CN105866311B - 测定鸡肉中抗病毒药物残留的uplc‑ms/ms方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC‑MS/MS方法，包括QuEChERS方法进行样品前处理及样品的检测分析，所述样品前处理包括样品的提取及净化，所述样品的提取为结合态样品在酸性条件下酶解后于盐酸‑甲醇混合液中提取，所述样品的净化为经无水硫酸钠脱水后，采用C18粉、PSA粉吸附剂对提取液进行分散固相萃取净化。通过改进样品的提取、净化方法及色谱‑质谱条件，从而实现同时快速测定鸡肉中化合物性质差异大的四类12种抗病毒药物残留量，简化了操作步骤，节约了检测时间，提高了检测效率，降低了检测成本及有机溶剂使用量。

Description

测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法
技术领域
本发明涉及分析化学、食品安全领域，尤其涉及一种能测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法。
背景技术
抗病毒药物是一类用于预防和治疗病毒感染的药物，在体外可制止病毒复制酶，在动物体或感染细胞中可阻止病毒的复制或繁殖，是临床上治疗病毒病极其有效的药物。随着我国畜禽饲养集约化水平提高，传染病的发生与流行已成为阻碍我国畜禽业快速发展的重要因素，因病毒感染导致动物死亡的比率仅次于细菌感染的致死率，占36.8％，所以抗病毒药物被大量使用于畜禽产品生产中，常常导致畜禽产品抗病毒类药物残留超标现象。人体经常摄入低剂量的药物残留物，会逐渐在体内蓄积而导致部分器官病变。鉴于抗病毒药物残留的危害，抗病毒类药物已成为我国畜禽产品普查及风险监测的重点内容。
属于核苷类的阿昔洛韦、更昔洛韦、奥司他韦、扎那米韦、拉米夫定、利巴韦林，非核苷类的阿比朵尔、吗啉胍，属于三环胺类的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚及非核苷类异环胺类小分子免疫反应调节剂咪喹莫特是在畜禽饲养中常用且易被滥用的抗病毒药物。这些抗病毒药物种类繁多、性质差异较大、在动物组织中的结合形态不同，是药物多残留分析的难点。目前的检测抗病毒药物多残留的方法主要有光谱法、电位滴定法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)等，但这些方法多用于单一兽药残留检测或局限于化合物性质相同的同类抗病毒药物多残留检测。因此，有必要发明一种能同时检测差异较大多类抗病毒药物的测定方法。
液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)因具有高灵敏度和高选择性的优势，已成为复杂的动物组织样品中多类兽药残留同步检测的主流方法，中国专利(CN 105319292 A)公开了一种分析动物性食品中四类29种限用兽药残留的UPLC-MS/MS方法，能同时检测鸡肉、鸡肝、猪肉和猪肝样品中四环素类、金刚烷胺、磺胺类和喹诺酮类四类29种限用兽药。但未见同时检测核苷类、非核苷类、三环胺类及非核苷类异环胺类的相关报道。此外，已报道的方法多采用液液萃取和固相萃取柱净化，其中液液萃取存在种类有限、基质干扰大等缺点，而固相萃取小柱(SPE)净化方式存在成本高、适用范围小等缺点。而QuEChERS方法简洁、快速、稳定性高，已被普遍用于蔬菜、水果、水产品等农药、兽药残留的检测，但对易受到抗病毒药物感染的禽类检测暂无报道。
因此，有必要发明一种操作简单且能同时快速检测鸡肉中核苷类、非核苷类、三环胺类及非核苷类异环胺类四类抗病毒药物残留的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种能同时检测鸡肉中属于核苷类的阿昔洛韦、更昔洛韦、奥司他韦、扎那米韦、拉米夫定、利巴韦林，非核苷类的阿比朵尔、吗啉胍，属于三环胺类的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚及非核苷类异环胺类小分子免疫反应调节剂咪喹莫特四类12种抗病毒类药物残留的方法，同时，该方法操作简单，节约了检测时间，提高了检测效率，降低了检测成本及有机溶剂使用量。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法，包括QuEChERS方法进行样品前处理及样品的检测分析，所述样品前处理包括样品的提取及净化，所述样品的提取为结合态样品在酸性条件下酶解后于盐酸-甲醇混合液中提取，所述样品的净化为经无水硫酸钠脱水后、采用C18粉、PSA粉吸附剂对所述提取液进行分散固相萃取净化。
本发明的有益效果在于：通过改进样品的提取、净化方法及色谱-质谱条件，从而实现同时快速测定鸡肉中化合物性质差异大的四类12种抗病毒药物残留量，简化了操作步骤，节约了检测时间，提高了检测效率，降低了检测成本及有机溶剂使用量。
附图说明
图1为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标阿昔洛韦b样品MRM图；
图2为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标更昔洛韦b样品MRM图；
图3为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标扎那米韦b样品MRM图；
图4为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标拉米夫定b样品MRM图；
图5为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标阿比朵尔b样品MRM图；
图6为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标奥司他韦b样品MRM图；
图7为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标咪喹莫特b样品MRM图；
图8为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标吗啉胍b样品MRM图；
图9为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标金刚烷胺b样品MRM图；
图10为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标金刚乙胺b样品MRM图；
图11为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标利巴韦林b样品MRM图；
图12为本发明实施例中鸡肉空白样品a与加标美金刚b样品MRM图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：对QuEChERS方法进行改进，样品的提取方法为结合态样品在酸性条件下酶解后于盐酸-甲醇混合液中提取，得到提取液，样品的净化为经无水硫酸钠脱水后，采用C18粉、PSA粉吸附剂对提取液进行分散固相萃取净化，实现同时快速测定鸡肉中化合物性质差异大的四类12种抗病毒药物残留量，简化了操作步骤，节约了检测时间，提高了检测效率，降低了检测成本及有机溶剂使用量。
一种测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法，包括QuEChERS方法进行样品前处理及样品的检测分析，所述样品前处理包括样品的提取及净化，所述样品的提取为结合态样品在酸性条件下酶解后于盐酸-甲醇混合液中提取，所述样品的净化为经无水硫酸钠脱水后，采用C18粉、PSA粉吸附剂对提取液进行分散固相萃取净化。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：实现同时快速测定鸡肉中化合物性质差异大的四类12种抗病毒药物残留量，同时，该方法操作简单，节约了检测时间，提高了检测效率，降低了检测成本及有机溶剂使用量。
进一步的，所述酶解的酶解液为100μg/mL的酸性磷酸酯酶溶液。
由上述描述可知，由于检测的抗病毒药物含结合态的利巴韦林，由于利巴韦林进入体内后磷酸化成为其单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯，要检测鸡肉中利巴韦林的残留量需经酸性磷酸酯酶酶解。
进一步的，所述酸性条件为1％乙酸溶液和乙腈的混合液，所述的乙酸溶液与乙腈添加的体积比为1:4。
由上述描述可知，采用1％乙酸溶液和乙腈的混合液既可以满足酶解所需的酸性环境同时你能够沉淀样品中的蛋白质，减少干扰物。
进一步的，所述酶解在样品加入所述乙酸溶液-乙腈后超声5min后再加入所述酶解液100μL，再加盖涡旋1min于37℃恒温箱培养2h。
由上述描述可知，加入酶解液后加盖涡旋1min于37℃恒温箱培养2h，加盖涡旋有助于酶解液与样品充分混匀，恒温37℃是磷酸酯酶酶解底物的适宜温度，恒温培养2h使得结合态利巴韦林酶解更充分，提高检测结果准确性。
进一步的，所述盐酸-甲醇混合液中的盐酸浓度为0.2mol/L，所述盐酸与所述甲醇体积比为1:9，添加所述盐酸-甲醇混合液后振荡、高速冷冻离心机冷冻离心。
由上述描述可知，盐酸-甲醇能兼顾核苷类的阿昔洛韦、更昔洛韦、奥司他韦、扎那米韦、拉米夫定、利巴韦林，非核苷类的阿比朵尔、吗啉胍，属于三环胺类的主要就是金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚，以及非核苷类异环胺类小分子免疫反应调节剂咪喹莫特的提取，振荡混匀有助于提取液样品充分接触，离心操作简单且可以提高提取效率，冷冻离心是防止高速离心产生热量引起温度升高而导致抗病毒药物结构被破坏。
进一步的，所述萃取净化具体步骤为：
(1)提取液中依次加入无水硫酸钠、C18、PSA，振荡、离心、氮气浓缩；
(2)浓缩后加入体积比为4:6的40％乙腈与0.1％甲酸溶液溶解残渣，经0.22μm有机滤膜后为待测液。
由上述描述可知，无水硫酸钠为脱水剂去除提取液水分，混合吸附剂C18、PSA吸附净化去除提取液中杂质减少干扰峰的影响，氮气浓缩防止其他浓缩方法破坏抗病毒药物结构；浓缩后加40％乙腈与0.1％甲酸溶液溶解残渣，多次提取可以提高测定精确性，0.22μm有机滤膜过滤去除一些大分子杂质。
进一步的，所述UPLC-MS/MS法的色谱条件为：HILIC色谱柱为3.0mm x 100mm，7μm；流动相A为5mmol/L乙酸铵溶液-0.2％甲酸；流动相B为乙腈；流速为0.4mL/min；进样量为2μL；梯度洗脱程序为：95％流动相B洗脱0～2min、95％～75％流动相B洗脱2～4min、75％～70％流动相B洗脱4～5min、95％流动相B洗脱6～10min。
由上述描述可知，键合两性离子的HILIC柱对12种抗病毒药物的分离效果较好；用上述方法进行梯度洗脱可以兼顾12种抗病毒药物均获得较高的灵敏度和良好的峰形。
进一步的，所述UPLC-MS/MS法的质谱条件为：电喷雾正离子电离(ESI+)；多反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)为5.5KV；气帘气压力(CUR)为0.172MPa氮气；雾化气压力为0.379MPa；辅助气压力为0.379MPa；离子源温度(TEM)为500℃；碰撞电压(CE)为13-60V；去簇电压(DP)为：50-140V。
由上述描述可知，正离子模式(ESI+)下全扫描所得响应值比负离子模式高。
实施例1
1、实验原理
在酸性条件下，采用磷酸酯酶先酶解结合态的利巴韦林，然后以盐酸-甲醇混合溶液提取利巴韦林和其它抗病毒类药物，分取后加入除水剂无水硫酸钠，以C18粉、PSA粉净化杂质，超高效液相色谱-串联质谱测定，同位素内标法定量。
2、材料与方法
2.1试验材料
标准品：金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚烷、阿昔洛韦、更昔洛韦、扎那米韦、拉米夫定、阿比朵尔、奥司他韦、咪喹莫特、利巴韦林、吗啉胍以及内标物阿昔洛韦-D4、金刚烷胺-D5、美金刚-D6、利巴韦林_13C5(纯度均>98.0％，购于Sigma公司)。
试剂：乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，德国Merck公司)；乙酸乙酯、丙酮、乙酸、三氯乙酸、盐酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；酸性磷酸酯酶(Phosphatase Acid，FromWheat Germ，活力:≥0.4unit/mg)；N-丙基乙二胺键合固相吸附剂(PSA)和C18吸附剂(40μm，美国Agilent公司)；无水硫酸钠(上海纯亚化工科技发展有限公司)。
2.2试验设备
液相色谱-质谱联用仪UPLC-TripleQuad5500(AB Sciex，&Waters)；电子天平AG245(瑞士梅特勒托利多公司)；冷冻高速离心机CR22G(Himac日立公司)；多功能氮吹仪HN200(Anon海能仪器公司)；数控超声波清洗器KQ500DE(昆山市超声仪器有限公司)；调速多用振荡器HY-2(常州国华电器有限公司)；快速混匀器XK80-A(江苏新康医疗器械有限公司)；Milli-Q纯水系统(Millipore公司)；20孔真空提取装置WAT 200609(Waters公司)；有机系针头滤器(一次性)0.22μm(天津腾津实验设备有限公司)；水系针式滤器0.45μm(美瑞泰克有限公司)。
2.3标准储备液的配制
2.3.1 12种抗病毒药物标准工作曲线
(1)12种抗病毒药物标准储备液的配制
准确称取阿昔洛韦、更昔洛韦、扎那米韦、拉米夫定、阿比朵尔、奥司他韦、咪喹莫特、金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍、美金刚标准品各10mg(按实际含量折算，精确至0.0001g)，分别置100mL容量瓶中，阿昔洛韦、更昔洛韦、扎那米韦用水，剩余9种药物用甲醇溶解并以50％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，配制成0.1mg/mL的单独储备溶液；另外，准确称取内标物阿昔洛韦-D4、金刚烷胺-D5、美金刚-D6、利巴韦林_13C5标准品各10mg，分别置100mL容量瓶中，先少量水溶解，然后以50％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，配制成0.1mg/mL的内标标准储备溶液，于-18℃下保存。
(2)12种抗病毒药物混合标准中间液的配制
从12种抗病毒药物标准储备液中，分别吸取1.0mL的12种抗病毒药物标准储备液和内标储备液，用40％乙腈水定容至100mL的容量瓶中，分别配制成1.0μg/mL的混合标准中间液和混合内标标准中间液，于-18℃下保存。
(3)标准曲线的配制
准确移取适量体积的12种抗病毒药物混合标准中间液于10mL的棕色容量瓶中，用40％乙腈水配制成外标浓度分别为0、1、2、4、10、20、50ng/mL，内标浓度均为10ng/mL的标准工作溶液，现用现配。
2.3.2试剂的配制
(1)酸性磷酸酯酶溶液(100g/mL)：准确称取酸性磷酸酯酶5mg，置于50mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成100μg/mL的酶解液，放置于4℃～8℃冰箱中保存。
(2)乙酸铵缓冲溶液(5.0mmol/L)：称取乙酸铵0.385g，加入约500mL水，摇匀使其溶解，再加入2.0mL甲酸，再加水定容至1000mL。
(3)盐酸标准溶液(0.2mol/L)：准确移取18.2mL浓盐酸稀释定容1000mL，转入试剂瓶，摇匀，贴标签。
2.4液相色谱条件
色谱柱：HILIC(3.0mm x 100mm，2.7μm)；
流动相：A为5mmol/L乙酸铵溶液-0.2％甲酸；B为乙腈；
流速：0.4mL/min；柱温：30℃；进样量：2μL；
梯度洗脱程序：0～2min，95％B，2～4min，95％～75％B，4～5min，75％～70％B，6～10min 95％B。
2.5质谱条件
电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；
电喷雾电压(IS)：5.5KV；气帘气压力(CUR)：0.172MPa氮气；雾化气压力0.379MPa；辅助气压力0.379MPa；离子源温度(TEM)：500℃；定性、定量离子对(母离子与子离子)和碰撞电压(CE)及去簇电压(DP)见表1。
表1 12种抗病毒药物的主要MS/MS参数
2.6样品前处理
2.6.1样品的制备
实验所用鸡肉均为福建出入境检验检疫局日常检测样品，取约50g鸡肉样品，用玻璃棒尽量搅拌均匀，待提取用。
2.6.2样品的提取
称取5.00g样品于50.0mL塑料离心管中，再加入1.0mL乙酸溶液(1％)和4mL乙腈，超声5min后振荡混匀3.0min，再加入100μL磷酸酯酶，加盖后涡旋1min，于恒温烘箱中37℃培养2h。
取出后冷却至室温，加入内标标准工作溶液(0.1μg/mL)100μL，再加入15mL0.2mol/LHCI-甲醇(1：9)溶液，振荡混匀3.0min，于冷冻高速离心机在15000r/min下冷冻离心5min，待净化。
2.6.3样品的净化
取5.0mL提取液于试管中依次加入150mg C18、150mg PSA、200mg无水硫酸钠，轻微震荡1min，于5000r/min下离心5min，移出上清液2.0mL，在45℃下用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0mL 40％乙腈0.1％甲酸溶液(体积比4:6)溶解残渣，过0.22μm有机滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
2.6.4超高效液相色谱-串联质谱测定
将抗病毒类药物混合标准工作溶液在设定条件下分别进样，以定量离子峰面积Y为纵坐标，化合物含量(ng/mL)为横坐标X，绘制标准工作曲线。用该标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中化合物的响应值应均在仪器测定的线性范围内。
2.7方法学验证
2.7.1线性方程、线性范围、检出限、定量限
采用分散固相萃的方法，取净化后的空白样品溶液配制质量浓度分别为0、2、4、10、20、40ng/mL的12种抗病毒药物系列混合标准溶液，按2.6方法步骤进行测定。以分析物峰面积(y)对分析物质量浓度的(x)作线性回归分析，结果表明，在2-40ng/mL浓度范围内阿昔洛韦、扎那米韦、拉米夫定、阿比朵尔、奥司他韦、咪喹莫特、金刚烷胺、金刚乙胺都呈现良好的线性关系。采用空白样品添加低浓度的12种标准品，按方法规定进行前处理，然后上机测定，以3倍信噪比(S/N)作为检出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)作为定量限(LOQ)，定量离子的响应峰面积(Y轴)对相应的质量浓度(X轴，ng/mL)作图，其结果见表2。
表2 12种抗病毒药物的线性方程、相关系数、检出限与定量限及平均回收率
注：Y:峰面积；X:浓度。
2.7.2回收率和精密度
选取空白的鸡肉作为添加回收试验基质，分别进行5、10、20μg/kg的3个不同水平的加标试验，每个水平做6组平行实验，结果如表2所示，在不同加标浓度下，阿昔洛韦、更昔洛韦、扎那米韦、拉米夫定、阿比朵尔、奥司他韦、咪喹莫特、吗啉胍、金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、美金刚的平均回收率为75.3％～94.7％，相对标准偏差(RSD)为4.2％～11.4％。鸡肉空白样品a与鸡肉加标样品中目标物(b)阿昔洛韦、更昔洛韦、扎那米韦、拉米夫定、阿比朵尔、奥司他韦、咪喹莫特、吗啉胍、金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、美金刚的MRM色谱图参见图1-12，从图中可以看出整体峰形良好，杂质干扰小，符合残留检测的要求。
综上所述，本发明提供的一种测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法，通过改进样品的提取、净化方法及色谱-质谱条件，从而实现同时快速测定鸡肉中化合物性质差异大的四类12种抗病毒药物残留量，简化了操作步骤，节约了检测时间，提高了检测效率，降低了检测成本及有机溶剂使用量。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法，包括QuEChERS方法进行样品前处理及样品的检测分析，其特征在于，所述鸡肉中抗病毒药物为属于核苷类的阿昔洛韦、更昔洛韦、奥司他韦、扎那米韦、拉米夫定、利巴韦林，非核苷类的阿比朵尔、吗啉胍，属于三环胺类的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚及非核苷类异环胺类小分子免疫反应调节剂咪喹莫特四类12种抗病毒类药物；所述样品前处理包括样品的提取及净化，所述样品的提取为结合态样品在酸性条件下酶解后于盐酸-甲醇混合液中提取，所述样品的净化为经无水硫酸钠脱水后，采用C18粉、PSA粉吸附剂对提取液进行分散固相萃取净化；所述酸性条件为1％乙酸溶液和乙腈的混合液，所述的乙酸溶液与乙腈添加的体积比为1:4；所述盐酸-甲醇混合液中的盐酸浓度为0.2mol/L，所述盐酸与所述甲醇体积比为1:9，添加所述盐酸-甲醇混合液后振荡、高速冷冻离心机冷冻离心；所述UPLC-MS/MS法的色谱条件为：HILIC色谱柱为3.0mm×100mm，7μm；流动相A为5mmol/L乙酸铵溶液-0.2％甲酸；流动相B为乙腈；流速为0.4mL/min；进样量为2μL；梯度洗脱程序为：0～2min，95％流动相B，2～4min，95％～75％流动相B，4～5min，75％～70％流动相B，6～10min 95％流动相B。
2.根据权利要求1所述的测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述酶解的酶解液为100μg/mL的酸性磷酸酯酶溶液。
3.根据权利要求2所述的测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述酶解在样品加入所述乙酸溶液-乙腈后超声5min后再加入所述酶解液100μL，再加盖涡旋1min于37℃恒温箱培养2h。
4.根据权利要求1所述的测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述样品的净化具体步骤为：
(1)提取液中依次加入无水硫酸钠、C18、PSA，振荡、离心、氮气浓缩；
(2)浓缩后加入体积比为4:6的40％乙腈与0.1％甲酸溶液溶解残渣，经0.22μm有机滤膜后为待测液。
5.根据权利要求1所述的测定鸡肉中抗病毒药物残留的UPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS法的质谱条件为：电喷雾正离子电离(ESI+)；多反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)为5.5KV；气帘气压力(CUR)为0.172MPa氮气；雾化气压力为0.379MPa；辅助气压力为0.379MPa；离子源温度(TEM)为500℃；碰撞电压(CE)为13-60V；去簇电压(DP)为：50-140V。
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