KR890003597B1 - 글리신 및 l-세린을 함유한 용액으로부터 글리신 및 l-세린의 분리방법 - Google Patents
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Description
제1 및 2도는 이온교환수지로 패킹된 컬럼에 방응용액 및 용리액을 통과시키고, 생성된 유출액을 반응 용액의 통과 개시로부터 용리액의 통과 완결시까지의 기간동안 500g씩 분화수거한 실시예 1 및 2에서 수득된 각 분획의 pH, L-세린농도 및 글리신 농도의 플로트를 나타낸 것이다.
제 3 도는 비교예에서 수득된 각 분획의 제1 및 2도와 같은 플로트를 나타낸 것이다.
본 발명은 글리신 및 L-세린을 함유한 용액으로부터 글리신 및 L-세린을 분리하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 원료로서 글리신을 사용하는 발효 또는 효소적 전환방법에 의해 형성된 L-세린의 분리 및 회수방법에 관한 것이다.
L-세린은 주입용 용액의 성분, 약제 제조용 원료 및 트립토판 등과 같은 아미노산 합성용 중간체로 유용한 화합물이다.
원료로 글리신을 사용하는 L-세린의 많은 제조방법이 공지되어 있다. 이들 방법은 예를 들면, L-세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 생산할 수 있는 미생물을 사용함으로서 조효소로 테트라히드로폴산 존재하에 글리신 및 포르말린으로부터 L-세린을 제조하는 방법(E.C. 2.1.2.1)(일본국 특허공개 제81691/1978호) 및 글리신을 L-세린으로 전환시킬 수 있는 미생물과 접촉시킴으로써 L-세린을 제조하고, 생성된 L-세린을 회수하는 L-세린의 제조방법(일본국 특허 공개 제130490/1978호)과 같은 효소전환방법 ; 미생물은 글리신-함유배지에 성장시켜 배지에 L-세린을 측적시킴으로써 L-세린을 제조하는 방법(일본국 특허공개 제31995/1983,88798/1981,37169/1980,26875/1980 및 72893/1978호) : 등이다.
그러나, 원료로 글리신을 사용하는 L-세린의 제조방법은 반응생성물로 형성된 L-세린을 반응 용액에 남아 있는 글리신으로부터 분리해야 하는 난점이 있다. 예를들어, 글리신을 L-세린 히드록시메틸트랜스퍼라제등과 같은 효소에 의해 L-세린으로 전화시키는 경우, 이 전환은 L-세린에 대한 글리신의 전환도가 항상 75%이하, 보통은 50%이하인 평형 반응을 기초로 한다. 따라서, 생성된 방응 용액은 항상 글리신 및 L-세린을 모두 함유하며, 이들을 분리하는 것은 매우 어렵다.
물에 대한 글리신의 용해도(중성 pH 및 20℃에서 22%)는 L-세린의 용해도(18%)와 매우 가깝기 때문에 이들 사이의 용해도 차이를 이용하여 반응용액으로부터 이들중 하나만을 분리하는 것은 매우 곤란하다. 이런 이유 때문에, 상술한 일본국 톡허공개 제31995/1983호에서 글리신의 m-크실렌-4-술폰산염과 L-세린의 용해도 차이를 이용한 L-세린의 분리방법이 기재되어 있다. 그러나, 이 방법은 복잡한 공정을 필요로하며, 만족스런 고수율을 제공하지 못하기 때문에 공업에 실용적인 것으로 간주될 수 없다.
한편, 강산성이온 교환수지를 사용하여 아미노산을 분리하는 많은 방법이 공지되어 있으며, 예를들면 일본국 특공개 제72893/1978에 기재되어 있다. 그러나, 이 경우 글리신의 등전점(5.97)이 L-세린의 등전점(1.68)과 매우 가깝다. 그러므로, 이온의 교환을 기초로 한 통상의 흡수 및 용출방법에 의해 이들을 분리해서 글리신을 회수하는 것은 곤란하다.
상술한 일본국 특허의 발명에 따라, 그의 등전점이 용액의 pH에 따라 다르게 변화한다는 사실을 기초로, 시트르산 등과 같은 완충액에 의해 용액의 pH를 점차 변화시키면서 강산성이온 교환 수지로 흡착 및 용출을 반복함으로써 이들을 분리하는 방법이 제안되었다. 그러나, 이 방법은 만족스럽게 분리할 수 없을 뿐 아니라 복잡한 공정을 필요로 한다. 따라서, 이 방법은 공업적인 방법으로 간주될 수 없다.
그러므로, 강산성이온 교환 수지를 사용했을 때조차도 글리신 및 L-세린을 효과적으로 분리하는 것은 불가능하다. 그런 이유로 인해, 원료로 사용된 글리신을 상당한 정도로 L-세린으로 전환시킬 수 있음에도 불구하고, L-세린을 만족스러운 고수율로 분리 및 회수할 수 없다. 더우기, 원료로 사용된 고가의 글리신의 상당부분을 낭비할 수 밖에 없다. 이러한 단점은 결구 L-세린의 생산단가를 높이고 있다.
본 발명의 목적은 글리신 및 L-세린을 함유한 용액으로부터 이들을 효과적으로 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 글리신으로부터 L-세린을 제조하기 위한 발효 또는 효소적 전환방법으로부터 수득된 용액으로부터 고수율로 L-세린을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 글리신으로부터 L-세린을 제조하기 위해 발효 또는 효소적 전환 방법으로부터 수득된 용액으로부터 글리신 및 L-세린을 효과적으로 분리하고, 분리된 글리신을 원료로 재사용하여 L-세린의 생산단가를 실제적으로 낮추는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 수행하기 위해, 본 발명자들은 광범위한 연구를 수행하였으며, 하기의 발견을 기초로 본 발명의 방법을 완성하였다.
특별하게는, 글리신 및 L-세린이 물에서의 용해도 또는 등전점에서 거의 차이점이 없지만, 글리신은 어떤 이온 교환 수지에 대한 친화성이 L-세린보다 훨씬 더 크다. 즉, 글리신 및 L-세린을 모두 함유한 용액을 특이한 입자크기 및 특이한 입자크기분포를 갖는 강산성 이온 교환 수지로 패킹된 컬럼에 크로마토그래피 전개를 유도하는 조건하에 통과시킨다면, 글리신은 수지에 의해 쉽게 보유되고, 반면 L-세린은 덜 쉽게 보유된다. 따라서, 이러한 특성을 이용함으로써 글리신 및 L-세린이 상대적으로 쉽게 분리될 수 있다.
더욱 특별하게는. 0.15∼0.40mm의 유효크기 및 1.7이하의 균일계수를 갖는 강산성 이온 교환 수지를 글리신 및 L-세린을 모두 함유한 용액의 처리에 사용하면, 크로마토그래피 전개에 의해 이들을 쉽게 분리할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 용해된 상태로 글리신 및 L-세린을 함유한 용액을 0.15∼0.40mm의 유효크기 및 1.7이하의 균일계수를 갖는 강산성 이온교환수지의 컬럼을 통해 시간당 2m이하의 선형 속도로 통과시켜 글리신은 컬럼에 남아 있게 하고 L-세린을 함유한 유출액을 수득한후, 알칼리용액을 컬럼에 접촉시켜 글리신을 함유한 용출액을 수득하는 단계를 특징으로 하는, 글리신 및 L-세린의 용액으로부터 이들을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명을 실시하는데 있어. 글리신 및 L-세린을 모두 함유한 용액을 강산성이온 교환 수지로 패킹된 컬럼에 통과시켜 컬럼의 유출액으로부터 L-세린 분획을 수득한다. 한편, 컬럼을 알칼리 용액과 접촉시킴으로써 생성된 용출액으로 글리신 분획을 수득한다. 수득된 L-세린 분획으로부터 공지의 결정화 방법에 의해 높은 질의 L-세린을 분리할 수 있다. 글리신 분획을 사용하여 필요한 방법에 의해 글리신을 분리 및 회수할 수 있다. 그러나, 본 발명을 원료로 글리신을 사용하는 L-세린의 제조에 적용하는 경우, 상기의 글리신 분획은 글리신을 L-세린으로 전환시키는 반응계에 직접 재사용 할 수 있으며, 이렇게 재사용함으로써 글리신을 L-세린으로 전환시키는 전환도를 현저히 향상시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 강산성 이온 교환수지는 0.15∼0.40mm의 유표크기 및 1.7이하의 균일계수를 갖는 양이온 교환 수지이어야 한다. 이런 강산성 양이온 교환수지는 레와티트 TSW-40 및 TSW-40-FK(바이엘사 제품), 다이아이온 FRK-01(미쓰비시가가꾸고오교가부시끼사이샤 제품)등의 상품명으로 시판되고 있다. 이 분야에서 일반적으로 정의되는 바와같이, "유효크기"는 모든 수지 입자의 10%를 통과시키고 나머지 (90%)는 통과를 막는 스크린의 메쉬크기를 의미한다. "균일계수"는 수지의 입자크기 분포의 균일성 정도를 나타내는 파라미터를 나타내며, 모두 수지입자의 60%를 통과시키고 나머지(40%)의 통과를 막는 스크린의 메쉬크기를 유효크기[즉, 모든 수지 입자의 10%를 통과시키고 나머지(90%)는 통과를 막는 스크린의 메쉬크기]로 나누어서 얻어진 값으로 정의된다. 따라서, 입자크기 분포는 균일계수가 1인 접근할수록 더 균일하다.
본 발명을 실시하는데 있어서, 0.15mm보다 작은 유효 크기를 갖는 수지를 사용하면 분리 효율을 높일 수 있으나, 공업적인 측면에서 어떤 난점을 야기시킬 수 있다. 예를들면 반응용액에 존재하는 이물질에 의한 방해로 인해 수지 베드의 압력 손실을 증가시키고, 수지(알칼리용액과 접촉된)를 H+형으로 재전환시키기 위한 산용액의 통과로 인해 수지의 물리적 내구성을 감소시키는 단점을 야기시킨다. 한편, 유표크기가 0.40mm보다 크면, 글리신과 L-세린사이의 수지에 대한 친화성 차이가 명백하지 못하므로 크로마토그래피 분리 효과가 감소하다. 마찬가지로, 균일계수가 1.7이사이면(즉, 수지가 바람직하지 못하게 넓은 입자크기 분포를 갖는다면), 본 발명의 목적은 크로마토그래피 분리 효과의 감소로 인해 성취될 수 없다.
처리될 용액에 포함된 L-세린과 글리신의 농도 및 비율에는 특별한 제한이 없다. 그러므로, 본 발명의 방법은 그의 표화 농도보다 낮은 어떤 목적하는 농도 및 어떤 목적하는 비율의 L-세린 및 글리신을 함유한 용액도 처리될 용액으로서 컬럼에 통과시킬 수 있다.
사용된 수지의 양은 처리될 용액에 존재하는 양이온의 총량(즉, L-세린, 글리신 및 오염 아미노산, 칼륨이온, 암모늄이온, 나트룸이온 등과 같이 반응 용액에 보통 존재하는 기타 양이온성 성분의 총량)이 수지의 총 교환용량의 범위이내로 되는 양이어야 한다.
수지를 컬럼에 패킹하고, 묽은 염산으로 세척함으로써 H+형으로 전환시킨다. 수지 베드의 최적 높이는 처리될 용액의 글리신 함량 및 직선 속도(L.V.)에 따른다. 그러나, 양호한 분리 효율을 얻기 위해, 수지 베드의 부피와 같은 부피 또는 더 많은 부피의 용액을 컬럼에 통과시키는 것이 바람직하다. 이런 경우, 수지베드의 높이는 1000mm이상이어야 한다. 더우기, 처리될 용액은 시간당 2미터 이하, 바람직하게는 시간당 1미터 이하의 직선 속도로 컬럼에 통과되어야 한다. 처리될 용액의 직선 속도가 2보다 크면, 크로마토그래피 분리의 목적을 위해 적당하지 않다. 더우기, 처리될 용액은 60℃이하의 온도에서 컬럼에 통과되어야 한다.
처리될 용액을 통과시킨후, 수지 베드를 시간당 2미터 이하의 직선 속도로 등 부피 이상의 물로 통과시킴으로써 세척하여, 컬럼내에 남아있는 용액을 치환한다. 상기 공정의 결과, L-세린이 풍부한 분획이 유출액으로 수득된다. 그후, 알칼리 용액을 함유한 용리액을 수지베드와 접촉시켜 컬럼내에 남아있는 글리신을 용출시켜 글리신이 풍부한 분획을 용출액으로 수득한다. 알칼리용액은수지를 알칼리형으로 전환시키는데 통상적으로 사용되는 각종의 알칼리용액으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 글리신을 L-세린으로 전환시키는 원료로서 용출액을 직접 사용한는 것이 바람직하다면, 수성암모니아를 사용하는 것이 바람직하다. 알칼리용액을 0.1∼5%의 농도를 갖는 것이 바람직하다. 그증에서, 약1%의 농도를 갖는 알칼리 용액은 용리액으로 사용하기에 특히 바람직하다.
이렇게 수득된 L-세린이 풍부한 분획으로부터, 공지의 농축 및 결정화 방법에 따라 L-세린 결정을 분리 할 수 있다. 한편, 글리신이 풍부한 분획을 글리신을 L-세린으로 전환시키기 위한 원료로서 직접 사용할 수 있다. 물론, 어떤 바람직한 수단에 의해 분획으로부터 글리신을 분리하는 것도 배제되지 않는다.
[실시예 1]
에스케리키아콜리의 배양에 의해 제조된 세린 히드록시 메틸 트랜스퍼라제 존재하에 조효소로 테트라히드로폴산 및 피리독살포스페이트를 함유한 수성매질에서 글리신 및 포르말린(포름 알데히드)를 상호 작용시켜 26.0%의 L-세린 및 6.1%의 글리신을 함유한 반응용액 571g을 수득한다. 한편, 컬럼을 1.9l의 강산성 양이온 교환수지 또는 레와티트 TSW-40FK(0.26mm의 유효크기 및 1.7의 균일계수)로 패킹하여 높이 1100mm및 직경 48mm의 수지베드(H+형)를 형성한다. 상기의 반응 용액을 열처리하여 효소를 불활성화시키고, 공간속도가 1(또는 시간당 0.8미터의 직선 속도)이 되는 속도로 컬럼의 탑에 공급한다.
반응용액의 공급 완결후, 3500ml의 탈이온수를 공간속도가 1(또는 시간당 0.8미터의 직선 속도)이 되도록 탑으로부터 컬럼에 통과시킨다. 이어서, 6000ml의 1%수성암모니아를 2의 공간속도로 컬럼에 통과시키고, 1500mL의 탈이온수를 컬럼어 통과시켜 수지 베드를 세척한다. 반응용액의 통과개시로부터, 반응 용액의 통과에 따라 유출물을 500g분획으로 수거하고, 탈이온수로 세척(분획번호 5∼11) 및 수성암모니아(분획번호 12 및 그 이후)로 용출시킨다. 수득된 각 분획의 pH, L-세린농도(%) 및 함량(g), 및 글리신 농도(%) 및 함량(g)은 표 1에 나타낸다. 더우기, 각 분획의 pH, L-세린농도(%) 및 글리신 농도(%)는 제 1 도에 플로트한다.
[표 1]
각 분획의 L-세린 및 글리신 농도는 하기의 분석 조건을 사용한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 결정된다.
컬럼 : SHODEX OH팩 B-804(소와덴꼬사 제품)
이동상 : 5mM 인산수용액
컬럼온도 : 실온
유속 : 1.0ml/분
검출기 : 적외선 검출기
상술한 측정조간하의 체류시간(R.T.) :
L-세린 : 27.9분
글리신 : 31.7분
L-세린분획 : 분획번호5∼11(총 3500g)
L-세린 : 137.5g(공급된 L-세린의 92.6%)
글리신 : 4.5g(공급된 글리신의 12.9%)
글리신 분획 : 분획번호 12∼14(총 1500g)
L-세린 : 8.5g(공급된 L-세린의 5.7%)
글리신 : 30.0g(공급된 글리신의 86.1%)
상기의 3500g L-세린분획(3.9%의 L-세린 함유)를 275g으로 농축하여 L-세린농도가 약 20%가 되도록 한다. 275g이 이소프로필 알콜을 가한후, 생성된 혼합물을 냉각하고, 형성된 침전물을 여과 제거한 다음 건조시켜 118g의 L-세린결정(분리 수율 85.8%)을 수득한다. 이 생성물은 99.9%의 순도 및 +14.6의 비선광도" T2 "를 가지므로 만족스런 결과를 나타낸다.
[실시예 2]
에스케리키아콜리의 배양함으로써 제조된 세린 히드록시 메틸 트랜스퍼라제 존재하에 , 조효소로 테트라히드로폴산 및 피리독살포스페이트를 함유한 수성매질에서 글리신 및 포르말린(포름 알데히드)를 상호 작용시켜 26.0%의 L-세린 및 6.1%의 글리신을 함유한 반응용액 571g을 수득한다. 한편, 컬럼을 1.9l의 강산성 양이온 교환수지(0.38mm의 유효크기 및 1.7의 균일계수를 가짐)로 패킹하여 높이 1100mm 및 직경 48mm의 수지베드(H+형)를 형성한다. 상기의 반응 용액을 열처리하여 효소를 불활성화시키고, 공간속도가 1(또는 시간당 0.8미터의 직선 속도)이 되는 속도로 컬럼의 탑에 공급한다.
반응용액의 공급 완결후, 3500ml의 탈이온수를 1의 공간속도가 (또는 시간당 0.8미터의 직선 속도)이 되도록 탑으로부터 컬럼에 통과시킨다. 이어서, 6000ml의 1%수성암모니아를 2의 공간속도로 컬럼에 통과시키고, 최종적으로 1500mL의 탈이온수를 컬럼어 통과시켜 수지 베드를 세척한다. 반응용액의 통과개시로부터, 반응 용액의 통과에 따라 유출물을 500g분획으로 수거하고, 탈이온수로 세척(분획번호 5∼11) 및 수성암모니아(분획번호 12 및 그 이후)시킨다. 이렇게 수득된 각 분획의 pH, L-세린농도(%) 및 함량(g), 글리신 농도(%) 및 함량(g)은 표 2에 나타낸다. 더우기, 각 분획의 pH, L-세린농도(%) 및 글리신 농도(%)는 제 2 도에 플로트한다.
[표 2]
L-세린분획 : 분획번호5∼11(총 3500g)
L-세린 : 135.0g(공급된 L-세린의 90.9%)
글리신 : 10.5g(공급된 글리신의 30.2%)
글리신 분획 : 분획번호 12-15(총 2000g)
L-세린 : 10.0g(공급된 L-세린의 6.7%)
글리신 : 23.0g(공급된 글리신의 66.1%)
상기의 3500g L-세린분획(3.9%의 L-세린 함유)를 275g으로 농축하여 L-세린농도가 약 20%가 되게한다. 275g이 이소프로필 알콜을 가한후, 생성된 혼합물을 냉각시키고, 형성된 침전물을 여과 제거한 다음, 건조시켜 114g의 L-세린결정(분리 수율 84.4%)을 수득한다. 이 생성물은 99.9%의 순도 및 +15.0의 비선광도
를 가지므로 만족스런 결과를 나타낸다.
[비교예]
571g의 반응용액을 실시예 1과 같은 방법으로 수득한다. 한편, 컬럼을 1.9l의 강산성 양이온 교환수지 또는 레와티트 S-100(바이엘사 제품, 0.45mm의 유효크기 및 1.8이하의 균일계수를 가짐)로 패킹하여 높이 1100mm 및 직경 48mm의 수지베드(H+형)를 형성한다. 상기의 반응 용액을 열처리하여 효소를 불활성화시키고, 실시예 1에 사용된 것과 같은 조건, 즉 공간속도가 1(또는 시간당 0.8미터의 직선 속도)이 되는 속도로 컬럼의 탑에 공급한다. 반응용액의 공급 완결후, 3500ml의 탈이온수를 1의 공간속도가 (또는 시간당 0.8미터의 직선 속도)로 되도록 탑으로부터 컬럼에 통과시킨다. 이어서, 6000ml의 1%수성암모니아를 2의 공간속도로 컬럼에 통과시키고, 최종적으로 1500mL의 탈이온수를 컬럼에 통과시켜 수지 베드를 세척한다. 실시예 1과 같은 방법으로 수거된 각 분획의 분석치는 표 3 및 제 3 도에 나타낸다. 이들 데이타로부터, 글리신 및 L-세린이 이 경우에는 분리되지 않는다는 것을 알 수 있다.
[표 3]
분획번호 11∼13(총 1500g)
L-세린 : 145.0g(공급된 L-세린의 97.6%)
글리신 : 33.0g(공급된 글리신의 94.8%)
상기의 1500g분획(9.7%의 L-세린 및 2.2%의 글리신 함유)를 290g으로 농축하여 L-세린농도가 약 20%가 되게한다. 290g이 이소프로필 알콜을 가한후, 생성된 혼합물을 냉각시키고, 형성된 침전물을 여과 제거한 다음, 건조시켜 132g의 결정을 수득한다. 이 생성물은 87.8%의 L-세린 농도를 가지며, 10.2%의 글리신으로 오염되어 있다.
Claims (3)
- 용해된 상태로 글리신 및 L-세린을 함유한 용액을 0.15∼0.40mm의 유효크기 및 1.7이하의 균일계수를 갖는 강산성 이온 교환 수지의 컬럼을 통해 시간당 2미터 이하의 직선 속도로 통과시켜 글리신은 컬럼 내에 남아 있게 하고 L-세린을 함유한 유출액을 수득하고, 알칼리용액을 컬럼에 접촉시켜 글리신을 함유한 용출액을 수득하는 단계를 특징으로 하는, 글리신 및 L-세린의 용액으로부터 이들을 분리방법.
- 제 1 항에 있어서, 글리신 및 L-세린을 함유한 용액이 글리신을 원료로 사용하는 발효 또는 효소적 전환 방법으로부터 수득된 미반응 글리신 및 형성된 L-셀린의 혼합물을 함유한 용액인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 용액을 시간단 1미터 이하의 직선 속도로 컬럼에 통과시키는 방법.
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