CN102331472A - 婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法，取婴幼儿配方奶粉试样，经水溶解后，用甲酸溶液调节pH至4.6，沉淀样品中的蛋白质，经超声提取、离心、过滤，滤液中的五种核苷酸CMP、AMP、UMP、GMP、IMP经反相色谱柱分离，串联质谱，采用多反应离子监测（MRM）扫描模式，然后用基质加外标法进行定量。本发明LC-MS/MS法测定婴幼儿配方乳粉中五种核苷酸，在ESI方式下样品用量极少，不易污染离子源，灵敏度高，检测限低。特别是采用多反应离子监测（MRM）方法，可以很好地排除非核苷酸分子离子的干扰，同时样品预处理简单和适用范围广的优点。

Description

婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法

技术领域

本发明涉及一种婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法,特别涉及一种利用液相色谱-串联质谱、多反应离子监测测定婴幼儿配方奶粉中胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸五种核苷酸的检测方法，属于化学成分检测的技术领域。

背景技术

核苷酸是由含氮的碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸3种分子连接而成。碱基与糖通过糖苷键连成核苷，核苷与磷酸以酯键连成核苷酸。其主要生理功能是广泛参与人体的能量代谢、蛋白质合成，具有提高各种酶的活性、活化细胞功能、促进抗体形成、增强免疫功能的作用。它们可促进神经细胞的生长发育，是与“神经生长因子”有关或者可以作为神经生长物质利用的营养成分。一些临床上的研究发现，添加核苷酸的婴儿配方奶粉可减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育。目前婴幼儿配方奶粉中添加的核苷酸主要有5种：胞嘧啶核苷酸(cytidine, CMP)；尿嘧啶核苷酸(uridine, UMP)；腺嘌呤核苷酸(adenosine, AMP)；鸟嘌呤核苷酸 (guanosine, GMP)；次黄嘌呤核苷酸(inosine, IMP)^[1]。

牛奶中一般不含有核苷酸，但由于核苷酸对婴幼儿的特殊功效，许多奶制品企业都把核苷酸作为重要添加剂。但人体对核苷酸的需求有一定的限度，并非越多越好。为此对婴儿奶粉产品中核苷酸的质量监控极为重要，必须尽快研究制定适用于乳制品的检测方法^[2]。目前报道的检测方法主要有高效毛细管电泳法^[3, 4]、反相高效液相色谱法^[5, 6]、离子交换色谱法^[7]等。毛细管电泳法受到进样量小、检测池光程短等限制，存在定量重现性差、灵敏度低等不足。液相色谱法则柱效偏低，在分离复杂基质样品时，杂质不能与AMP等分离。在离子交换色谱分离五种核苷酸时，由于婴幼儿配方乳粉中还存在大量其它寡核苷酸而极易受到干扰。总之现有方法都存在较大的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以快速、直接地给出待测样品各核苷酸组分的相对分子质量和特征离子的液相色谱-串联质谱、多反应离子监测的核苷酸含量快速测定新方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法，具体步骤为：

试样经水溶解后，用甲酸溶液调节pH至4.6，沉淀样品中的蛋白质，经超声提取、离心、过滤，滤液中的五种核苷酸经反相色谱柱分离，串联质谱，采用多反应离子监测（MRM）扫描模式，然后用基质加标外标法进行定量。

所述的色谱柱为Symmetry C₁₈(2.1mm×150 mm、粒径3.5 μm)柱；柱温：40℃；样品温度：25℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，以线性梯度洗脱；

质谱条件是：离子源：ESI^-；毛细管电压：3.00 kV；锥孔电压：40 V；离子源温度：120℃；RF透镜1：30.0；光圈：0.4；RF透镜2：0.6；锥孔反吹气流量：50 L/h；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：500 L/h；碰撞池压力（mbar）：2.5×10^-3。

本发明的检测方法的主要技术特点：

ESI是一种非常软的电离方式，可以很方便地用于强极性、难挥发性化合物的离子化，是用质谱进行大分子化合物相对分子质量测定的一个重大突破。ESI电离方式的出现使这一问题迎刃而解。同时利用LC-MS/MS多反应离子监测（MRM）方式检测可以快速、直接地给出待测样品各核苷酸组分的相对分子质量和特征离子的质量，从而提高定性的能力；利用基质加标外标法定量，提高了检测限，减少了干扰、使检测结果更加精确。

1. 电喷雾离子源离子化及多反应离子监测（MRM）方式检测；基质加标外标法定量；同时提高了检测限，减少了干扰、使检测结果更加精确；2.  前处理只是简单的调pH值，超声提取，提高检验速度，降低劳动率。3.   利用反相色谱原理，实现五种核苷酸的分离。

本发明采用LC-MS/MS多反应离子监测（MRM）方式检测，可以快速、直接地给出待测样品各核苷酸组分的相对分子质量和特征离子的质量，从而提高定性的能力。选用基质加标外标法定量，试样经水溶解后，用甲酸溶液调节pH至4.6，沉淀样品中的蛋白质，经超声提取、离心、过滤，滤液中的五种核苷酸经反相色谱柱分离，比其它检测方法简单的多。另外，ESI方式下样品用量极少，不易污染离子源，灵敏度高，检测限低。特别是采用多反应离子监测（MRM）方法，可以很好地排除非核苷酸分子离子的干扰，使图谱的解析变得简单而直观。

本发明优点为：本发明采用Symmetry C₁₈ (2.1 mm×150 mm、3.5 μm) 色谱柱分离，流动相：A相为0.1%甲酸的水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱；串联质谱检测。五种核苷酸CMP、AMP、UMP、GMP、IMP的最低检出限（LOD）分别为0.50、0.20、1.20、0.30、0.60 μg/kg，最低定量限(LOQ)分别为2.00、1.00、4.00、1.00、2.00 μg/kg。相关系数 r＞0.999，回收率在90.0%～110.0%之间。本发明 LC-MS/MS法测定婴幼儿配方乳粉中五种核苷酸，在ESI方式下样品用量极少，不易污染离子源，灵敏度高，检测限低。特别是采用多反应离子监测（MRM）方法，可以很好地排除非核苷酸分子离子的干扰，同时样品预处理简单和适用范围广的优点。

附图说明

图1为五种核苷酸的总离子流色谱质谱图。

图2为五种核苷酸的特征离子色谱-质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明

1. 实验部分

1.1试剂

CMP，纯度≥98%，UMP，纯度≥99%，AMP，纯度≥99.0%，GMP，纯度≥99%，IMP，纯度≥99%均为分析纯(SIGMA公司)。甲酸、甲酸铵、乙酸、氨水、乙酸铵为优级纯。实验用水均为 18.2 MΩ·cm的超纯水。

设备

液相色谱串联四极杆质谱联用仪（Agilent1200RRLC、Agilent6410BQQQ、Masshanter软件）；Milli-Q水纯化系统（Millipore公司）；旋涡混合器；超声波清洗器；高速离心机；PHS-3E型实验室pH计。

标准溶液配制

精密称取CMP、AMP、UMP、GMP、IMP，超纯水配成1 mg/mL 标准储备液。避光，低温保存。

空白基质溶液制备

取未强化核苷酸的婴幼儿配方乳粉1.00 g，用pH 4.6甲酸水溶液定容至100 mL。超声波震荡10 min，在 4℃下离心 15 min（转速15000 rpm），吸取上清液，用 0.22 μm微孔滤膜的一次性滤头过滤。弃去前 0.5 mL 滤液后接取滤液，备测。 

样品预处理

称样品1.00 g，用pH 4.6甲酸水溶液定容至100 mL，超声波震荡10 min，在 4℃下离心 15 min（转速 15000 rpm），吸取上清液，用 0.22 μm微孔滤膜的一次性滤头过滤。弃去前 0.5 mL 滤液后接取滤液，备测。 

仪器条件

1.6.1液相色谱条件：

色谱柱：Symmetry C₁₈(2.1mm×150 mm、粒径3.5 μm)柱；柱温：40℃；样品温度：25℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min。流动相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈。线性梯度洗脱条件：参见表1。

表1  高效液相色谱串联质谱分离梯度洗脱条件

时间（min）	流动相 A%	流动相 B%	梯度变化曲线
				0	100	0	-
5.00	99	1	6
				6.50	95	5	6
7.00	0	100	6
				7.50	0	100	1
7.70	100	0	6

    注:1为即时变化, 6为线性变化。

1.6.2 MS/MS质谱条件：

离子源：ESI^-；毛细管电压：3.00 kV；锥孔电压：40 V；离子源温度：120℃；RF透镜1：30.0；光圈：0.4；RF透镜2：0.6；锥孔反吹气流量：50 L/h；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：500 L/h；碰撞池压力（mbar）：2.5×10^-3。 

质量分析器：低端分辨率LM Lens1：13.0 V；高端分辨率HM Lens1：13.0 V；离子能量1：1.0；入口透镜电压：0 V；碰撞梯度：1.0；出口电压：1.0 V；低端分辨率LM Lens2：13.0 V；高端分辨率HM Lens2 ：13.0 V；离子能量2：2.0；倍加器：650。

结果与讨论

2.1 定性及定量离子的选择

在拟定实验条件下, 标准样品在正离子模式下进行一级质谱全扫描, 得到5种核苷酸的母离子。对母离子进行二级质谱扫描, 得到它们的子离子(见表2)。利用这些子离子可以进行准确的定性和定量分析（见图1，图2）。

表2 五种核苷酸的母离子及其子离子参数

*为定量离子。

线性范围

取上述空白基质溶液，以空白基质溶液配制成浓度各为0.02、0.08、0.14、0.20、0.26、0.32、0.40 μg/mL（CMP浓度）的系列基质标准溶液。五种核苷酸的相关系数均r＞0.999，其线性范围为：CMP：0.02.-0.40 μg/mL，AMP、UMP、GMP、IMP：0.01-0.20 μg/mL。

灵敏度（LOD，LOQ）

取CMP、AMP、UMP、GMP、IMP标准储备液（μL）各200、100、100、100、100，加水1400 μL，配成混和标准溶液。加空白基质溶液逐级稀释成0.01、0.005、0.005、0.005、0.005 μg/mL的基质标准溶液。所得的峰信噪比（S/N）分别为5.83、6.04、1.28、4.76、2.34。以信噪比3倍时的溶液浓度为检出限， CMP、AMP、UMP、GMP、IMP的最低检出限（LOD）分别为0.50、0.20、1.20、0.30、0.60 μg/kg；以信噪比（S/N）为10倍时的溶液浓度为定量限（LOQ），五种核苷酸CMP、AMP、UMP、GMP、IMP的定量限(LOQ)分别为2.00、1.00、4.00、1.00、2.00 μg/kg。

回收率

取空白基质溶液，分别加入高、中、低不同浓度的核苷酸混合标准溶液平行各6份，同时3份空白对照。 样品按1.5方法进行预处理，进样，获得较好的回收率（表3）。 

表3 五种核苷酸的回收率

2.5 精密度

日内精密度：取含五种核苷酸的婴幼儿配方乳粉，称取11份平行样品，按1.5预处理样品，CMP、AMP、UMP、GMP、IMP的RSD分别为2.99%、3.41%、3.90%、3.49%、4.91%。 

日间精密度：同1.5取样及预处理，连续7d检测CMP、AMP、UMP、GMP、IMP的RSD，分别为6.77%、6.63%、5.19%、4.78%、4.35%。

样品测定

   4份市售婴儿奶粉样品按1.5 样品预处理步骤进行前处理，按1.6的色谱条件进行测定，外标法定量，其分析结果见表4。

表 4 样品中核苷酸的含量 (n=3)

样品	CMP	AMP	UMP	IMP	GMP
						奶粉1	1.050	0.296	0.280	0.084	0.105
奶粉2	0.501	0.156	0.194	0.099	0.087
						奶粉3	0.604	0.210	0.193	0.095	0.071
奶粉4	0.485	0.097	0.189	0.085	0.056

3 结论

本研究所建立的LC-MS/MS多反应离子监测（MRM）方式同时测定婴幼儿奶粉中5种核苷酸的方法无需繁复的样品处理步骤，选用基质加标外标法定量，试样经水溶解后，用甲酸溶液调节pH至4.6，沉淀试液中的蛋白质，经超声提取、离心、过滤，滤液中的五种核苷酸经反相色谱柱分离，比其它检测方法简单的多。另外，ESI方式下样品用量极少，不易污染离子源，灵敏度高，检测限低。特别是采用多反应离子监测（MRM）方法，可以很好地排除非核苷酸分子离子的干扰，使图谱的解析变得简单而直观。该方法有很高的选择性,具有较高的实用价值。 

参考文献

[1] 杨大进，方从容，马兰，等. 中国食品卫生杂志，2003，15(6)：496

[2] 郝岩平，姜金斗. 中国食品添加剂，2003，2：115

[3] 薛雄志，邓永智，袁东星. 高效毛细管电泳法分析单核苷酸[J]. 福建分析测试，1995，4：197-200. 

[4] Helboe T, Hansen S. Separation of nucleosides using capillary electrochromatography [J]. J Chromatogr A, 1999，836：315-324. 

[5] Gill BD, Indyk HE. Development and application of a liquid chromatographic method for analysis of nucleotides and nucleosides in milk and infant formulas [J]. Int Dairy J, 2007，17：596-605. 

[6] 杨大进，方从容，马兰，等. 婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量的测定方法研究[J].中国食品卫生杂志，2002，15：496-499. 

[7] Kidew BR, Melissa J, Wilcox. 离子交换色谱和ELSD检测分析核苷酸[J]. 药物分析杂      

   志，2000，20：359-360。

Claims (2)

1.一种婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法，其特征在于：婴幼儿配方奶粉试样经水溶解后，用甲酸溶液调节pH至4.6，沉淀样品中的蛋白质，经超声提取、离心、过滤，滤液中的五种核苷酸CMP、AMP、UMP、GMP、IMP经反相色谱柱分离，串联质谱，采用多反应离子监测（MRM）扫描模式，然后用基质加外标法进行定量。

2.根据权利要求1所述的婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法，其特征在于：

所述的色谱柱为Symmetry C₁₈(2.1mm×150 mm、粒径3.5 μm)柱；柱温：40℃；样品温度：25℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，以线性梯度洗脱；

质谱条件是：离子源：ESI^-；毛细管电压：3.00 kV；锥孔电压：40 V；离子源温度：120℃；RF透镜1：30.0；光圈：0.4；RF透镜2：0.6；锥孔反吹气流量：50 L/h；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：500 L/h；碰撞池压力（mbar）：2.5×10^-3。

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