CN100497360C - 一种从核糖核酸酶解液制备单核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从核糖核酸酶解液中制备5′-核苷酸的方法,其先将核糖核酸酶解液进行预处理,然后采用离子交换分离,有序使用离子交换树脂分离纯化四种核苷酸;再将纯化后的核苷酸经由浓缩与喷雾干燥进行精制。本发明预处理后所得酶解滤液澄清度好,蛋白浓度低,对树脂污染小,而且离子交换分离的上样量高,适宜大规模生产,耗时短,收率高;同时采用浓缩-喷雾干燥工艺进行核苷酸的精制,可获得高纯度产品,耗时短,耗能低,不需要使用乙醇,安全性好,节省能源,有利于环保。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备单核苷酸的方法,具体地说,涉及一种有序使用离子交换树脂柱从核糖核酸酶解液制备单核苷酸的方法。
背景技术
5′-单核苷酸是一种重要的化工原料,可用作医药中间体,食品添加剂以及保健食品原料等方面。可用于制备多种生化原料药,如ATP、CTP、CDPc、5-FU等。
一般工业上可以从酵母提取生产核糖核酸(RNA)。RNA经酶解或碱解,然后对酶解液或碱解液分离纯化、精制,即可获得5′-AMP(5′-腺苷酸)、5′-GMP(5′-鸟苷酸)、5′-CMP(5′-胞苷酸)及5′-UMP(5′-尿苷酸)四种核苷酸。
目前已有一些文献报道了其分离制备方法,比如对于酶解液只采用板框压滤、硅藻土助滤进行预处理后进行离子交换分离,分离后得到的各核苷酸组分采用减压浓缩、乙醇沉淀、抽滤干燥进行核苷酸的精制。该工艺虽然适合工业化生产,可获得较高纯度核苷酸,但如果只采用板框压滤,过滤效果较差,滤液澄清度不够,微粒性杂质以及蛋白性质杂质未被完全截留。
还有,CN 1286259A公开了从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法。该方法通过阳阴离子交换树脂的有序排列串联组合一次分离纯化得到高纯度单核苷酸。该方法虽然能分离得到纯度较高的核苷酸,但其上样量低,树脂使用量大,分离速度慢,效率低,生产成本高。
CN1177859C公开了用阴离子交换树脂从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法,依次包括如下步骤:①将含有四种5’-核苷酸的酶解液按序流过两根强碱阴离子交换树脂柱、使4种5’-核苷酸被吸附在两根强碱阴离子交换树脂柱中;②用酸性溶液洗涤强碱阴离子交换树脂柱,洗脱液流入第一炭柱,使其中的5′-CMP吸附于第一炭柱中,然后用碱性醇溶液洗脱第一炭柱,收集洗脱液,收集5′-CMP溶液;③用较强酸性溶液洗涤强碱阴离子交换树脂柱,洗脱液流入第二炭柱,使其中的5′-AMP吸附于第二炭柱,然后用碱溶液洗脱,收集5′-AMP溶液;④用较强酸性和盐溶液洗涤强碱阴离子交换树脂柱,洗脱液流入第三炭柱,使其中的5′-UMP吸附于第三炭柱,然后用碱溶液洗脱,收集5′-UMP溶液;⑤用离子强度更强的溶液洗涤阴离子交换树脂,洗脱液流入第四炭柱,使其中的5′-GMP吸附于第四炭柱,然后用碱性溶液洗脱,收集5′-GMP溶液。该方法使用两阴柱与四炭柱配合分离四种核苷酸,该方法分离线速度慢,耗时长;采用炭柱及甲酸洗脱对设备与环境要求高,成本高且环保性,安全性较差;炭柱的醇碱法洗脱会导致洗脱分离时间长,炭柱的再生较复杂,后期精制困难。
随着临床对核酸药物需求量的增加和人们对生活品质要求的日益提高,核苷酸及其衍生物的应用愈来愈广,原有的生产方法已不能满足需要。因此,目前需要更有效的制备核苷酸的生产方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种从核糖核酸酶解液中制备5′-核苷酸的方法,该方法生产周期短,产品收得率高,操作安全简便,成本低。
为了实现本发明目的,本发明的一种从核糖核酸酶解液中制备5′-核苷酸的方法,包括如下步骤:
1)预处理:先将核糖核酸酶解液进行过滤预处理,包括粗滤与精滤,以控制不溶性杂质与蛋白含量;
2)离子交换分离纯化:将预处理后的核糖核酸酶解液经一类阳离子交换树脂柱与两类阴离子交换树脂柱联合进行分离纯化,得四种单核苷酸;
3)浓缩:将分离得到的四种单核苷酸进行浓缩、精制处理。
本发明是从核糖核酸酶解液中分离制备5′-核苷酸。
本发明在离子交换分离之前,先对核糖核酸酶解液进行粗滤和精滤,所述粗滤可采用沉降离心、板框压滤或超滤膜(UF)过滤,优选采用超滤膜(UF)过滤,所述超滤膜的截留分子量为60000~200000道尔顿。
本发明所述的精滤采用截留分子量(MWCO)6000~50000道尔顿的超滤膜,最适宜为10000道尔顿。
经过预处理后可截留降解液中的微粒性杂质以及蛋白性质杂质,使得滤液澄清度好,滤液蛋白浓度低,便于离子交换树脂的分离纯化,滤液对树脂污染小,蛋白含量小于0.03mg/ml,树脂的柱分离上样量可以达到阳离子交换树脂全交换量的4~8%。
本发明对核糖核酸酶解液进行预处理后,采用离子交换分离,有序使用阳、阴离子交换树脂柱,具体是采用一类阳离子交换树脂柱与两类阴离子交换树脂柱联合应用来分离单核苷酸。
其中,阳离子交换树脂柱为强酸型阳离子交换树脂柱,阴离子交换树脂柱为弱碱型或强碱型阴离子交换树脂柱,两种类型配合使用为佳。
预处理后,含四种单核苷酸的核糖核酸酶解液采用一强酸阳离子交换树脂柱、三强碱阴离子交换柱分离AMP、CMP和GMP;由一强酸阳离子交换树脂柱、一弱碱阴离子交换树脂柱、一强碱阴离子交换树脂柱分离UMP。
具体地说,本发明先将核糖核酸酶解液通过一阳离子交换树脂柱分离成UMP、GMP和CMP混合液、AMP三部分。这样,AMP、GMP和CMP被吸附在阳离子交换树脂柱中,UMP不被阳离子交换树脂柱所吸附,分别依次进入弱碱型阴离子树脂柱和强碱型阴离子树脂柱,酶解液中杂质被弱碱型阴离子树脂柱吸附,最后UMP被强碱型阴离子树脂柱吸附,经洗脱得UMP。
然后将吸附有AMP、GMP和CMP的阳离子交换树脂柱经过分段洗脱先用弱酸(PH值1.5~2.0)洗脱,再用去离子水洗脱,这样可分别将AMP、GMP和CMP的混合液相分离,收集含AMP的溶液调整pH值为7.0~9.0,经过强碱型阴离子树脂柱吸附,洗脱得高纯度的AMP。
将GMP和CMP混合液调整pH值为近中性,经过一强碱型阴离子树脂柱将GMP和CMP分离,GMP通过强碱型阴离子树脂柱,直接收集得GMP;CMP吸附在强碱型阴离子树脂柱上,再经洗脱并再经一强碱型阴离子树脂柱分离浓缩得高纯度的CMP。
阳离子交换树脂柱,可采用HZ001强酸型阳离子交换树脂、732阳离子交换树脂、JK008、Amberlite IR-132、001×8离子交换树脂。树脂的粒度可控制在80~150目,优选为120目。
阳离子交换树脂柱:上柱pH值1.0~2.0,上柱总量为阳离子交换树脂全交换量的4~8%,上柱线速度为1~3米/小时。
阴离子交换柱,采用弱碱型与强碱型两种类型,强碱型比如HZ201强碱型阴离子交换树脂、717阴离子交换树脂、Dowex-1、Amberlite IRA-400、201×7离子交换树脂。弱碱型比如335离子交换树脂或D301离子交换树脂等。
阴离子交换树脂柱:上柱pH值7.0~9.0,上样流速7.5~15m/h,上样总量根据不同单核苷酸种类,上样量在阴离子交换树脂全交换量的12~50%之间,比如AMP可达40~50%;CMP20~30%;UMP15~20%。
本发明最后分离四种核苷酸成分,所用的洗脱采用酸盐洗脱液(0.5~1%盐,pH1~2)进行分离浓缩,四种单核苷酸的分离总收率可达到90%以上。
所述的离子交换分离后得到的四种单核苷酸组分调pH值为6.0~7.0后采用常规方法浓缩,比如减压浓缩,核苷酸收集液浓缩到10~20%浓度的水溶液。
最后可将核苷酸浓溶液喷雾干燥一步完成精制,替代传统精制过程中醇沉干燥粉碎等过程,避免了乙醇的使用,安全性提高,成本降低,简化了生产过程,缩短了生产周期,获得高纯度的单核苷酸钠盐。
本发明所述的喷雾干燥可采用本领域常规工艺完成。
本发明所采用的从核糖核酸酶解液中制备5′-核苷酸的方法,耗时短,产率高,安全性好,可以一次性、大规模、高收率地制备高纯度的5′-单核苷酸(盐)。
本发明核糖核酸酶解液经过超滤膜预处理后,所得滤液澄清度好,耗时短,预处理时间短,一般只需要约4~8小时即可处理完成,收率可达90%以上。滤液蛋白浓度低,便于离子交换树脂的分离纯化,对树脂污染小,离子交换分离的上样量高,可提高为现有工艺的2~3倍,适宜大规模生产;选用目数适宜的树脂,上样流速快,分离纯化时间缩短为2/3~1/2。而且由于本发明改变现有技术中所采用的阳、阴离子交换树脂串联组合一次分离四种核苷酸,所造成的上柱量少的问题,采用一个阳离子交换树脂柱将核糖核酸酶解液分离为UMP、GMP和CMP混合液、AMP三部分,充分利用树脂交换能力,也大大提高了上样量。
同时本发明还采用浓缩-喷雾干燥工艺进行核苷酸的精制,获得高纯度产品的同时,耗时短,不需要使用乙醇,安全性好,可节省能源,有利于环保,生产成本低。
本发明预处理过滤收率在90%以上,离子交换分离收率90%以上,浓缩收率90%以上,喷雾干燥收率90%以上,以降解液所含核苷酸计,总的产品质量得率在70%以上。
经检测,本发明所获得的核苷酸盐成品,其紫外含量与HPLC纯度为95%以上。
附图说明
图1为本发明所述从核糖核酸酶解液中制备5′-核苷酸的工艺流程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1
将核糖核酸酶解液经过两次超滤膜设备去除固体颗粒和蛋白,过滤回收率大于90%,两次超滤膜MWCO分别为20,0000、6,000道尔顿;超滤后滤液蛋白0.005mg/ml;用6NHCl调节超滤液pH到1.5,上离子交换柱分离,其中含有核苷酸2065g,5′-AMP(2065×28%)克;5′-GMP(2065×26%)克;5′-CMP(2065×20%)克;5′-UMP(2065×26%)克。
含有四种单核苷酸的超滤液通过HZ001氢型强酸型阳离子交换树脂(阳柱Φ25cm×200装填61000ml阳树脂,树脂的粒度为120目)分离为UMP、GMP和CMP混合液、AMP三部分。
阳离子交换树脂上柱:PH1.5,上样流速1.5m/h,核苷酸上样量为阳离子树脂总交换量的6.0%;柱分离中产品的损失率:5%以内。
对比值与浓度进行鉴定:比值、浓度符合各组分要求。
这样,AMP、GMP和CMP被吸附在HZ001氢型强酸型阳离子交换树脂柱中,UMP不被阳离子交换树脂柱所吸附,分别依次进入弱碱型阴离子树脂柱(335离子交换树脂,阴柱Φ20cm×160装填23000ml弱碱树脂)和强碱型阴离子树脂柱(717阴离子交换树脂,阴柱Φ15cm×100装填7500ml强碱树脂),上样量为阴离子树脂总交换量的16.6%,酶解液中杂质被弱碱型阴离子树脂柱吸附,最后UMP被强碱型阴离子树脂柱吸附,经酸盐洗脱液(0.5% NaCl,pH2)洗脱得UMP。
然后将吸附有AMP、GMP和CMP的阳离子交换树脂柱经过分段洗脱,先用弱酸淋洗(pH 1.8HCl,洗脱流速1.5m/h),再用去离子水洗脱(洗脱流速1.5m/h),这样可分别将AMP、GMP和CMP的混合液相分离,先收集含AMP的溶液调整pH值为7.0,经过强碱型阴离子树脂柱(HZ201氯型阴柱Φ10cm×100装填2400ml阴树脂)吸附,上样流速7.5m/h,上样量为阴离子树脂总交换量的50%;再经去离子洗脱,洗脱流速0.5m/h,高盐(1%NaCl、pH1)洗脱,得高纯度的AMP。柱分离中产品的损失率:5%以内。
鉴定方法:比值与浓度,比值符合,浓度>5mg/ml,开始收集:浓度<5mg/ml停止收集。
然后将GMP和CMP混合液调整pH值为中性,经过一强碱型阴离子树脂柱(HZ201氯型阴柱Φ20cm×160装填24000ml阴树脂)将GMP和CMP分离,分离柱上样量为阴离子树脂总交换量的9.8%,GMP通过强碱型阴离子树脂柱,直接收集得GMP;CMP吸附在强碱型阴离子树脂柱上,再经洗脱并再经一强碱型阴离子树脂柱(HZ201氯型阴柱Φ15cm×100装填4500ml阴树脂)吸附,上样量为阴离子树脂总交换量的21%,酸盐洗脱液(1%NaCl,pH1)洗脱得高纯度的CMP。
收集的过柱各核苷酸组分的收集液为:5′-AMP 16.35升,含5′-AMP 600克;5′-GMP 25升,含5′-GMP 503克;5′-CMP 10升,含5′-CMP 388克;5′-UMP 25升,含5′-UMP 530克。四种单核苷酸的分离总收率为97%。
将上述收集的各部分单核苷酸溶液调节pH为7.0,浓缩到浓度达到15%,再喷雾干燥,进风150摄氏度,出风90摄氏度,即得最终核苷酸盐成品,其含量为98%。
预处理粗滤-精滤收率94%,分离总收率为97%,浓缩收率92%,喷雾干燥收率90%,以降解液所含核苷酸计,总的产品质量得率73.2%。
实施例2
将含核苷酸2080克的核糖核酸酶解液依次板框压滤-超滤膜设备去除固体颗粒和蛋白,过滤回收率大于95%,超滤膜MWCO10,000道尔顿;超滤后滤液蛋白0.02mg/ml;用12NHCl调节超滤液pH到2.0,上离子交换柱分离,其中含有核苷酸2080g,5′-AMP(2080×26.8%)克;5′-GMP(2080×28.2%)克;5′-CMP(2080×20.1%)克;5′-UMP(2080×24.6%)克。
732阳离子交换树脂柱的核苷酸上样量为树脂全交换量的6.0%,分离线速度1.75m/h。其他各浓缩柱的上样量为:Dowex-1阴柱AMP上样量为45%;GMP+CMP分离柱上样量为12%;CMP25%;UMP18%,采用酸盐洗脱液(0.5%盐,PH1)进行分离浓缩,收集的过柱各核苷酸组分的收集液为:5′-AMP 11升,含5′-AMP 547克;5′-GMP 28升,含5′-GMP 519克;5′-CMP 14升,含5′-CMP 435克;5′-UMP19升,含5′-UMP 466克。四种单核苷酸的分离总收率为94.5%。
将上述收集的各部分单核苷酸溶液调节pH为6.5,浓缩至浓度达到10%,喷雾干燥,进风170摄氏度,出风100摄氏度,即得最终核苷酸盐成品,其含量为95%。
过滤-超滤收率96%,分离总收率为94.5%,浓缩收率94%,喷雾干燥收率92%,以降解液所含核苷酸计,总的产品质量得率73.7%。
实施例3
将核糖核酸酶解液依次经过两次超滤膜设备去除固体颗粒和蛋白,过滤回收率为95%,两次超滤膜MWCO分别为100,000、10,000道尔顿;超滤后滤液蛋白0.01mg/ml;用10NHCl调节超滤液pH到1.0,上JK008阳离子交换柱分离,其中含有核苷酸2770g,5′-AMP(2770×25%)克;5′-GMP(2770×28%)克;5′-CMP(2770×18%)克;5′-UMP(2770×25%)克。
001×8离子交换树脂柱的核苷酸上样量为树脂全交换量的8.0%,分离线速度1.0m/h。其他各浓缩柱的上样量为:Amberlite IRA-400阴柱AMP上样量为40%;GMP+CMP分离柱上样量为15%;CMP30%;UMP20%,采用酸盐洗脱液(1%盐,pH2)进行分离浓缩,收集的过柱各核苷酸组分的收集液为:5′-AMP 17升,含5′-AMP 658克;5′-GMP34升,含5′-GMP 750克;5′-CMP16升,含5′-CMP468克;5′-UMP26升,含5′-UMP 644克。四种单核苷酸的分离总收率为91%。
将上述收集的各部分单核苷酸溶液调节pH为7.0,浓缩到浓度达到18%,喷雾干燥,进风160摄氏度,出风120摄氏度,即得最终核苷酸盐成品,其含量为96%。
粗滤-精滤收率95%,分离总收率为91%,浓缩收率94%,喷雾干燥收率93%,以降解液所含核苷酸计,总的产品质量得率75.6%。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (20)
1.一种从核糖核酸酶解液中制备5′-核苷酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)预处理:先将核糖核酸酶解液进行粗滤与精滤;
2)离子交换分离纯化:将预处理后的核糖核酸酶解液通过一强酸阳离子交换树脂柱、三强碱阴离子交换柱分离AMP、CMP和GMP;以及通过一强酸阳离子交换树脂柱、一弱碱阴离子交换树脂柱、一强碱阴离子交换树脂柱分离UMP,进行分离纯化,得四种单核苷酸;
3)浓缩:将分离得到的四种单核苷酸进行浓缩、精制处理。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述阳离子交换树脂柱上柱pH值1.0~2.0,上柱总量为阳树脂全交换量的4~8%,上柱线速度为1~3米/小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述阴离子交换柱的上柱pH值7.0~9.0,上柱总量为阴树脂全交换量的12~50%。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,分离AMP时,上柱总量为阴树脂全交换量的40~50%;分离CMP时,上柱总量为阴树脂全交换量的20~30%;分离UMP时,上柱总量为阴树脂全交换量的15~20%。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述粗滤为板框过滤或超滤膜过滤,所述超滤膜的截留分子量为60000~200000道尔顿。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于所述精滤采用超滤膜,超滤膜的截留分子量为6000~50000道尔顿。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述超滤膜的截留分子量为10000道尔顿。
8.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的精制采用喷雾干燥。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,分离AMP时,上柱总量为阴树脂全交换量的40~50%;分离CMP时,上柱总量为阴树脂全交换量的20~30%;分离UMP时,上柱总量为阴树脂全交换量的15~20%。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述粗滤为板框过滤或超滤膜过滤,所述超滤膜的截留分子量为60000~200000道尔顿。
11.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述精滤采用超滤膜,超滤膜的截留分子量为6000~50000道尔顿。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述超滤膜的截留分子量为10000道尔顿。
13.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的精制采用喷雾干燥。
14.根据权利要求1、2或4任意一项所述的方法,其特征在于,所述粗滤为板框过滤或超滤膜过滤,所述超滤膜的截留分子量为60000~200000道尔顿。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述精滤采用超滤膜,超滤膜的截留分子量为6000~50000道尔顿。
16.根据权利要求15所述的方法,其特征在于所述超滤膜的截留分子量为10000道尔顿。
17.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述的精制采用喷雾干燥。
18.根据权利要求1、2、4或5任意一项所述的方法,其特征在于,所述精滤采用超滤膜,超滤膜的截留分子量为6000~50000道尔顿。
19.根据权利要求12所述的方法,其特征在于所述超滤膜的截留分子量为10000道尔顿。
20.根据权利要求1、2、4、5、6或7任意一项所述的方法,其特征在于,所述的精制采用喷雾干燥。
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酵母RNA酶解液中核苷酸分离技术研究. 谢宪章等.氨基酸和生物资源,第1期. 1993 |
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