CN102590366A - 不同基质中药中桔青霉素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种采用高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)法检测不同基质中药材及其制品中桔青霉素的方法，包括样品的提取，纯化及检测。所述的样品采用甲醇-水(70∶30，V/V)高速震荡提取，离心，过滤，加PBS溶液稀释，微纤维膜过滤，免疫亲和柱净化后，收集洗脱液，微孔滤膜过滤后进样分析。样品经液相色谱-串联质谱进行确证。本方法适用于各种不同基质中药材及其制品中桔青霉素的检测，操作简便，回收率高，检测限低。

Description

不同基质中药中桔青霉素的检测方法

技术领域：

本发明涉及一种测定不同基质中药材及其制品中桔青霉素的方法，特别是涉及采用高效液相色谱-荧光检测器测定桔青霉素的方法，高效液相色谱-串联质谱法确证中药材及其制品中桔青霉素的方法。 

背景技术：

桔青霉素是青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、红曲霉属(Monascus)中的丝状霉菌代谢产生的一种真菌毒素。最初是1931年从青霉属中的桔青霉(Penicillium.citrinum)中分离得到，其它已知的能产生桔青霉素的菌种如变灰青霉(P.canescens)、扩展青霉(P.expansum)、闪白曲霉(Aspergillus candidus)、黄柄曲霉(A.flavipes)、紫红曲霉(Monascus purpureus)、红曲霉(M.ruber)等。主要污染谷物、食品及饲料，对人畜危害都较大，它作用的靶器官是肾脏，人和动物如摄入被桔青霉素污染的产品后，可引起肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状，甚至还可以导致畸形、肿瘤，诱发突变。 

桔青霉素在自然界分布极为广泛，小麦、大麦、燕麦、麦麸、玉米及红曲类污染桔青霉素都有相关报道，并且对红曲类产品的调查结果显示桔青霉素的污染水平普遍较高，不难发现部分药食两用的中药材受桔青霉素的污染相当普遍，如麦芽、谷芽、麦麸、红曲等。1991年在法国里昂召开的真菌毒素和地方肾病与泌尿道肿瘤研讨会上，讨论了桔青霉素在Balcan地方肾病发生中的作用，引起了国际癌症研究会及各国学者的高度重视。国家药监局在红曲等为原料保健食品产品申报与审评有关事项中增加产品中桔青霉素指标的测定限量暂定为50μg/kg。因此，为保证中药的安全有效，需尽快建立相关中药材及其制品中快速、准确的桔青霉素检测方法，完善我国中药安全控制标准体系，以提高我国在中药安全国际标准制定中的地位。 

发明内容：

到目前为止，国内外报道的方法大多仅限于对中药材红曲米中桔青霉素的分析，对其他不同基质的中药材及其制品中桔青霉素的分析，目前还是空白。因此对大范围中药材中桔青霉素测定方法的建立迫在眉睫。现有的测定农产品、饲料以及红曲类产品中的桔青霉素的方法，由于样品基质相对简单，除红曲类产品会产生色素成分干扰外，其它因素干扰较小，一般都较易测定。本发明克服现有技术不足，选择了适用于不同基质中药材及其制品中桔青霉素的提取、净化方法，以及采用有较高灵敏度的高效液相-荧光检测法，通过方法的优化，保证样品处理简便易行，含量测定结果准确度高，重现性好，故采用该方法能更加准确的对不同基质中药材及其制品中的桔青霉素进行测定。 

本发明是采用高效液相色谱-荧光检测法测定中药材及其制品中的桔青霉素的方法，同时还建立了高效液相色谱-串联质谱法确证中药材及其制品中桔青霉素的方法。 

具体的不同基质中药中桔青霉素测定的方法，可以通过以下步骤实现： 

仪器、药品及材料： 

仪器： 

SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪、RF-10AxL检测器，日本岛津公司； 

TGL-16C型高速离心机，上海安亭科学仪器厂； 

WH-861型旋涡混合器，金坛市盛蓝仪器制造有限公司； 

DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司； 

CitriTest-HPLC免疫亲和柱，美国VICAM公司； 

微纤维膜滤纸，美国VICAM公司； 

API4000液相质谱联用系统，美国应用生物系统公司。 

对照品： 

桔青霉素标准品购自Fermentek公司，纯度≥99％；乙腈、甲醇购自Fisher公司，均为色谱纯；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。 

样品： 

所有样品均为国内市场上随机购买而来，低温干燥后备用。 

1、高效液相色谱-荧光检测法测定不同基质中药及其制品中的桔青霉素： 

a.色谱条件：采用反相C₁₈液相色谱柱，荧光检测器检测，流动相为乙腈-0.1％磷酸水(45∶55，v/v)，检测器激发波长为331nm，发射波长为500nm。 

b.溶液配制： 

对照品溶液的配制：分别称取对照品适量，加乙腈或甲醇制成溶液； 

c.样品溶液的制备： 

样品提取：取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水溶液适量，高速震荡提取，离心，过滤，稀释，震摇，静置，再震摇，再静置，微纤维膜过滤，备用； 

样品净化：取上述滤液缓慢通CitriTest-HPLC免疫亲和柱，直至空气通过柱体，再以缓冲溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使空气通过柱体。甲醇水洗脱，收集洗脱液，过滤后进HPLC分析。 

d.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。 

2、高效液相色谱-串联质谱法确证中药中的桔青霉素： 

a.色谱条件：流动相为乙腈-水，梯度洗脱。色谱柱为Gemini C18色谱柱。 

b.质谱条件：离子源为电喷雾离子源，正离子方式检测，喷射电压为5500V，毛细管温度550℃，碰撞能量23/36eV，扫描方式为多反应监测(MRM)。 

c.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱-串联质谱仪，测定。 

本发明不同基质中桔青霉素的测定方法，优选的技术方案可以按下列测定步骤进行： 

1、高效液相色谱-荧光检测法测定不同基质中药及其制品中的桔青霉素： 

(1)色谱条件： 

高效液相色谱仪(HPLC-FLD)：SHIMADZU LC-20AT系列，RF-10AxL荧光检测器； 

色谱柱：Gemini 5u C₁₈ 110A(250×4.60mm)； 

流动相：乙腈-0.1％磷酸水(45∶55，v/v)； 

柱温：25℃； 

流速：1.0ml/min； 

激发波长＝331nm，发射波长＝500nm。 

(2)溶液配制： 

对照品溶液的配制：精密称取桔青霉素对照品适量，加甲醇制成每ml含4ng的溶液； 

PBS稀释液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990ml纯水溶解，然后用浓盐酸调节值至7.0，最后用纯水稀释至1000ml。 

PBS-吐温淋洗液(0.05％)：取0.5ml吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000ml。 

(3)样品溶液的制备： 

样品提取：精密取药材粉末1.0g，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水溶液(70∶30，V/V)5ml，高速震荡提取3min，6000r/min的转速下离心20min，过滤，取3ml滤液加PBS稀释液稀释至30ml，震摇1min，静置2min，再震摇1min，静置3min，微纤维膜过滤，备用。 

样品净化：取上述滤液2ml以1滴/秒的速度缓慢通过CitriTest-HPLC免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体，再以10ml 0.05％PBS-吐温溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2-3ml空气通过柱体。准确加入2.0mL甲醇-磷酸水(70∶30，V/V)洗脱，收集洗脱液定容过滤备用。 

(4)测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液50μL，注入液相色谱仪，测定桔青霉素含量。 

2、高效液相色谱-串联质谱法确证不同基质中药材及制品中的桔青霉素： 

(1)色谱条件：流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。梯度0.01-0.60min，90％A；0.60-1.20min，90％A-5％A；1.20-2.50min，5％A；2.50-2.51min，5％A-90％A；2.51-4.00min，90％A。色谱柱为Gemini C₁₈(20mm×2.00mm，3μm)，流速为0.5ml/min。 

(2)质谱条件：离子源为ESI电喷雾离子源，正离子方式检测，喷射电压为5500V，雾化气60psi，帘幕气12psi，CAD(碰撞气)：15个单位，毛细管温度550℃，碰撞能量23/37eV，扫描方式为多反应监测(MRM)。 

(3)测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液10μL，注入液相色谱-串联质谱仪，进行确证。 

经过多次重复试验，确认方法简便，结果准确，可作为不同基质中药材及制品中桔青霉素的测定方法。 

本发明提供了不同基质中药及其制品中桔青霉素的高效液相色谱-荧光检测的方法以及高效液相色谱-串联质谱的确证方法。结果准确，重现性好，可作为不同基质中药材及其制品中桔青霉素的测定方法。 

附图说明：

图1是红曲米空白样品的高效相色谱图； 

图2是桔青霉素标准品的高效相色谱图； 

图3是红曲米加样样品高效相色谱图； 

图4是红曲米阳性样品的高效相色谱图； 

图5是桔青霉素标准品的MS²质谱图； 

图6是桔青霉素标准品的MRM提取粒子流图； 

图7是红曲米阳性样品的MRM提取粒子流图。 

具体实施方案：

1、高效液相色谱-荧光检测法测定中药材及其制品中的桔青霉素 

(1)色谱条件： 

高效液相色谱仪(HPLC-FLD)：SHIMADZU LC-20AT系列，RF-10AxL荧光检测器； 

色谱柱：Gemini 5u C₁₈ 110A(250×4.60mm)； 

流动相：乙腈-0.1％磷酸水(45∶55，v/v)； 

柱温：25℃； 

流速：1.0ml/min； 

激发波长＝331nm，发射波长＝500nm。 

(2)溶液配制： 

对照品溶液的配制：精密称取桔青霉素对照品适量，加甲醇制成每ml含4ng的溶液； 

PBS稀释液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990ml纯水溶解，然后用浓盐酸调节值至7.0，最后用纯水稀释至1000ml。 

PBS-吐温淋洗液(0.05％)：取0.5ml吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000ml。 

(3)样品溶液的制备： 

样品提取：精密取药材粉末1g，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水溶液(70∶30，V/V)5ml，高速震荡提取3min，6000r/min的转速下离心20min，过滤，取3ml滤液加PBS稀释液稀释至30ml，震摇1min，静置2min，再震摇1min，静置3min，微纤维膜过滤，备用； 

样品净化：取上述滤液2ml以1滴/秒的速度缓慢通过CitriTest-HPLC免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体，再以10ml 0.05％PBS-吐温溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2-3ml空气通过柱体。准确加入2.0mL甲醇-磷酸水(70∶30，V/V)洗脱，收集洗脱液定容过滤备用。 

(4)回收率实验： 

采用西洋参、薏苡仁、红曲米三种中药材样品进行加样回收实验，且经过桔青霉素(CIT)免疫亲和柱处理之后，进HPLC-FLD检测，对添加的标准品检测无干扰，故将其用来做回收率实验。分别添加了3个水平的标准品溶液200μg/kg、100μg/kg、50μg/kg，每组实验均重复3次，n＝3。精密称取1.0g药材粉末，加入适量标准溶液，挥干溶剂后，按上述方法制备样品溶液，进样量50μL，按外标法测定其含量，结果见表1。 

表1桔青霉素加样回收率的测定 

(5)最低检出限和定量限 

根据信噪比S/N≥3为该物质的最低检出限，桔青霉素的最低检出限为0.8μg/kg。 

根据信噪比S/N≥10为该物质的最低定量限，桔青霉素的定量限为2.0μg/kg。 

(6)样品测定： 

运用上述方法测定了16批中药材样品，10批包含红曲制品在内的中药材制品，用外标法分别测定制备好的各种待测样品液，每个样品进样50μL。所有样品经过免疫亲和柱前处理以后，所测样品的结果见 

表2，用“×”表示样品中桔青霉素未检出。 

表2.中药材及其制品中桔青霉素的测定结果 

2、用高效液相色谱-串联质谱法确证中药及制品中的桔青霉素： 

中药成分复杂，因此，仅仅通过色谱峰的保留时间进行鉴别，有可能给分析结果造成误差。为了排除干扰和消除误差，本实验采用了LC-MS/MS联用技术对测定结果进行了确证，电喷雾电离，正离子方式，采用MRM模式监测。优化质谱参数后，得到桔青霉素的主要碎片离子m/z 233([M+H-H₂O]⁺)，m/z 205([M+H-H₂O-CO]⁺)。通过桔青霉素标准品的提取的离子流图可以看出，桔青霉素的保留时间为2.18min，另外，在桔青霉素的两个通道分别监测了阳性样品，均在2.18min显示有色谱峰，证实阳性样品中桔青霉素的存在。 

Claims (4)

1.一种检测不同基质中药及其制品中桔青霉素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)高效液相色谱-荧光检测法测定中药及其制品中的桔青霉素。

(2)高效液相色谱-串联质谱法确证中药及其制品中的桔青霉素。

2.根据权利要求1的中药及其制品中桔青霉素的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的桔青霉素。

a.色谱条件：采用反相C₁₈液相色谱柱，荧光检测器检测，流动相为乙腈-水，检测器激发波长为331nm，发射波长为500nm；

b.溶液配制：

对照品溶液的配制：分别称取对照品适量，加乙腈或甲醇制成溶液；

c.样品溶液的制备：

样品提取：取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水溶液适量，高速震荡提取，离心，过滤，稀释，震摇，静置，再震摇，再静置，微纤维膜过滤，备用；

样品净化：取上述滤液缓慢通过桔青霉素免疫亲和柱，直至空气通过柱体，再以缓冲溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使空气通过柱体。甲醇水洗脱，收集洗脱液，过滤后进HPLC分析。

d.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。

(2)高效液相色谱-串联质谱法确证中药中的桔青霉素。

a.色谱条件：流动相为乙腈-水，梯度洗脱。色谱柱为Gemini C18色谱柱。

b.质谱条件：离子源为电喷雾离子源，正离子方式检测，喷射电压为5500V，毛细管温度550℃，碰撞能量23/37eV，扫描方式为多反应监测(MRM)。

c.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱-串联质谱仪，测定。

3.根据权利要求2的中药中桔青霉素的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的桔青霉素。

a.色谱条件：

高效液相色谱仪(HPLC-FLD)：SHIMADZU LC-20AT系列，RF-10AxL荧光检测器；

色谱柱：Gemini 5u C₁₈ 110A(250×4.60mm)；

流动相：乙腈-0.1％磷酸水(45∶55，v/v)；

柱温：25℃；

流速：1.0ml/min；

激发波长＝331nm，发射波长＝500nm。

b.溶液配制：

然后用对照品溶液的配制：精密称取桔青霉素对照品适量，加乙腈或甲醇制成每ml含2-8ng的溶液；

PBS稀释液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990ml纯水溶解，浓盐酸调节值至7.0，最后用纯水稀释至1000ml。

PBS-吐温淋洗液(0.05％)：取0.5ml吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000ml。

c.样品溶液的制备：

样品提取：精密取匀质处理的药材粉末1-5g，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水溶液(60-75∶40-25，V/V)适量，高速震荡提取3-5min，6000r/min的转速下离心10-20min，过滤，取3-15ml滤液加PBS溶液20-40ml稀释，震摇1-2min，静置2-3min，再震摇1-2min，静置1-3min，玻璃纤维膜过滤，备用；

样品净化：取上述滤液1-5ml缓慢通过CitriTest-HPLC免疫亲和柱，直至2-5ml空气通过柱体，再以10-15mlPBS-吐温溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使1-5ml空气通过柱体。加2ml甲醇水洗脱，收集洗脱液定容过滤备用。

d.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液10-50μL，注入液相色谱仪，测定。

(2)高效液相色谱-串联质谱法确证中药中的桔青霉素。

a.色谱条件：流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。梯度0.01-0.60min，90％A；0.60-1.20min，90％A-5％A；1.20-2.50min，5％A；2.50-2.51min，5％A-90％A；2.51-4.00min，90％A。色谱柱为Gemini C₁₈(20mm×2.00mm，3μm)，流速为0.5ml/min。

b.质谱条件：离子源为ESI电喷雾离子源，正离子方式检测，喷射电压为5500V，雾化气60psi，帘幕气12psi，CAD(碰撞气)：15个单位，毛细管温度550℃，碰撞能量23/37eV，扫描方式为多反应监测(MRM)。

c.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液10μL，注入液相色谱-串联质谱仪，进行确证。

4.根据权利要求3的中药中桔青霉素的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的桔青霉素。

a.色谱条件：

高效液相色谱仪(HPLC-FLD)：SHIMADZU LC-20AT系列，RF-10AxL荧光检测器；

色谱柱：Gemini 5u C₁₈ 110A(250×4.60mm)；

流动相：乙腈-0.1％磷酸水(45∶55，v/v)；

柱温：25℃；

流速：1.0ml/min；

激发波长＝331nm，发射波长＝500nm。

b.溶液配制：

对照品溶液的配制：精密称取桔青霉素对照品适量，加甲醇制成每ml含4ng的溶液；

PBS稀释液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990ml纯水溶解，然后用浓盐酸调节值至7.0，最后用纯水稀释至1000ml。

PBS-吐温淋洗液(0.05％)：取0.5ml吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000ml。

c.样品溶液的制备：

样品提取：精密取药材粉末1g，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水溶液(70∶30，V/V)5ml，高速震荡提取3min，6000r/min的转速下离心20min，过滤，取3ml滤液加PBS稀释液稀释至30ml，震摇1min，静置2min，再震摇1min，静置3min，微纤维膜过滤，备用；

样品净化：取上述滤液2ml以1滴/秒的速度缓慢通过CitriTest-HPLC免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体，再以10ml 0.05％PBS-吐温溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2-3ml空气通过柱体。准确加入2.0mL甲醇-磷酸水(70∶30，V/V)洗脱，收集洗脱液定容过滤备用。

d.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液50μL，注入液相色谱仪，测定桔青霉素含量。

(2)用液相色谱-串联质谱检测法确证中药中的桔青霉素；

a.色谱条件：流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。梯度0.01-0.60min，90％A；0.60-1.20min，90％A-5％A；1.20-2.50min，5％A；2.50-2.51min，5％A-90％A；2.51-4.00min，90％A。色谱柱为Gemini C₁₈(20mm×2.00mm，3μm)，流速为0.5ml/min。

b.质谱条件：离子源为ESI电喷雾离子源，正离子方式检测，喷射电压为5500V，雾化气60psi，帘幕气12psi，CAD(碰撞气)：15个单位，毛细管温度550℃，碰撞能量23/37eV，扫描方式为多反应监测(MRM)。

c.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液10μL，注入液相色谱-串联质谱仪，进行确证。

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