CN109917058A - 细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法，色谱条件为：InertSustain AQ‑C18色谱柱；流动相A：40‑60mM KH2PO4，pH5.0‑6.0；流动相B：CH3OH；流速：1.0ml/min；波长：260nm；柱温：40℃；等梯度洗脱，A:B＝90:10。本发明的细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相色谱测定方法，能有效分离细胞内四种游离的脱氧核苷酸，操作简单，重复性好，其测定的精密度满足细胞分析的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法，属于生物化学与细胞生物学技术领域。
背景技术
除部分病毒外，机体的遗传物质均为脱氧核糖核苷酸(DNA)，脱氧核苷酸是其基本的结构和功能单位。一个脱氧核糖核苷酸分子由一分子含氮碱基、一分子脱氧核糖、一分子磷酸组成，其中碱基有四种，分别是腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶胞(C)和鸟嘌呤(G)。研究表明，核苷酸池是细胞进行核酸合成及生化反应的基础，核苷酸池内各成分的稳定对机体健康具有重要意义，而四种脱氧核苷酸，作为遗传物质的组成基础以及核苷酸池中的重要组成，在机体细胞生长发育过程中发挥重要的作用，且与机体的能量代谢、分子合成息息相关，因此，对细胞内四种脱氧核苷酸的检测，对反映细胞内核苷酸池的稳定性，从而评估细胞、组织甚至机体的健康状态具有重要意义。但一直以来，关于分离食品、细胞、组织中的核糖核苷酸的方法研究较多，但脱氧核苷酸，尤其是细胞内脱氧核苷酸的组分分离分析仍未见报道。
脱氧核苷酸是生物体遗传物质DNA的基本的结构和功能单位，生物体中脱氧核苷酸含量变化与机体的各种生命活动息息相关，建立生物体细胞中四种脱氧核苷酸的检测方法，对深入了解机体的各种生命活动的调控机制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能同时测定细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法，该方法通过对从细胞中提取四种脱氧核苷酸进行高效液相色谱分析，根据标准曲线方程得出四种脱氧核苷酸的含量；所述的四种脱氧核苷酸包括腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，所述高效液相色谱分析的色谱条件为：
色谱柱：InertSustain AQ-C18色谱柱；
流动相A：40-60mM KH2PO4，pH5.0-6.0；
流动相B：CH3OH；
流速：1.0ml/min；
波长：260nm；
柱温：40℃；
洗脱方式：等梯度洗脱，A:B＝90:10。
所述的流动相A优选为50mM KH2PO4，pH5.5。
作为一种优选技术方案，从细胞中提取四种游离脱氧核苷酸的过程为：待细胞长满至T75后，胰酶消化收集细胞，PBS清洗细胞一次；加入0.3mM三氯乙酸，混匀后冰浴，然后离心吸取上清液，调节pH至5.0～5.5，上机检测前使用0.22um微孔滤头过滤。
进一步优选的，所述三氯乙酸的加入量为每10mg细胞沉淀加入100ul 0.3mM三氯乙酸，所述冰浴的时间为10min，所述离心的条件为12000g离心10min。用5mM氢氧化钾调节pH至5.5。
作为一种优选技术方案，所述标准曲线方程是将四种脱氧核苷酸的标准品溶液经高效液相色谱分析得到的。
进一步优选的，四种脱氧核苷酸标准品溶液的配制过程为：分别称取dAMP、dGMP、dTMP、dCMP标准品各10mg，加10ml超纯水配置成浓度单位1mg/ml的储备液；分别移取1ml各标准品溶液，使用超纯水稀释至浓度为200、400、600、800、1000ug/ml的单一标准品溶液；分别将相同浓度的四种标准品溶液混合制得浓度梯度为50、100、150、200、250ug/ml的混合标准品溶液。
上述的方法在生物化学、细胞生物学、医学等生命科学中测定细胞内四种游离脱氧核苷酸中的应用。
本发明方法的进一步的详细过程为：(1)配制四种脱氧核苷酸的混合标准溶液，绘制标准溶液曲线。(2)从细胞中提取四种脱氧核苷酸，配制样品溶液。(3)在色谱条件下对样品溶液进行高效液相色谱分析。(4)根据标准曲线方程计算样品溶液中四种脱氧核苷酸的含量。所述高效液相色谱分析的色谱条件为：
色谱柱：InertSustain AQ-C18色谱柱
流动相A：40-60mM KH2PO4(pH5.0-6.0)，优选50mM KH2PO4(pH5.5)
流动相B：CH3OH
流速：1.0ml/min
波长：260nm
柱温：40℃
洗脱方式：梯度洗脱；A：B＝90:10。
步骤(1)中配制四种脱氧核苷酸标准品溶液的步骤为：分别称取dAMP、dGMP、dTMP、dCMP标准品各10mg，加10ml超纯水配置成浓度单位1mg/ml的储备液；分别移取1ml各标准品溶液，使用超纯水稀释至浓度为200、400、600、800、1000ug/ml的单一标准品溶液；分别将相同浓度的四种标准品溶液混合制得浓度梯度为50、100、150、200、250ug/ml的混合标准品溶液。
步骤(2)中从细胞中提取四种游离脱氧核苷酸的步骤为：待细胞长满至T75后，胰酶消化收集细胞，PBS清洗细胞一次。每10mg细胞沉淀加入100ul 0.3mM三氯乙酸(TCA)，混匀后冰浴10min，12000g离心10min，吸取上清液，用5mM氢氧化钾(KOH)调节pH至5.0～5.5。上机检测前使用0.22um微孔滤头过滤。
本发明专利公开了一种同时测定细胞内四种游离脱氧核苷酸含量的方法，它采用甲醇作为流动相中的有机相，成功分离测定了四种脱氧核苷酸，但细胞内脱氧核苷酸的提取需要在弱酸环境下进行，即pH需保持在5.0-5.5，过酸或过碱均会导致脱氧核苷酸生理结构的破坏，使得一些成分无法检出。
经测定，本发明所述的测定方法标准曲线线性关系良好，浓度与峰面积间呈正相关，且相关性好。此方法的精密度试验结果良好，样品重复5次各脱氧核苷酸的变异系数均小于1％。
本发明的有益效果：
本发明所述的测定方法采用高效液相色谱法测定细胞内四种脱氧核苷酸含量是一较理想的方法，该方法操作简便，易于掌握，其测定的精密度能满足细胞分析的要求。
附图说明
图1为四种脱氧核苷酸混合标准溶液的HPLC图；
图2为细胞内四种游离脱氧核苷酸的HPLC图；
图3为对比例1中四种脱氧核苷酸混合标准溶液的HPLC图；
图4为对比例2中四种脱氧核苷酸混合标准溶液的HPLC图；
图5为对比例3中四种脱氧核苷酸混合标准溶液的HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施方式做进一步说明。
试剂与设备：dAMP、dGMP、dTMP、dCMP标准品均购自sigma公司，纯度>98％。实验所用甲醇(CH3OH)，三乙醇胺(TEA)以及磷酸(H3PO4)为色谱级。超声波清洗器、离心机、高效液相色谱系统。
实施例1
(1)配制4种脱氧核苷酸标准品溶液的步骤为：分别称取dAMP、dGMP、dTMP、dCMP标准品各10mg，加10ml超纯水配置成浓度单位1mg/ml的储备液；分别移取1ml各标准品溶液，使用超纯水稀释至浓度为200、400、600、800、1000ug/ml的单一标准品溶液；分别将相同浓度的四种标准品溶液混合制得浓度梯度为50、100、150、200、250ug/ml的混合标准品溶液。取浓度为250ug/ml的标准溶液经高效液相色谱分析得到标准溶液曲线(见图1)，各标准品所得到的标准曲线及曲线相关系数(R2)见表1，色谱条件为：
流动相A：50mM KH2PO4in H2O(pH5.5)
流动相B：CH3OH
流速：1.0ml/min
波长：260nm
柱温：40℃
洗脱方式：等梯度洗脱；A：B(v:v)＝90:10
表1：本发明实施例1的标准曲线线性回归方程及相关系数结果。
表1为各脱氧核苷酸标准品的回归方程相关系数(R2)
(2)从细胞中提取四种游离脱氧核糖核苷酸的步骤为：待细胞长满至T75后，胰酶消化收集细胞，PBS清洗细胞一次。每10mg细胞沉淀加入100ul 0.3mM三氯乙酸(TCA)，混匀后冰浴10min，涡旋后12000g离心10min，吸取上清液，用5mM氢氧化钾(KOH)调节pH至5.5。上机检测前使用0.22um微孔滤头过滤。
(3)在色谱条件下对样品溶液进行高效液相色谱分析，上样量10ul，得到样品溶液的色谱图，见图2。
(4)根据标准曲线方程计算样品溶液中四种脱氧核苷酸的含量，见表2，单位为ug/ml。
表2为细胞内四种脱氧核苷酸含量表
对比例1
配制4种脱氧核苷酸标准品溶液的步骤为：分别称取dAMP、dGMP、dTMP、dCMP标准品各10mg，加10ml超纯水配置成浓度单位1mg/ml的储备液；分别移取1ml各标准品溶液，使用超纯水稀释至浓度为200、400、600、800、1000ug/ml的单一标准品溶液；分别将相同浓度的四种标准品溶液混合制得浓度梯度为50、100、150、200、250ug/ml的混合标准品溶液。取浓度为250ug/ml的标准溶液经高效液相色谱分析得到标准溶液曲线，见图3，色谱条件为：
流动相A：50mM TEA in H2O(pH5.5)
流动相B：CH3OH
流速：1.0ml/min
波长：260nm
柱温：40℃
洗脱方式：等梯度洗脱；A：B＝99:1
对比例2
配制4种脱氧核苷酸标准品溶液的步骤为：分别称取dAMP、dGMP、dTMP、dCMP标准品各10mg，加10ml超纯水配置成浓度单位1mg/ml的储备液；分别移取1ml各标准品溶液，使用超纯水稀释至浓度为200、400、600、800、1000ug/ml的单一标准品溶液；分别将相同浓度的四种标准品溶液混合制得浓度梯度为50、100、150、200、250ug/ml的混合标准品溶液。取浓度为250ug/ml的标准溶液经高效液相色谱分析得到标准溶液曲线，见图4，
色谱条件为：
流动相A：50mM KH2PO4in H2O(pH4.5)
流动相B：CH3OH
流速：1.0ml/min
波长：260nm
柱温：40℃
洗脱方式：等梯度洗脱；A：B＝90:10
对比例3
配制4种脱氧核苷酸标准品溶液的步骤为：分别称取dAMP、dGMP、dTMP、dCMP标准品各10mg，加10ml超纯水配置成浓度单位1mg/ml的储备液；分别移取1ml各标准品溶液，使用超纯水稀释至浓度为200、400、600、800、1000ug/ml的单一标准品溶液；分别将相同浓度的四种标准品溶液混合制得浓度梯度为50、100、150、200、250ug/ml的混合标准品溶液。取浓度为250ug/ml的标准溶液经高效液相色谱分析得到标准溶液曲线，见图5，色谱条件为：
流动相A：50mM KH2PO4in H2O(pH6.5)
流动相B：CH3OH
流速：1.0ml/min
波长：260nm
柱温：40℃
洗脱方式：等梯度洗脱；A：B＝90:10
本发明方法的精确性验证：取浓度为250ug/ml的混合标准品溶液，按照实施例1中的色谱方法平行测定5次各脱氧核苷酸含量，计算精密度，测定结果如表3所示。
表3为精密度检测结果
波长的选择：对每种脱氧核苷酸标准溶液的吸光度通过UWD检测器在190-400nm扫描，确定能同时检测上述4种脱氧核苷酸的最佳波长为260nm。
流动相的选择：使用50mM的KH2PO4作为流动相，可同时分离出四种脱氧核苷酸，且整个分离过程只需15min。使用三乙醇胺(TEA)作为流动相时，只有dCMP和dAMP可以得到有效分离，dGMP和dTMP两两掺杂，不能有效分离，且TEA使得各组分保留时间显著延长，dAMP的分离需要30min才能完成。
流动相pH的选择：细胞内脱氧核苷酸的提取需要在弱酸环境下进行，即pH需保持在5.0-5.5，过酸或过碱均会导致脱氧核苷酸生理结构的破坏，导致一些成分无法检出。流动A的pH变为4.5使得dCMP的分离不稳定，流动相A的pH变为6.5时，dGMP和dTMP得不到有效分离。
本发明提供的细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相色谱测定方法，能使四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸得到良好分离和准确定量，且本发明方法精密度高，5次平行测定的相对标准偏差均小于1％，符合定量分析方法的要求，可以用于细胞内脱氧核苷酸的分离定量。
Claims (8)
1.一种细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法，其特征在于：该方法通过对从细胞中提取四种脱氧核苷酸进行高效液相色谱分析，根据标准曲线方程得出四种脱氧核苷酸的含量；所述的四种脱氧核苷酸包括腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，所述高效液相色谱分析的色谱条件为：
色谱柱：InertSustain AQ-C18色谱柱；
流动相A：40-60mM KH2PO4，pH5.0-6.0；
流动相B：CH3OH；
流速：1.0ml/min；
波长：260nm；
柱温：40℃；
洗脱方式：等梯度洗脱，A:B＝90:10。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的流动相A为50mM KH2PO4，pH5.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：从细胞中提取四种游离脱氧核苷酸的过程为：待细胞长满至T75后，胰酶消化收集细胞，PBS清洗细胞一次；加入0.3mM三氯乙酸，混匀后冰浴，然后离心吸取上清液，调节pH至5.0～5.5，上机检测前使用0.22um微孔滤头过滤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述三氯乙酸的加入量为每10mg细胞沉淀加入100ul 0.3mM三氯乙酸，所述冰浴的时间为10min，所述离心的条件为12000g离心10min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：用5mM氢氧化钾调节pH至5.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准曲线方程是将四种脱氧核苷酸的标准品溶液经高效液相色谱分析得到的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述四种脱氧核苷酸标准品溶液的配制过程为：分别称取dAMP、dGMP、dTMP、dCMP标准品各10mg，加10ml超纯水配置成浓度单位1mg/ml的储备液；分别移取1ml各标准品溶液，使用超纯水稀释至浓度为200、400、600、800、1000ug/ml的单一标准品溶液；分别将相同浓度的四种标准品溶液混合制得浓度梯度为50、100、150、200、250ug/ml的混合标准品溶液。
8.权利要求1～7中任一所述的方法在生物化学、细胞生物学、医学等生命科学中测定细胞内四种游离脱氧核苷酸中的应用。
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