CN109738559A

CN109738559A - 甲醇盐析分相提取肉类产品中喹诺酮类残留前处理方法

Info

Publication number: CN109738559A
Application number: CN201910170653.7A
Authority: CN
Inventors: 刘永明; 李桂芝; 张强; 邬旭然
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2019-03-06
Filing date: 2019-03-06
Publication date: 2019-05-10

Abstract

本发明公开甲醇盐析分相提取肉类产品中喹诺酮类残留的样品前处理方法，具体为一种测定肉类产品中喹诺酮残留的高效样品前处理方法。该前处理方法以含有0.8％甲酸的70％甲醇水溶液为提取液，加入适量磷酸氢二钾与硫酸铵盐析剂，将喹诺酮残留提取到甲醇相中实现肉类样品的高效样品前处理，样品前处理仅需20分钟，而现在通用的前处理方法，如GB/T21312‑2007推荐的方法，需要提取3次，然后再进行固相萃取柱净化，样品前处理至少需要4个小时。基于本发明的前处理技术，结合高效液相色谱方法用于肉类产品牛肉、猪肉、鱼肉中喹诺酮残留的萃取测定，回收率为81.1％‑97.7％，检出限为0.039‑0.084μg/g。

Description

甲醇盐析分相提取肉类产品中喹诺酮类残留前处理方法

技术领域

本发明涉及兽药残留分析技术领域，特别涉及肉类产品中喹诺酮类残留测定的样品前处理方法。

背景技术

喹诺酮类抗生素(quinolones，QNs)，是指具有1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸基本结构的人工合成药物。由于喹诺酮类抗生素具有抗菌谱广、使用简便、价格低廉等优点而广泛的应用于畜牧养殖业。因此动物源性食品中喹诺酮类药物的残留问题广受社会关注。有关动物源性食品中喹诺酮类药物残留检测的报道较多，主要有：高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。

肉类样品中测定痕量兽药残留时，关键步骤在于样品前处理技术，但喹诺酮类抗生素都含有氨基与羧基等强极性基团，目前，在动物性食品中提取该类药物残留时，大多采用水溶性有机溶剂乙腈作为提取剂，提取回收率较高，但提取液中的水溶性杂质(蛋白质、多肽、多糖)含量较高，需要通过固相萃取柱进一步净化与浓缩。现在通用的典型的样品前处理方法如：GB/T21312-2007推荐的方法，需要提取3次，然后再进行固相萃取柱净化、氮吹浓缩，样品前处理至少需要4个小时。因此，操作步骤多、溶剂消耗量大。

发明内容

为解决现有技术中的样品前处理过程中存在的提取效率低、净化与浓缩耗时费力、处理速度慢的问题，本发明提供了一种高效快速的提取与测定肉类产品中喹诺酮残留的样品前处理方法。

为实现上述发明目的，提供技术方案如下：

一种测定肉类产品中喹诺酮残留的高效样品前处理方法，包括如下步骤：

准确称取2.0g匀浆后的肉类样品于20mL聚四氟乙烯离心管中，加入10.0mL含有甲酸的甲醇水溶液，涡旋振荡2min，加入磷酸氢二钾与硫酸铵，涡旋2min，静置至形成上相后，取上清液1.0mL于10mL聚四氟乙烯管中，加入N-丙基乙二胺固相吸附剂(PSA)和C₁₈吸附剂后，涡旋，按照5000r/min速度离心后取上清液过0.45μm滤膜，得供试溶液；

其中，

所述甲酸浓度为0.6-1.2％(体积浓度)，所述甲醇水溶液中甲醇浓度为60-80％(体积浓度)；

所述磷酸氢二钾为(0.2-0.4)g/mL，所述硫酸铵为(0.05-0.1)g/mL；

所述PSA为(15-25)mg/mL，所述C₁₈吸附剂为(5-15)mg/mL。

进一步的，所述喹诺酮为依诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、加替沙星。

进一步的，所述肉类样品为牛肉、猪肉、鱼肉及其它含蛋白质的肉类样品。

甲醇是常见有机溶剂中极性最强的溶剂，对喹诺酮具有较好的溶解性，但甲醇的盐析分相作用目前为止尚未见文献报道，本发明利用适量磷酸氢二钾与硫酸铵作为盐析剂，实现了体积分数为20％-85％甲醇水溶液的盐析分相。本发明的试验发现：喹诺酮类药物与蛋白质之间存在较强的结合作用，当提取液甲醇的浓度为60-80％时，样品中的主要基质蛋白质发生缓慢且完全的变性，有利于药物的离解，从而提高提取效率；同时本发明所用的混合盐析剂中的硫酸铵也能促进蛋白质的沉淀于变性，利于样品中目标物质的高效提取；将该盐析分相体系用于肉类产品中喹诺酮类抗生素残留的提取，提取液中加入少量PSA硅胶粉末(N-丙基乙二胺修饰)和C₁₈粉末便可实现提取液的净化，净化后的样品即可进行HPLC测定，样品前处理可在20min内完成。本发明提出的样品前处理技术新颖、快速、高效。

本发明具有下列优点：

1.本发明通过盐析剂种类及加入量的选择实现了甲醇与水的盐析分相作用，实现了喹诺酮药物的高效盐析萃取，而现有技术的方法没有采用甲醇盐析分相作用。

2.60％-80％的甲醇水溶液作为提取剂时，蛋白质基质发生缓慢且彻底变性，释放与其结合的药物残留，因而实现药物残留的高效提取。

3.与通用的典型样品前处理方法如：GB/T21312-2007推荐的方法，用EDTA酸性缓冲水溶液作为提取液相比较，甲醇盐析分相萃取体系的上相萃取液中氨基酸、多肽、蛋白质等水溶性杂质含量较低，可以在萃取液中加入PSA和C₁₈直接净化，大大简化了净化步骤。

本发明提出的样品前处理方法简单、步骤少，因此，样品前处理过程中可能引起的目标物质损失和污染少，测定结果精密、准确，样品前处理时间大大减少。

附图说明

图1为最佳甲醇的回收率与体积百分数关系示意图。

图2为牛肉空白样品液相色谱图。

图3为实施例1牛肉样品加标液相色谱图(加标量0.2μg/mL)，

其中，1-ENX、2-OFL、3-CIP、4-ENR、5-GAT。

具体实施方式

样品中喹诺酮药物残留的预处理提取与测定方法

样品中喹诺酮药物残留的预处理提取与测定方法，包括如下步骤：

1)样品前处理具体步骤

对匀浆后的肉类样品于20mL聚四氟乙烯离心管中，加入10.0mL含有甲酸的甲醇水溶液，涡旋振荡2min，加入K₂HPO₄与硫酸铵，涡旋2min，静置至形成上相，取上清液1.0mL于10mL聚四氟乙烯管中，加入PSA和C₁₈后，涡旋，按照5000r/min速度离心后取上清液过0.45μm滤膜，得供试溶液，所述供试溶液用进样器注射于液相色谱进行喹诺酮残留含量测定；

其中，

所述磷酸氢二钾为(0.2-0.4)g/mL，所述硫酸铵为(0.05-0.1)g/mL；

所述PSA硅胶粉末为(15-25)mg/mL，所述C₁₈粉末为(5-15)mg/mL；

称样重量为2.0g；

2)液相色谱测定条件、校准曲线与样品中喹诺酮残留含量测定

2.1)仪器测定条件：

液相色谱柱为反相C18柱(Agilent,250mm×4.6mm,5.0μm粒径)；流动相为乙腈-0.05mol/L柠檬酸水溶液(15:85)；流速1.0mL/min；检测波长280nm；柱温箱温度25℃；进样量20μL。

2.2)线性方程的建立与检出限的确定：

配制系列浓度的混合喹诺酮标准溶液(溶液中每种喹诺酮的含量分别为0.05、0.10、0.25、1.00、5.00μg/mL)，将标准溶液用液相色谱进行测定得到系列喹诺酮浓度相对应的系列峰面积，通过最小二乘法计算得到定量标准曲线；标准溶液逐级稀释测定了检出限LODs，如表1所示，标准曲线线性范围在0.05-5μg/mL，标准曲线的线性相关系数(R²)大于0.99；

表1喹诺酮类药物的线性关系相关系数保留时间及检出限

其中，线性方程中y表示液相色谱仪测定的样品中喹诺酮对应的色谱峰面积，x表示供试溶液中喹诺酮浓度μg/mL；

2.3)肉类样品中喹诺酮残留含量测定：

将步骤1)的供试溶液用注射器注入液相色谱仪进行分离测定得到供试液中喹诺酮对应的色谱峰面积，将色谱峰面积(y值)带入表1的线性方程计算供试溶液的喹诺酮浓度(x值)，肉类样品中喹诺酮的含量计算公式为：

样品中喹诺酮含量(μg·g^-1)＝供试溶液的喹诺酮浓度(μg·mL^-1)×上相体积(mL)/称样重量(g)。

其中，体积含量为60％、70％、80％的所述甲醇溶液盐析分相后，上相体积分别为7.75mL、8.70mL、9.01mL。

甲醇体积浓度与上相体积关系的确定

1)取浓度为20-85％(体积浓度)的甲醇水溶液，然后添加甲酸至甲酸浓度为0.8％(体积浓度)，得待测甲醇水溶液；

2)取10mL待测甲醇水溶液，加入2-4g磷酸氢二钾与1g硫酸铵盐析分相，分别按照30％、40％、50％、60％、70％、80％体积分数将待测甲醇水溶液盐析分相，测量上相体积分别为2.97mL、6.42mL、6.88mL、7.75mL、8.70mL、9.01mL。

提取时最佳甲醇体积百分浓度的确定

准确称取若干份2.0g匀浆后的肉类样品于20mL聚四氟乙烯离心管中，分别加入10.0mL含有0.8％(体积浓度)甲酸的30％、40％、50％、60％、70％、80％(体积浓度)甲醇水溶液，涡旋振荡2min，加入2-4g的K₂HPO₄与1g的硫酸铵，涡旋2min，静置至盐析作用形成上相后，取上清液1.0mL于10mL聚四氟乙烯管中，加入20mgPSA和10mgC₁₈，涡旋，离心(5000r/min)，取上清液过0.45μm滤膜，供液相分析，计算回收率与体积百分数，如图1所示，图1表明甲醇体积分数为60-80％时为最佳提取体积浓度。

以下具体实施例按照上述对肉类产品中喹诺酮药物残留的预处理提取与测定方法操作完成对喹诺酮药物残留的测定。

实施例1对牛肉中喹诺酮药物残留的预处理提取与测定

取经过均质处理的牛肉样品，准确称取9份2.0g样品于分别放置于9个20mL聚四氟乙烯管中，分别加入0.2、0.5、1.0μg·g^-1三个浓度水平的混合喹诺酮标准溶液，为了得到方法的精密度(RSD％)，每个添加浓度水平都做3个平行实验(n＝3)，进行加标回收实验。

将上述9份样品中分别加入10.0mL含有甲酸的甲醇水溶液，涡旋振荡2min，加入K₂HPO₄与硫酸铵，涡旋2min，静置至形成上相，取上清液1.0mL于10mL聚四氟乙烯管中，加入PSA和C₁₈后，涡旋，按照5000r/min速度离心后取上清液过0.45μm滤膜，得供试溶液；

其中，

所述甲酸浓度为0.8％(体积含量)，所述甲醇水溶液中甲醇浓度为70％(体积含量)；所述磷酸氢二钾为0.4g/mL，所述硫酸铵为0.1g/mL；所述PSA硅胶粉末为20mg/mL，所述C₁₈粉末为10mg/mL。

液相色谱测定条件同上所述，将得到的供试溶液用注射器进样到液相色谱中进行测定得到色谱峰面积y值并代入表1中的标准曲线计算供试液中的各喹诺酮浓度x值，再将x值代入肉类样品中喹诺酮的含量计算公式计算出样品中喹诺酮的含量，测定结果如表2所示。

表2牛肉样品加标回收率、精密度(n＝3)

实验结果表明，在本发明的实验实验条件下，回收率范围为81.2％-97.3％，相对标准偏差为1.1％-3.9％，表明本发明的方法具有较好的精密度和准确度，牛肉空白谱图见图2，说明本发明的样品前处理方法，具有较好的净化性能，在喹诺酮的色谱峰出峰位置杂质含量足够低，可以满足实际测定的要求。样品加标谱图见3，说明液相色谱分离条件较好，所有的喹诺酮药物残留都得到完全分离，峰形对称，且与样品中的杂质得到了较好的分离。

对照例

为了检验本发明预处理方法的可靠性，采用GB/T21312-2007所述的方法对牛肉样品进行了样品前处理与测定。

取6份各5g与实施例1相同的牛肉分别放置于6个20mL聚四氟乙烯管中，分别加入0.2、0.5μg·g^-1两个浓度水平的混合喹诺酮标准溶液，为了得到方法的精密度(RSD％)，每个添加浓度水平都做3个平行实验(n＝3)，进行加标回收实验。

1)提取：将50mL0.1mol/L的EDTA-Mellvaine缓冲溶液(pH＝4.0)分成3份，然后依次加入到同一样品中涡旋1min，离心沉淀5min取上清液，同一样品重复3次，合并提取上清液；

2)净化：首先分别用6mL甲醇与6mL纯水活化HLB净化柱(200mg，6mL)，将提取液过柱，弃去滤液，用2mL5％甲醇水溶液淋洗、抽干，再用6mL甲醇洗脱并收集，氮气吹干，用一毫升流动相溶解得到的供试溶液；

3)测定：取步骤2)得到的供试溶液，用注射器进样到液相色谱中进行测定，测定的色谱条件与实施例1完全一致，测定方法步骤同实施例1相同操作，得到色谱峰面积y值后代入表1中的标准曲线计算供试液中的各喹诺酮浓度x值。样品中喹诺酮含量(μg·g^-1)＝供试溶液的喹诺酮浓度(μg·mL^-1)×供试液体积(mL)/称样量(g)，测定结果如表3。

表3对照例(GB/T21312-2007)加标回收率、精密度(n＝3)

与对照例相比，实施例1的测定结果表明本发明提供的样品前处理方法在回收率与精密度方面与国标方法基本一致，即本发明提供的样品前处理方法是可靠的。

但是，由于GB/T21312-2007推荐的方法需要对同一样品提取3次，而且需要复杂的固相萃取柱净化与氮吹浓缩，因此，国标法处理样品的时间约为4个小时，而本发明提供的前处理方法步骤少、提取效率高。本发明的优势在于测定前的预处理方法，进一步研究发现，本发明的预处理方法喹诺酮药物残留都得到完全分离的原因在于当甲醇的体积百分数小于60％时蛋白质不能变性，喹诺酮药物的提取回收率较低，而甲醇的体积百分数大于80％时蛋白质沉淀太快，聚集在一起也不利于喹诺酮的提取，体积分数为70％的甲醇水溶液作为提取液可以使肉类产品中的蛋白质基质发生缓慢而彻底地变性，有利于释放与蛋白质结合的药物，盐析作用形成的上相甲醇中水溶性蛋白等杂质较少，样品净化步骤大大简化，在甲醇相中加入少量PSA(N-丙基乙二胺修饰的硅胶)与C₁₈(碳十八修饰的硅胶)固体吸附剂即可实现快速净化，进而使得样品前处理仅需20分钟。

实施例2对鱼肉中喹诺酮药物残留的预处理提取与测定

鱼肉样品经过均质处理后，准确称取6份2.0g样品置于6个20mL聚四氟乙烯管中，分别加入0.2、0.5μg·g^-1两个浓度水平的加标回收实验。为了得到方法的精密度(RSD％)，每个添加浓度水平都做3个平行实验(n＝3)。

然后，加入10.0mL含有0.6％甲酸的80％(V/V)甲醇水溶液进行提取，操作同实施例1，涡旋振荡2min，加入K₂HPO₄与硫酸铵，涡旋2min，静置至形成上相，取上清液1.0mL于10mL聚四氟乙烯管中，加入PSA和C₁₈后，涡旋，按照5000r/min速度离心后取上清液过0.45μm滤膜，得供试溶液；

其中，所述磷酸氢二钾为0.4g/mL，所述硫酸铵为0.1g/mL；所述PSA硅胶粉末为20mg/mL，所述C₁₈粉末为10mg/mL。

色谱条件与实施例1完全一致，测定方法步骤同实施例1，标准曲线计算测定结果如表4所示。

表4鱼肉样品加标回收率、精密度(n＝3)

结果表明，回收率范围为84.6％-97.7％，相对标准偏差为1.2％-4.6％，表明该方法具有较好的精密度和准确度。

Claims

1.一种测定肉类产品中喹诺酮残留的高效样品前处理方法，其特征在于包括如下步骤：

准确称取2.0g匀浆后的肉类样品于20mL聚四氟乙烯离心管中，加入10.0mL含有甲酸的甲醇水溶液，涡旋振荡2min，加入K₂HPO₄与硫酸铵，涡旋2min，静置至形成上相后，取上清液1.0mL于10mL聚四氟乙烯管中，加入N-丙基乙二胺固相吸附剂和C₁₈吸附剂后，涡旋，按照5000r/min速度离心后取上清液过0.45μm滤膜，得供试溶液；

其中，

所述磷酸氢二钾为(0.2-0.4)g/mL，所述硫酸铵为(0.05-0.1)g/mL；

所述N-丙基乙二胺固相吸附剂为(15-25)mg/mL，所述C₁₈吸附剂为(5-15)mg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种测定肉类产品中喹诺酮残留的高效样品前处理方法，其特征在于测定的所述喹诺酮为依诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、加替沙星。

3.根据权利要求1所述的一种测定肉类产品中喹诺酮残留的高效样品前处理方法，其特征在于肉类样品为牛肉、猪肉、鱼肉及其它含蛋白质的肉类样品。