CN109030678B

CN109030678B - 一种东北苦菜中5种化学成分的含量测定方法

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Publication number: CN109030678B
Application number: CN201810789311.9A
Authority: CN
Inventors: 何俊; 姚广哲; 欧阳慧子; 常艳旭; 马文娟; 贾琪; 沈家圆
Original assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: CN109030678A

Abstract

本发明实施例提供了一种东北苦菜中5种化学成分的含量测定方法，所述化学成分包括绿原酸、异槲皮苷、木犀草苷、木犀草素及咖啡酸；所述方法包括：(1)建立5种化学成分的标准曲线；(2)获得供试品溶液的超高效液相色谱图；(3)确定供试品中5种化学成分含量。本发明采用超高效液相色谱法，同时检测东北苦菜中5种化学成分的含量，具有简单快速、稳定性强、精密度高、重现性好的特点，为东北苦菜的质量控制提供依据。

Description

一种东北苦菜中5种化学成分的含量测定方法

技术领域

本发明涉及化学成分的含量测定方法技术领域，特别是涉及一种东北苦菜中5种化学成分的含量测定方法。

背景技术

东北苦菜为菊科苦苣菜属植物变色苦菜Ixeris vesicolor DC.的干燥全草。在《中国植物志》、《吉林省药品标准》(1977年版)中均有所收载。在吉林省食品药品监督管理局2015年第20号公告中，将《吉林省药品标准》1977版中的北败酱(菊科植物变色苦菜Ixeris vesicolor DC.中华苦菜Ixeris chinensis Thund.Nakai的干燥全草)修订为东北苦菜(菊科植物变色苦菜 Ixeris vesicolor DC.的干燥全草)。苦苣菜属植物，性味苦寒，功能清解热毒、消痈排脓，凉血止血，活血化瘀，保肝利胆，利尿消肿等，常用于急性细菌性痢疾、黄疸、肠炎、血淋、急慢性咽喉炎、各种出血等症。

现阶段对于东北苦菜的质量控制方面研究并不全面，含量测定仅有绿原酸有相关报道；东北苦菜中含有黄酮类、有机酸类、多糖类、氨基酸类及挥发油类等多种成分，仅控制一个成分并不能有效地对其进行质量控制，因此需要一种更加可信、更加全面的质量控制方法，为东北苦菜的质量控制提供依据。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种东北苦菜中5种化学成分的含量测定方法。具体技术方案如下：

本发明提供了一种东北苦菜中5种化学成分的含量测定方法，所述化学成分包括绿原酸、异槲皮苷、木犀草苷、木犀草素及咖啡酸；所述方法包括：

(1)建立5种化学成分的标准曲线；

分别精密称取绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、木犀草苷及木犀草素对照品，用第一溶剂溶解，制成具有已知浓度的各对照品储备液；

分别精密吸取5种对照品储备液并将其混合，配制成具有已知浓度的5种化学成分的混合对照品储备液；

用第二溶剂将所述混合对照品储备液稀释成一系列分别具有不同已知浓度的5种化学成分的混合对照品溶液；

在相同的预设色谱条件下，将体积V₁的各浓度的混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，获得各浓度混合对照品溶液的超高效液相色谱图；

以各混合对照品溶液的超高效液相色谱图中各化学成分的色谱峰峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；

(2)获得供试品溶液的超高效液相色谱图

将质量为M的东北苦菜供试品，用体积V₂的第三溶剂进行超声提取，离心后取上清液即为供试品溶液；

在与以上(1)步骤中相同的预设色谱条件下，取体积V₁供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，获得供试品溶液的超高效液相色谱图；

(3)确定供试品中5种化学成分含量

根据供试品溶液超高效液相色谱图中5种化学成分各自的色谱峰峰面积，和已建立的各化学成分的标准曲线，分别读出5种化学成分各自的浓度C₁，并按照下列公式分别计算出供试品中5种化学成分含量；

其中，所述预设的色谱条件包括：

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；流动相：A相为0.01％～1％磷酸-水，B相为乙腈；梯度洗脱；

所述第一溶剂、第二溶剂及第三溶剂分别独立地选自甲醇水溶液或甲醇。

在本发明的一些实施方式中，在步骤(1)中，用第二溶剂将所述混合对照品储备液稀释成3～8个具有不同已知浓度的5种化学成分的混合对照品溶液，在所得的各混合对照品溶液中，绿原酸的浓度为1～125μg/mL、咖啡酸的浓度为0.4～50μg/mL、异槲皮苷的浓度为1～125μg/mL、木犀草苷的浓度为0.8～100μg/mL、木犀草素的浓度为0.4～50μg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述东北苦菜供试品的质量M与第三溶剂的体积V₂的比值为(1：80～120)g/mL。

在本发明的一些实施方式中，流动相中A相为0.05％～0.5％磷酸-水。

在本发明的一些实施方式中，流动相中A相为0.1％磷酸-水。

在本发明的一些实施方式中，所述预设的色谱条件还包括：柱温：30～40℃，优选为35℃；流速：0.05～0.15mL/分钟，优选为0.1mL/分钟；进样量： 1.5～2.5μL，优选为2μL；检测波长：0-15分钟为327nm，15-50分钟为360 nm。

在本发明的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：A相占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而减少，0–8分钟，90％–81.5％；8–20分钟，81.5％–81.3％；20–25分钟，81.3％–81.3％；25–35分钟，81.3％–60％；35–40 分钟，60％–40％；40–50分钟，40％–25％。

在本发明的一些实施方式中，所述第一溶剂、第二溶剂及第三溶剂均为甲醇。

在本发明的另一些实施方式中，所述第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂分别为体积分数不低于85％的甲醇水溶液。

本发明实施例提供了一种东北苦菜化学成分的含量测定方法，可以同时检测东北苦菜中5种化学成分，具有简单快速、稳定性强、精密度高、重现性好的特点，为东北苦菜的质量控制提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为供试品溶液和混合对照品溶液的超高效液相色谱图，其中(A)图为供试品溶液色谱图；(B)图为混合对照品溶液色谱图；图中1代表绿原酸；2代表咖啡酸；3代表异槲皮苷；4代表木犀草苷；5代表木犀草素。

具体实施方式

本发明采用超高效液相色谱法可以同时测定东北苦菜5种化学成分的含量。在进行超高效液相色谱测试时，色谱条件如下：色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；流动相：A相为0.01％～1％磷酸-水，优选为0.05％～0.5％磷酸-水，更优选为0.1％磷酸-水；B相为乙腈；梯度洗脱；其中，梯度洗脱优选为A相占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而减少，0–8分钟， 90％–81.5％；8–20分钟，81.5％–81.3％；20–25分钟，81.3％–81.3％；25–35分钟， 81.3％–60％；35–40分钟，60％–40％；40–50分钟，40％–25％。发明人意外地发现采用如上色谱条件能够非常简单、方便、准确地测定东北苦菜5种化学成分的含量，并且在该色谱条件下，检测的重现性非常好，这确保了本发明的方法能够准确地测定各种东北苦菜5种化学成分的含量。对于其他更为具体的色谱条件，可以由本领域技术人员根据实验需要进行确定，例如，柱温：30～40℃，优选为35℃；流速：0.05～0.15mL/分钟，优选为0.1mL/ 分钟；进样量：1.5～2.5μL，优选为2μL；检测波长：0-15分钟为327nm， 15-50分钟为360nm。

发明人在实验的过程中意外地发现，在混合对照品溶液中，当绿原酸的浓度为1～125μg/mL、咖啡酸的浓度为0.4～50μg/mL、异槲皮苷的浓度为1～125 μg/mL、木犀草苷的浓度为0.8～100μg/mL、木犀草素的浓度为0.4～50μg/mL 时，尤其是5种化学成分在各混合对照品溶液中的浓度是相对均匀分布的情况下，进行线性回归所得到的回归方程的线性关系更好，在本发明中，以上各化学成分的浓度范围称为各化学成分的线性范围。

在制备供试品溶液时，发明人意外地发现，当东北苦菜供试品的质量 M与第三溶剂的体积V₂的比值为(1：80～120)g/mL时，能够确保东北苦菜中各化学成分都能够充分溶解在第三溶剂中，且各化学成分在供试品溶液中的浓度落入各成分的线性范围中。

需要说明的是，本发明所述的第一溶剂、第二溶剂、第三溶剂分别独立地选自甲醇或甲醇水溶液，优选地，所述第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂选用相同的组分和浓度。

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、仪器和试剂

仪器：仪器：Agilent 1290型超高效液相色谱仪(Agilent公司)。

试剂：乙腈、甲醇为色谱纯(Fisher公司)

对照品：

绿原酸(批号：MUST-18030620)，成都曼斯特生物科技有限公司。

异槲皮苷(批号：MUST-17051005)，成都曼斯特生物科技有限公司。

木犀草苷(批号：MUST-17121210)，成都曼斯特生物科技有限公司。

木犀草素(批号：MUST-17102605)，成都曼斯特生物科技有限公司。

咖啡酸(批号：110885-200102)，中国食品药品检定研究院。

供试品：

东北苦菜采自吉林省不同地区，经干燥后获得水分含量为7-8％的东北苦菜样品，粉碎，过三号筛，4℃保存于天津中医药大学中药研究院。

本发明中所提及的术语“精密称取”：系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。“精密吸取”：系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该计量器具的精确度要求。

2、确定色谱条件

色谱柱：CORTECS

C18柱(2.1×150mm,1.6μm)；流动相：A相为0.1％磷酸水，B相为乙腈；流速：0.1mL/min；柱温：35℃；进样量：2μL；检测波长为0～15min，327nm；15～50min，360nm。

梯度洗脱，A相占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而减少，具体程序为：0–8分钟，90％–81.5％；8–20分钟，81.5％–81.3％；20–25 分钟，81.3％–81.3％；25–35分钟，81.3％–60％；35–40分钟，60％–40％；40–50 分钟，40％–25％。

3、对照品储备液制备

分别精密称取绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、木犀草苷、木犀草素对照品各 5mg，甲醇作为第一溶剂分别溶解所述5种对照品，并定容于5mL容量瓶中，配制成1mg/mL的对照品储备液，于4℃储存备用。

上述的对照品储备液的制备虽然具体说明了各对照品的用量、且采用甲醇溶解，但需要说明的是，上述的对照品储备液的制备过程只是代表一个优选的实施例，不应构成对本发明技术方案的限制。在实际对照品储备液的制备中，所述第一溶剂可以为甲醇，也可以为甲醇的水溶液，本领域技术人员可以根据实际情况来选择各对照品的量、第一溶剂的种类、体积分数以及用量，例如选择1～10mg的各对照品，在1～10mL容量瓶中定容。甲醇水溶液的体积分数可以是85～100％，这是合理的，可以实现本发明的技术方案，但是，在实际对照品储备液的制备中，除采用甲醇外，还可以优选采用体积分数为90％的甲醇水溶液。

4、混合对照品溶液制备

分别精密吸取绿原酸储备液625μL、咖啡酸储备液250μL、异槲皮苷储备液625μL、木犀草苷储备液500μL、木犀草素储备液250μL，混合，甲醇作为第二溶剂定容至5mL，制得混合对照品储备液；其中绿原酸浓度为 125μg/mL、咖啡酸浓度为50μg/mL、异槲皮苷浓度为125μg/mL，木犀草苷浓度为100μg/mL、木犀草素浓度为50μg/mL；并将所述混合对照品储备液作为混合对照品溶液7，简称标7。

精密吸取标7的2mL于另一5mL容量瓶中，用甲醇定容后，作为混合对照品溶液6，简称为标6。

精密吸取标6的2.5mL于另一5mL容量瓶中，用甲醇定容后，作为混合对照品溶液5，简称为标5。

精密吸取标5的2mL于另一5mL容量瓶中，用甲醇定容后，作为混合对照品溶液4，简称为标4。

精密吸取标4的2.5mL于另一5mL容量瓶中，用甲醇定容后，作为混合对照品溶液3，简称为标3。

精密吸取标3的2.5mL于另一5mL容量瓶中，用甲醇定容后，作为混合对照品溶液2，简称为标2。

精密吸取标2的2mL于另一5mL容量瓶中，用甲醇定容后，作为混合对照品溶液1，简称为标1。

需要说明的是，除了可以采用上述的方法将混合对照品储备液稀释成一系列具有不同已知浓度的混合对照品溶液，还可以采用其它的方法，例如采用本领域常用的倍比稀释法等。所述第二溶剂可以为甲醇，也可以是含量不低于85％的甲醇水溶液，优选90％的甲醇水溶液。

5、建立5种化学成分的标准曲线

在确定的相同色谱条件下，取标1～标7的混合对照品溶液2μL，分别注入超高效液相色谱仪中，获得各混合对照品溶液的超高效液相色谱图，其中，标7的超高效液相色谱图如图1中(B)图所示；

需要说明的是，混合对照品溶液的体积V₁具体值可以由本领域技术人员根据超高效液相色谱仪的要求及实验结果确定，本发明在此不作具体限定。

根据标1～标7的混合对照品溶液的超高效液相色谱图中各化学成分的峰面积(Y)为纵坐标，以标1～标7的混合对照品溶液中各化学成分的浓度(X) 为横坐标，建立5种化学成分的浓度-峰面积标准曲线；以信噪比S/N为3：1 对应的浓度作为其检测限(LLOD)，S/N为10：1所对应的浓度作为其定量限 (LLOQ)，以获得各化学成分的线性关系与范围，结果如下表1。

表1 5种化合物的标准曲线、LLOD和LLOQ

6、供试品溶液的制备

精密称取东北苦菜供试品100mg，甲醇作为第三溶剂溶解，超声处理(功率250W，频率50KHz)30分钟，放至室温后定容于10mL容量瓶中得供试品混合液。摇匀后取1mL该混合液，14000r/min离心10min，取上清液，过滤(0.22μm的微孔滤膜)，作为供试品溶液。

上述的供试品溶液的制备虽然具体说明了东北苦菜供试品的质量M 与第三溶剂的体积V₂等，但需要说明的是，上述的供试品溶液的制备只是代表一个优选的实施例，不应构成对本发明技术方案的限制。在实际供试品溶液的制备中，第三溶剂的体积V₂只要能够满足可以充分溶解质量 M的东北苦菜供试品中各化学成分即可，例如东北苦菜供试品的质量M与第三溶剂的体积V₂的比值为(1：80～120)g/mL。第三溶剂可以是甲醇，也可以是含量不低于85％的甲醇水溶液，优选90％的甲醇水溶液，所述第三溶剂的选择需满足能够完全溶解不同种类的东北苦菜供试品。

7、不同供试品中5种化学成分含量的测定

在前述确定的色谱条件下，精密吸取供试品溶液2μL注入超高效液相色谱仪中，获得供试品溶液的超高效液相色谱图；供试品溶液3的色谱图如图1 中(A)图所示。

根据供试品溶液超高效液相色谱图中5种化学成分各自的色谱峰峰面积，根据已建立的5种化学成分的标准曲线，分别读出5种化学成分各自的浓度C₁，并按照下列公式分别计算出供试品中5种化学成分含量。

将来自不同地区的东北苦菜供试品分别按前述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每种供试品平行操作3次，在前述确定的色谱条件下进行超高效液相色谱(UPLC)分析，用外标法计算各指标成分含量。具体结果如表2 所示。

表2不同产地东北苦菜中5种成分的含量(n＝3)

日内精密度测试

按上述供试品溶液的制备方法制备样品3的东北苦菜供试品溶液，用前述确定的色谱条件进行超高效液相色谱分析，重复进样6次，测得各色谱峰峰面积，计算其相对标准偏差(RSD)值。结果见表3。

表3东北苦菜5种成分日内精密度(n＝6)

日间精密度测试

按上述供试品溶液的制备方法制备样品3的东北苦菜供试品溶液，用前述确定的色谱条件进行超高效液相色谱分析，连续进样三天，每天进样2次，测得各色谱峰峰面积，计算其RSD值。结果见表4。

表4东北苦菜5种成分日间精密度(n＝6)

重复性试验

精密称取样品3的东北苦菜供试品6份，每份100mg，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，用前述确定的色谱条件进行超高效液相色谱分析，记录各成分峰面积，计算其RSD值，结果见表5。

表5东北苦菜5种成分重复性(n＝6)

稳定性试验

按上述供试品溶液的制备方法制备样品3的东北苦菜供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8、12小时进样2μL，用前述确定的色谱条件进行超高效液相色谱分析，记录5种成分的峰面积，计算其RSD值，以考察供试品溶液室温放置稳定性，结果见表6，结果表明样品中5种成分在室温放置12小时的条件下均稳定。

表6东北苦菜5种成分室温放置12h稳定性(n＝6)

加样回收率试验

精密称取样品3的东北苦菜供试品0.05g，置于10mL容量瓶中，分别加入前述对照品储备液(绿原酸储备液110μL、咖啡酸储备液5.0μL、异槲皮苷储备液20μL、木犀草苷储备液150μL、木犀草素储备液5μL)，甲醇作为第三溶剂溶解，超声处理(功率250W，频率50KHz)30分钟，放至室温后定容于10mL容量瓶中得供试品混合液。摇匀后取1mL该混合液，14000r/min 离心10min，取上清液，过滤(0.22μm的微孔滤膜)，作为加样供试品溶液。平行操作6次，得6份加样供试品溶液。

取上述6份加样供试品溶液，用上述色谱条件进行UPLC分析，计算加样回收率平均值及RSD。结果见下表7。回收率＝(测得值-初始值)/加入值×100％

表7东北苦菜5种成分加样回收率(n＝6)

从上述结果可以看出，本发明采用超高效液相色谱法同时测定东北苦菜中 5种化学成分的含量，具有简单快速、稳定性强、精密度高、重现性好的特点，通过测定东北苦菜中5种化学成分的含量，可以为东北苦菜的质量控制提供依据。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种东北苦菜中5种化学成分的含量测定方法，所述化学成分包括绿原酸、异槲皮苷、木犀草苷、木犀草素及咖啡酸；所述方法包括：

（1）建立5种化学成分的标准曲线；

用第二溶剂将所述混合对照品储备液稀释成3~8个具有不同已知浓度的5种化学成分的混合对照品溶液，在所得的各混合对照品溶液中，绿原酸的浓度为1~125 μg/mL、咖啡酸的浓度为0.4~50 μg/mL、异槲皮苷的浓度为1~125 μg/mL、木犀草苷的浓度为0.8~100 μg/mL、木犀草素的浓度为0.4~50 μg/mL；

（2）获得供试品溶液的超高效液相色谱图；

在与以上（1）步骤中相同的预设色谱条件下，取体积V₁供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，获得供试品溶液的超高效液相色谱图；

（3）确定供试品中5种化学成分含量；

其中，所述预设的色谱条件包括：

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；流动相：A相为0.01%~1%磷酸-水，B相为乙腈；梯度洗脱；柱温：30~40℃；流速：0.05~0.15 mL/分钟；进样量：1.5~2.5 μL；检测波长：0-15分钟为327nm，15-50分钟为360nm；

所述梯度洗脱具体为：A相占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而减少，0–8分钟，90%–81.5%；8–20分钟，81.5%–81.3%；20–25分钟，81.3%–81.3%；25–35分钟，81.3%–60%；35–40分钟，60%–40%；40–50分钟，40%–25%；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述东北苦菜供试品的质量M与第三溶剂的体积V₂的比值为1：80~120g/mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相中A相为0.05%~0.5%磷酸-水。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，流动相中A相为0.1%磷酸-水。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱温：35℃；流速：0.1 mL/分钟；进样量：2 μL。

6.如权利要求1-5中的任一项所述的方法，其特征在于，所述第一溶剂、第二溶剂及第三溶剂均为甲醇。

7.如权利要求1-5中的任一项所述的方法，其特征在于，所述第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂分别为体积分数不低于85%的甲醇水溶液。