CN108752405B - 一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法 - Google Patents
一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108752405B CN108752405B CN201810468217.3A CN201810468217A CN108752405B CN 108752405 B CN108752405 B CN 108752405B CN 201810468217 A CN201810468217 A CN 201810468217A CN 108752405 B CN108752405 B CN 108752405B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- resin
- nucleotide
- exchange resin
- column
- nucleotides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 100
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 79
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 79
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims abstract description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 15
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 17
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 10
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 10
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- AEOBEOJCBAYXBA-UHFFFAOYSA-N A2P5P Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1OP(O)(O)=O AEOBEOJCBAYXBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N cytidine monophosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 6
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 abstract description 6
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 9
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 8
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 8
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 6
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000001612 separation test Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710149004 Nuclease P1 Proteins 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 235000021125 infant nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- -1 vitamin nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法，其特点是采用批式交换吸附速率从多种同类阴离子交换树脂中选择交换分离效果好的树脂，用于阳离子和阴离子交换树脂组合的层析分离，然后采用NaCl水溶液，在中性或偏碱性条件下（pH=7～10）进行梯度洗脱，获得四种单一核苷酸。本发明与现有技术相比具有较好分离效果，吸附核苷酸能力强，树脂分离收率可达92.5%，并可省去炭柱富集的方法，直接浓缩甚至不浓缩便可结晶，大幅降低成本，易于实现工业规模化生产四种高浓度的单一核苷酸，成本低廉，节能减排，符合绿色制造环保理念。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种用于大规模工业化的离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法。
背景技术
近年来在婴儿营养强化剂和基因工程等特殊领域，高纯度天然的5’-核苷酸需求量越来越大，由核糖核酸(RNA)生物酶水解的5’-核苷酸因其生物来源，没有化学合成的α异物体等无可替代的优点，越来越受到人们的青睐。上世纪六十年代，5’-核苷酸主要用于助鲜剂，RNA酶解液分离主要为获得5’-鸟苷酸和5’-腺苷酸等嘌呤核苷酸，并将5’-腺苷酸转化为5’-肌苷酸。对于4种核苷酸分离大都是实验室或小规模生产为主。
用核酸酶P1或5’-磷酸二酯酶酶解RNA，可以生产5’-胞苷酸(5’-CMP)、5’-腺苷酸(5’-AMP)、5’-尿苷酸(5’-UMP)、5’-鸟苷酸(5’-GMP)等4种5’-核苷酸。其中，除5’-UMP外，5’-CMP、5’-AMP、5’-GMP都是两性电解质，磷酸基带负电荷，含氮环带正电荷，等电点(PI)在1.5-2.6之间，在pH小于等电点时，核苷酸带正电荷，能用阳离子交换树脂分离纯化，在中性或偏碱性时，核苷酸都带负电荷，其PI值越大，它与阴离子交换能力越弱，在洗脱时越容易被洗脱下来，按其所带电荷大小，洗脱顺序应该是CMP、AMP、GMP、UMP。但是树脂不溶性基质是非极性的，它对嘌呤碱基的亲和力要大于嘧啶碱基，所以实际的洗脱顺序是CMP、AMP、UMP、GMP。4种核苷酸在阴离子交换树脂固定相与流动相之间分配得以互相分离，故而称为阴离子交换树脂层析分离，其中少量核苷类副产物由于不带负电荷，不吸附在树脂上。交换吸附于柱上核苷酸上用梯度洗脱或分段洗脱方法可将4种核苷酸分离纯化。
文献1(核苷酸类物质的生产和应用，科学出版社，1971年6月)和文献2(中国专利公开号CN1884523A)等使用阳离子分离核苷酸的方法，其缺点是核苷酸必须小于或等于pH1.5-2.6才带较弱正电荷，由于其交换吸附能力较弱，故而分离时树脂用量较大，另外在H型阳离子环境中，嘌呤类核苷酸较易分解而影响收率。
文献3(E，查加夫.J.N.达维生主编核酸)、文献4(生化实验方法和技术)和文献5(中国专利ZL02136839.2)都公开了一种阴离子交换树脂分离核苷酸方法，文献3、4由于洗脱体积太大，分离时间较长而只适合实验室制备，文献5采用阴离子交换树脂与活性炭吸附组合方法，使核苷酸通过炭柱富集等，而使该方法能应用于工业化生产。文献2、4、5都是上样后使用低浓度的盐酸或甲酸、乙酸等在酸性条件下洗脱，此时5’-GMP在偏酸性环境下会形成凝胶，凝胶一旦形成后，就会影响分离效果，并且在一般再生树脂条件下，树脂很难恢复原来的交换能力，从而影响下一批料液分离。在长期使用文献5方法过程中，发现了上样量偏低、用水量大、洗脱液核苷酸含量低、需炭柱富集等不足。
由于四种核苷酸都由碱基、磷酸和核糖组成，仅依靠碱基含氮环电荷的不同将四种核苷酸分离成高纯度单核苷酸是比较困难的，因此对于树脂的内表面积、内部孔径和树脂颗粒分布均匀度等有着较高的要求。一般树脂的筛选是在烧杯或三颈瓶中加入再生处理过的树脂，然后加入待分离核苷酸(酶解液)溶液，搅拌或振荡2小时后检测其吸附核苷酸量，这样的方法对于分离要求很高的核苷酸等溶液并不适用，加上测定误差很难区分优劣。对于阴离子交换树脂同一或不同厂家有许多牌号，适用于核苷酸分离的交联度在×6、×7、×8左右，交联度6、7、8一般是指加入交联剂如二乙烯苯的量(％)，它与树脂孔径密切相关，但是由于厂家制作工艺的差距或用途不同，其内在孔径的均匀度是不同的，因此决定核苷酸交换量和分离效率的孔径大小和内表面积会有较大差异。另外，大规模工业生产一般树脂都选用50-60目左右的颗粒大小，不同牌号树脂其颗粒大小分布度和均匀度也不同。至今对于树脂内部孔径大小和内表面积尚无一种好的测量方法，交联度也只能表示其大致的范围，对于前述影响树脂分离效果的各种因素作一综合评价甚是困难。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法，采用批式交换吸附速率从多种同类阴离子交换树脂中选择一种交换吸附能力强，分离效果更好的阴离子交换树脂，经阳离子和阴离子交换树脂组合的层析分离后用5％NaCl和水，梯度洗脱获得高纯度四种单一核苷酸，洗脱后的5’-CMP浓度可达20g/L；5’-AMP、5’-UMP浓度可达50g/L；5’-GMP浓度70g/L左右，不经炭柱富集就可直接浓缩后结晶，甚至不浓缩便可结晶，大幅降低成本，方法简便，分离效率高，易于实现工业规模化生产四种高浓度的单一核苷酸，分离平均收率也有大幅提高，成本低廉，节能减排，符合绿色制造环保理念。
本发明的目的是这样实现的：一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法，其特点是采用批式交换吸附速率从多种同类阴离子交换树脂中选择交换分离效果好的树脂，用于阳离子和阴离子交换树脂组合的层析分离，然后采用5％NaCl和水组成的洗脱液，在中性或偏碱性条件下(pH＝7～10)进行梯度洗脱，获得四种单一核苷酸，其组合层析分离核苷酸的具体步骤如下：
a、树脂吸附效率的测定
将不同牌号树脂以等量分别放置在相同量的RNA酶解液中，搅拌或振荡后分别测定10、20和30分钟各树脂吸附核苷酸的速率，以区别不同牌号树脂的交换能力，选出核苷酸吸附率高的树脂。
b、柱层析组合分离
将上述核苷酸吸附率高的树脂作为阴离子交换树脂与强酸性阳离子交换树脂进行柱层析的组合分离5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP和5’-GMP四种核苷酸，所述柱层析的组合分离由强酸性阳离子交换树脂柱后串接两根阴离子交换树脂柱组成。
c、梯度洗脱
采用质量浓度为5％的NaCl和水组成的中性或偏碱性(pH＝7～10)洗脱液对两根串联的阴离子交换柱进行梯度洗脱，分别获得5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP和5’-GMP 4种核苷酸溶液，浓缩结晶后可获得相应的核苷酸结晶物，所述梯度洗脱由梯度洗脱仪和分部收集器组成的装置，对两根阴离子交换柱吸附的核苷酸进行梯度洗脱和收集。
所述梯度洗脱仪由盐水罐、去离子水罐和磁力搅拌器组成。
本发明与现有技术相比具有较好分离效果，吸附核苷酸能力强，树脂分离收率可达92.5％，并可省去炭柱富集直接浓缩，甚至不浓缩便可结晶，大幅降低成本，方法简便，分离效率高，易于实现工业规模化生产四种高纯度的单一核苷酸，分离平均收率也有大幅提高，成本低廉，节能减排，符合绿色制造环保理念。
附图说明
图1为本发明的柱层析组合分离流程图；
图2为本发明的梯度洗脱流程图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案对本发明作进一步描述。
实施例1：
a、树脂吸附效率的测定
将核糖核酸(RNA)按文献《酶制剂工业》的方法用核酸酶P1或磷酸二酯酶获得酶解液1500ml，其核苷酸浓度为33g/L，其中CMP含6.387g/L，AMP含量为8.2605g/L，GMPNa2含量为10.5285g/L，UMPNa2含量为8.0835g/L。
使用日本三菱公司提供的JP203、SA11A、U120、U100、UMA150、PA312和PA316型号树脂，将其与目前使用的201×7树脂一起进行试验，所有树脂按常规再生方法处理，在150ml树脂中加入200ml酶解液，其核苷酸浓度为33g/L，测定被树脂吸附后溶液中核苷酸的浓度(g/L)见下表1：
表1各型号树脂吸附30、60和120分钟后溶液中核苷酸的浓度(g/L)
由上表1可知，在树脂加入酶解液30分钟后，JP203已交换吸附90％核苷酸，SA11A、U120、U100和UMA150树脂交换吸附约为80％核苷酸，而PA312、PA316、201×7树脂只交换吸附约为70％核苷酸；60分钟后JP203树脂的吸附已基本达到平衡，SA11A、U120和UMA150树脂也已接近87％核苷酸；120分钟后SA11A和U120树脂接近JP203树脂的吸附水平。
按上述同样方法，将JP203、UMA150和201×7三种阴离子树脂交换吸附10分钟，其溶液中的核苷酸含量见下表2：
表2各型号树脂吸附10分钟后溶液中的核苷酸含量
由表2可知，10分钟后JP203树脂可吸附82％核苷酸，UMA150树脂可吸附65％核苷酸，201×7树脂可吸附67％核苷酸。
从表1和表2的测试数据可以看出，表1更能区分各种型号树脂的吸附能力，故而以30分钟吸附交换核苷酸速率最快的JP203树脂为最佳，其次是SA11A、U120、U100和UMA150树脂，再其次是PA312、PA316和201×7树脂。通过上述各型号树脂的吸附能力测试，可知按照常规方法2小时后多数树脂都能达到几乎相同能力，因此很难区分树脂优劣。通过测定离子交换树脂交换吸附速率，即可从同类型树脂(如强碱性阴离子树脂)筛选出吸附和分离能力较好的树脂。对于核苷酸来说，交联度为6、7、8的树脂都能用来分离。对于生产厂商根据不同用途和工艺条件，同类型树脂会有许多不同型号，例如：日本三菱公司的强碱性阴离子交换树脂就有SA11A、U120、UMA150、PA312、PA316等许多型号，再加上外国的Amberlite、Dowex，国内的等等，采用一般固定床上柱分离筛选树脂方法，需要极大的工作量，在实际工作中很难实施。本发明根据批式吸附速率，即10～30分钟吸附核苷酸量的多少便能筛选出树脂与上样量和分离效果好的树脂。
b、组合离子交换树脂固定床的柱层析分离
参阅附图1，本发明采用的串联洗脱装置由阳离子交换柱1和两根阴离子交换柱2串联组成，所述阳离子交换柱1填装100ml呈Na型的001×8阳离子交换树脂，其尺寸为￠15×600mm；所述阴离子交换柱2分别填装200ml呈Cl型或OH型的JP203、U120、SA11A和201×7树脂，其尺寸为￠26×600mm。将RNA酶解液通过1#、2#和3#柱组成的串联装置上样，上样流速为400ml/h，其中：1#柱为阳离子交换柱1，2#柱和3#柱为分别填装JP203、U120、SA11A和201×7树脂的阴离子交换柱2，待2#柱将饱和，有核苷酸将要流出时再连3#柱，效果更佳。实验中填装JP203树脂的两阴离子交换柱2，其上样量为1500ml酶解液，各吸附核苷酸约为50g；填装SA11A和U120树脂的两阴离子交换柱2，其上样量为1300ml酶解液，各吸附核苷酸约为43g；填装201×7树脂的两阴离子交换柱2，其上样量为985ml酶解液，各吸附核苷酸约为33g。
以上实验进一步证明，吸附速率最高的为JP203树脂，其固定床吸附核苷酸能力最强，其结果JP203树脂上样量为201×7的1.5倍，即效率提高50％，适合大规模工业生产，以上各型号树脂选用50～60目左右，树脂越细，颗粒越小，分离效果会越好，但是装柱高度只能很低，而且柱压高，流速慢，不适宜规模化生产。
本发明通过柱层析的组合分离，即一根阳柱和两根阴柱的组合，使RNA酶解获得的AMP、GMP、CMP和UMP四种性质相近核苷酸的有效分离。阳柱主要去除二价阳离子，及其它一些带正电荷的蛋白、色素或不溶性沉淀物质，保护阴柱并使其交换效率提高，阴柱的作用是交换吸附和层析分离核苷酸，核苷酸主要吸附在第一根阴柱，上样结束后只有少量CMP吸附在第二根阴柱。
c、梯度洗脱
参阅附图2，使用JP203树脂组成阴离子交换柱的层析分离，将酶解核苷酸溶液(浓度32g/L)通过固定床，其流速400ml/h，上样完毕后用1200ml去离子水顶洗柱，然后断开阳离子交换柱1(1#柱)，采用分部收集器3与梯度洗脱仪5组成的梯度洗脱装置，以及质量浓度为5％的NaCl和水组成的洗脱液，对两根串联的阴离子交换柱2(2#、3#柱)吸附的核苷酸进行洗脱并收集，根据其所带负电荷大小及其它吸附因素，可将四种核苷酸依次洗脱下来，所以第二根阴离子交换柱2(3#柱)是为了加强分离效果而设置，其优点是上样时，约有一半以上的酶解溶液可通过第一根阴离子交换柱2(2#柱)流出，待有少量CMP流出时，再连接第二根阴离子交换柱2(3#柱)，这样可免除2#柱流出液污染，使3#柱分离效力更高。另一方面在采用分段洗脱时，洗完CMP、AMP、UMP后，GMP可从2#柱上直接洗脱，这样可以缩短工时，并获得更高浓度的GMP洗脱溶液，所以这种排列组合的柱层析分离是十分必要的最佳组合。
所述梯度洗脱仪5由盐水罐4、去离子水罐6和磁力搅拌器7组成，用1000ml去离子水和1000m的质量浓度为5％的NaCl水溶液，对于串联的2#和3#柱进行分段的梯度洗脱，其流速为40ml/h，洗脱液由分部收集器3收集，约50小时洗脱完毕，所收集的核苷酸量和浓度见下表3所示：
表3 JP203树脂进行核苷酸的柱层析分离试验结果
对比例1
同上述实施方法，使用UBA120树脂进行核苷酸的柱层析分离试验，其收集的核苷酸量和浓度见下表4所示：
表4 UBA120树脂进行核苷酸的柱层析分离试验结果
对比例2
同上述实施方法，使用SA11A树脂进行核苷酸的柱层析分离试验，其收集的核苷酸量和浓度见下表5所示：
表5 SA11A树脂进行核苷酸的柱层析分离试验结果
其中，5’-AMP和5’-UMP未分开。
比对比例3
同上述实施方法，使用201×7树脂进行核苷酸的柱层析分离试验，其收集的核苷酸量和浓度见下表6所示：
表6 201×7树脂进行核苷酸的柱层析分离试验结果
其中，5’-AMP和5’-UMP未分开。
目前，用阴柱分离核苷酸时，洗脱都是在酸性(PH≈3)条件下进行，其原因在此条件下除UMP外，其它核苷酸所带负电荷较小，故而容易洗脱下来，如背景技术中文献3、4、5所公开的技术内容。研究发现阴柱上样后PH从中性或偏碱性一侧，逐步向酸性改变过程中，GMP(PH＝4～5)会形成凝胶状物质而使阴柱失去交换层析能力。故而只有在树脂装置较多，或上样量较少情况下，上述影响较小。现有技术因为阴柱洗脱体积太大，获得核苷酸溶液浓度太低而不能规模化工业使用。文献5用炭柱富集而弥补了上述缺陷，但其用水量仍然很大。本发明使用中性或偏碱性梯度洗脱的方法，阴柱从上样、水洗和洗脱都是在中性和偏碱性环境下，GMP就不会形成凝胶，这样就可获得极好分离效果，并获得高浓度的洗脱溶液，节水、节能、减排，符合绿色制造环保理念。
以上只是对本发明做进一步说明，并非用以限制本专利，凡为本发明等效实施，均应包含于本专利的权利要求范围之内。
Claims (2)
1.一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法，其特征在于具体步骤如下：
a、树脂吸附效率的测定
将不同型号阴离子交换树脂以等量分别放置在相同量的RNA酶解液中，搅拌或振荡后分别测定10、20和30分钟各树脂吸附核苷酸的速率，以区别不同树脂的交换能力，选出核苷酸吸附率高的树脂；
b、柱层析组合分离
将强酸性阳离子交换树脂与上述核苷酸吸附率高的阴离子交换树脂进行柱层析的组合分离5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP和5’-GMP四种核苷酸，所述柱层析的组合分离由强酸性阳离子交换树脂柱后串接两根阴离子交换树脂柱组成；所述强酸性阳离子交换树脂柱填装呈Na型的001×8阳离子交换树脂；所述两根阴离子交换树脂柱为JP203树脂；
c、梯度洗脱
将酶解核苷酸溶液通过固定床，其流速400ml/h，上样完毕后用去离子水顶洗柱，然后断开阳离子交换柱，采用分部收集器与梯度洗脱仪组成的梯度洗脱装置，以及质量浓度为5%的NaCl和水组成的洗脱液，在中性或偏碱性条件下，对两根串联的阴离子交换柱吸附的核苷酸进行洗脱并收集，分别获得5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP和5’-GMP 4种核苷酸溶液，浓缩结晶后分别得到相应的核苷酸结晶物。
2.根据权利要求1所述离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法，其特征在于所述梯度洗脱仪由盐水罐、去离子水罐和磁力搅拌器组成。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810468217.3A CN108752405B (zh) | 2018-05-16 | 2018-05-16 | 一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810468217.3A CN108752405B (zh) | 2018-05-16 | 2018-05-16 | 一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108752405A CN108752405A (zh) | 2018-11-06 |
| CN108752405B true CN108752405B (zh) | 2021-03-23 |
Family
ID=64008219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810468217.3A Active CN108752405B (zh) | 2018-05-16 | 2018-05-16 | 一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108752405B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113831379B (zh) * | 2021-09-24 | 2023-06-30 | 上海蔚之星生物科技有限公司 | 基于智能控制的rna酶解液层析分离方法及系统 |
| CN113842671B (zh) * | 2021-09-24 | 2023-07-04 | 上海蔚之星生物科技有限公司 | 基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法及系统 |
| CN114874275B (zh) * | 2021-09-24 | 2023-08-01 | 上海蔚之星生物科技有限公司 | 脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3157635A (en) * | 1960-08-05 | 1964-11-17 | Takeda Chemical Industries Ltd | Sulfonic acid cation exchange resin purification of nucleotides |
| GB988268A (en) * | 1961-08-29 | 1965-04-07 | Schwarz Biores Inc | Improvements in the enzyme digestion of nucleic acids |
| JPS53127893A (en) * | 1977-04-13 | 1978-11-08 | Ajinomoto Co Inc | Purification of nucleotide |
| CN1286259A (zh) * | 2000-08-10 | 2001-03-07 | 华东理工大学 | 从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法 |
| CN1177859C (zh) * | 2002-09-05 | 2004-12-01 | 上海秋之友生物科技有限公司 | 用阴离子交换树脂从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法 |
| CN100497360C (zh) * | 2007-02-14 | 2009-06-10 | 北京燕京中科生物技术有限公司 | 一种从核糖核酸酶解液制备单核苷酸的方法 |
| CN103113423B (zh) * | 2013-03-15 | 2016-06-01 | 江西诚志生物工程有限公司 | 一种采用离子交换与膜分离技术从发酵液中提取d-核糖的方法 |
| US20170130254A1 (en) * | 2014-03-26 | 2017-05-11 | Nanjing University Of Technology | Nucleotide production process |
| CN106632519B (zh) * | 2016-12-12 | 2020-02-21 | 南京工业大学 | 一种采用连续离子交换色谱技术分离核苷酸的工艺 |
-
2018
- 2018-05-16 CN CN201810468217.3A patent/CN108752405B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108752405A (zh) | 2018-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108752405B (zh) | 一种离子交换树脂组合层析分离核苷酸的方法 | |
| CN1320122C (zh) | 一种从木糖母液或木糖水解液提取木糖和木糖醇的方法 | |
| CN108892699B (zh) | 一种高纯度核苷酸的精制方法 | |
| CN106632519B (zh) | 一种采用连续离子交换色谱技术分离核苷酸的工艺 | |
| Oikawa et al. | Solid‐phase extraction for metabolomic analysis of high‐salinity samples by capillary electrophoresis–mass spectrometry | |
| CN102331472A (zh) | 婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法 | |
| CN103724394B (zh) | 甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法 | |
| CN107118116B (zh) | 一种利用大孔吸附树脂分离纯化5-氨基戊酸的方法 | |
| CA1228601A (en) | Purification of l-phenylalanine | |
| Wang et al. | Chromatographic separation of cytidine triphosphate from fermentation broth of yeast using anion‐exchange cryogel | |
| CN113387987A (zh) | 一种核苷酸层析分离中5’-amp和5’-ump的回收应用 | |
| CN1177859C (zh) | 用阴离子交换树脂从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法 | |
| Xu et al. | Optimization of l‐arginine purification from Corynebacterium crenatum fermentation broth | |
| CN112079886A (zh) | 一种经色谱分离提高木糖和阿拉伯糖纯度的方法 | |
| KR890003597B1 (ko) | 글리신 및 l-세린을 함유한 용액으로부터 글리신 및 l-세린의 분리방법 | |
| CN108059603B (zh) | 伏格列波糖杂质n-甲基井岗酶醇胺的精制工艺 | |
| Wang et al. | Anion separation and preconcentration with cyclen and cyclen-resorcinarene derivatives | |
| CN102206169B (zh) | 一种赖氨酸的纯化方法 | |
| US20050176110A1 (en) | Process for chromatographic separation of nucleosides | |
| CN110330541B (zh) | 一种对5′-鸟嘌呤核苷酸和5′-胞嘧啶核苷酸的分离方法 | |
| CN1704405A (zh) | 一种分析与分离制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法 | |
| CN117907482A (zh) | 一种同时测定水体中四类蓝藻毒素的串联固相萃取-液相色谱-串联质谱检测方法 | |
| JP2002088036A (ja) | アミノ酸の回収方法 | |
| CN113336241B (zh) | 一种高能氧化剂二硝酰胺铵的分离制备的方法 | |
| CN117866038B (zh) | 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 1203, No. 992 Tongjiang Avenue, Liangxi District, Wuxi City, Jiangsu Province Patentee after: Qiuzhiyou Biotechnology (Wuxi) Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: Huanghai Road, Binhai Industrial Park, Qidong City, Nantong City, Jiangsu Province Patentee before: NANTONG QIUZHIYOU BIOSCIENCE & BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| CP03 | Change of name, title or address |