in einer ersten Yerfahrensstufe der Dekationisierung unterwor~ fen· Diese wässrige Lösung enthält da"bei 684 /Ug/ml an 5^f-lnosinsäure, 526 /ug/ml an 5'-Guanylsäure, 519 /Ug/ml an 5'-0ytidylsäure, 544 /ug/ml an 5'-Uridylsäure sowie 0,1 η Natriumchlorid· Die Dekationisierung wird durchgeführt, indem die Lösung durch eine Säule geleitet wird, die mit 0,25 1 eines sulfonierten Polystyrolkationenaustauschharzes in freier Form gefüllt ist. Die Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit "beträgt dat>ei 1 l/Harz/Stunde. Die Ionenaustauschkapazität des eingesetzten Harzes ist dahei den austauschbaren ionischen Substanzen äquivalent, die in der eingesetzten Menge der wässrigen Flüssigkeit enthalten sinde. Die aus der Säule austretende !Flüssigkeit enthält alle nucleotide, Jedoch keine Kationen, anorganischer Salze«

Die so vorlaehandelte Lösung wird dann durch Zusatz von Mineralsäure, beispielsweise Ohiorwasserstoffsäure, auf einen pH-Wert von 1,5 eingestellt und dann durch eine Säule geleitet, die 1,25 1 eines sulfonierten Polystyrolkationenaustauschharzes in freier Form enthält» Die Fließ geschwindigkeit der Flüssigkeit "beträgt 1 l/Harz/stunde« Anschließend wird die Kolonne "bei gleicher Fließ geschwindigkeit mit Wasser eluiert, wo "bei 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure mit dem Bluat eines pH-Bereichs von 1,5 Ms 4,0 ausgetragen werden. Aus den Bluaten wird ein Gemisch von 850 mg Natrium-5' -ino.stsat und 830 mg Uatrium-5'-guanylat in konventioneller Weise erhalten.

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Beispiel 2

In diesem Beispiel wird zur Dekationisierung von anorganischen Salzen, die in der Ausgangslösung des Uucleotidgemieches enthalten sind, anstelle des sulfonierten PoIystyrol-Eationenaustauschharzes Aktivkohle eingesetzt. Bs werden 1,5 1 der in Beispiel 1 "beschriebenen Ausgangslösung der Kuoleotide auf den pH-Wert von 1,5 eingestellt» Dann wird die so vorbehandelte Lösung durch eine Säule geleitet, die mit 50 g Aktivkohle gefüllt ist_e Die Aktivkohle wird dann mit Wasser gewaschen, die eluierten Kationen werden entfernt β ,

Wenn im wässrigen Eluat keine Nationen mehr festgestellt werden können, werden die nucleotide mit ammoniakalischen wässrigem Äthanol eluiert. Das anfallende Eluat wird unter vermindertem Druck aufkonzentrierte Auf diese Weise kann eine dekationisierte Lösung eines Gemisches von Nucleotiden erhalten werden.

Die dekationisierte Lösung wird dann gemäß den Angaben des Beispiels 1 mit 2,5 1 eines Kationenaustauschharzes auf der Basis von sulfoniert em Polystyrol behandelt, wobei die Ionenaustauschkapazität des Harzes in der eingesetzten Menge dem 10-faohen der äquivalenten Menge an ionischen Substanzen in der behandelten Lösung entspricht. Die Ausbeute besteht aus einem Gemisch von 9SO mg Jiatrium-5'-inosinat und 850 mg Katrium-5'-guanylat.

Beispiel 3

2,5 1 einer Lösung eines ffucleotidgemisches der Zusammensetzung gemäß Beispiel 1 werden durch eine Kolonne geführt, die 1,25 1 eines Kationenaustauschharzes auf der Basis von sulfoniertem Polystyrol enthält· Die Eließgesohwindigkeit der Slüssigkeit beträgt 1 l/Harz/Stunde. Die Kolonne wird dann mit Wasser eluiert. Hierbei werden 5'-Inosinsäure und 5'-Gruanylsäure ausgewaschen. Aus dem Eluat wird durch konventionelle Behandlung ein Gemisch von 900 mg Natrium~5'-inosi:aäfc und 85° mg ffatrium-ö'-guanylat erhalten«

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In den vorstehenden Beispielen wurde das die 5'-Nucleotide enthaltende Gemisch hergestellt, indem man einen wässrigen Hefeextrakt mit einer Flüssigkeit umsetzte, die ein Enzym« system von Mikroorganismen enthielt, das fähig war, Ribonucleinsäure zu 5'-Nucleotiden zu hydrolysieren. Als Enzymlösung wurde das Kulturfiltrat der nachstehend genannten Mikroorganismen verwendet.

Zur Herstellung des in den Beispielen 1, 2 und 3 verwendeten 5^!-Nucleotidgemisches diente Streptomyces aureus (hinterlegt bei der American Type Culture Collection unter der Kennziffer ATCC 134o4). Dieser Stamm kann 5'-Adenylsäuredeaminase gleichzeitig mit einem Enzymsystem erzeugen, der Nucleinsäure in 5'-Nucleotide zu hydrolysieren vermag, Natürlich können auch andere Mikroorganismen für den Zweck verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie das gewünschte Enzym-

system bilden können. Beispielsweise sind die nachstehend aufgeführten Mikroorganismen für den genannten Zweck geeignet:

η Streptomyces griseus (Krainsky emend, Waksman et al) Waksman et al, IPO 3430 ATCC-10157J

Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici Waksman¹s Stamm;

α Streptomyces purpurescens Lindenbein IFO-3389, NRRL-1454; α Streptomyces coelicolor (Müller) Waksman et Henrici IFO 3807, ATCC 13405;

κ Helminthrosporium sigmoideum var. irreguläre Cralley et Tullis IFO 5273, ATCC 13406;

Bacillus brevis Migula emend. Ford ATCC 8185; Bacillus subtilis Cohn emend. Prazmowski IFO 3032, ATCC

Anixiella reticulispora Saito et Minoura IFO 5483, ATCC

χ + Aspergillus elegans Qasperini IFO 4286, ATCO 13829; + Aspergillus flavipes (Bainier et Sartory) Thorn et Church IFO 4052, ATCC 1383Ο;

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+ Aspergillus fischeri Nehmer IFO 5866, ATCC 13831; + Aspergillus melleus Yukawa IFO 4339, ATCC 13832; + Aspergillus Nidurans (Eidam) Winter IFO 5713, ATCC 13833; st Botryosphaeria ribis chromogena G. et D. IFO 4837, ATCC 13834;

χ Chaetomidium japonicum Saito et Okazaki IFO 4451, ATCC 13935;

κ + Glomerella cingulata (Stomem.) Spauld. et v. Sehr. IFO 5907, ATCC 13836;

χ Neuröspora crassa Shear et Dodge IFO 6067, ATCC 13837; Neurospora sitophila Shear et Dodge IFO 6069, ATCC 13838; χ Ophiobolus miyabeanus Ito et Kuribayashi IFO 4870, ATCC

χ Ophiostoma ulmi (Buisman) Nannf. IFO 6128, ATCC 13840; χ Sordaria fimicola (Rab.) Cesari et de Notaris IFO 4846, ATCC 13841;

χ Tilsohlidium humioola Cudemans IFO 5696, ATCC 13842.

Die Nummern hinter den Namen der vorstehenden Mikroorganismen stellen die Kennziffern der Stämme im Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO), im Northern Utilization Research Branch of Ü.S.Department of Agriculture, Peoria, III., U.S.A. (NRRL) bzw. in der American Type Culture Collection, Washington, D.C, U.S.A. (ATCC) dar.

Die mit einem Stern versehenen Mikroorganismen erzeugen Phosphate zusammen mit dem Enzymsystem, das Ribonucleinsäure in 5'-Nucleotide abzubauen vermag. Bei Verwendung dieser Mikroorganismen wird daher vorzugsweise ein Phosphatase-Inhibitor zugesetzt, wenn der Hefeextrakt hydrolysiert wird. Bei Verwendung von Natriumarsenat als Inhibitor beträgt dessen Konzentration im Reaktionsgemisch etwa 6 χ 10"^ Mol/l. Von den aufgeführten Mikroorganismen erzeugen die mit einem "+~ versehenen 5*-Adenylsäuredeaminase gleichzeitig mit dem En« zymsystem, das Nucleinsäure zu 5^f-Nucleotiden zu hydrolysieren vermag. Das durch Verwendung dieser Mikroorganismen erhaltene Hydrolysat enthält 5^f-Inosinsäure neben 5'-Guanylsäure usw.

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Claims

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Patent ansprüohe

■ 1) iverfahren zur Abtrennung eines Gemisches von 5'-!nosings, /säure und 5'-Guanylsäure aus ihren Rohgemischen mit an-

deren nucleotiden, Uucleosiden, Proteinen und/oder anderen Verunreinigungen unter Verwendung von Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, daß man das Rohgemisch als wässrige Lösung "bei einem pH-Wert unter 2 durch eine Austauscherkolonne führt, die ein ^ulfosäurekationenaustauschharz in freier Form wenigstens in einer solchen Menge enthält, daß seine Ionenaustauschkapazitat etwa der 10-fachen äquivalenten Menge der in der Lösung enthaltenen ionischen Verbindungen entspricht, hierbei das Gemisch von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure an dem Austauschharz adsorbiert und anschließend das absorbierte Gemisch dieser Verbindungen mit Wasser eluiert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu trennende Rohgemisoh vor der Absorption der 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure von sonstigen Kationen "befreit wird, und zwar insbesondere durch Behandlung mit einem Ionenaustauschharz in solcher Menge, daß die 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure noch nicht am Harz adsorbiert werden.,
3) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Absorption der 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure bei einem pH-Wert von 1-2 durchgeführt wird.

4·) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 31 dadurch gekennzeichnet, daß als Rohgemisch ein nucleotidhaltiges Hydrolysat eingesetzt wird, das durch Umwandlung von nucleinsäuren mit Enzymsystemen erhalten worden ist, die Nucleinsäure abbauen und 5'-Adenylsäure in 5*-Inosinsäure umwandeln.

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Neue Unterlagen (Art. 7 § l Abs. 2 Nr. l Satz 3 des Änderungsges. v. 4. S-1'